孫賀，李展

骨肉瘤是發(fā)生于骨組織的惡性腫瘤，其具有惡性程度高及早期轉(zhuǎn)移等特點，早期化療對控制疾病進(jìn)展具有重要意義，但部分患者易產(chǎn)生化療耐藥性從而降低治療效果［1-2］。目前關(guān)于骨肉瘤細(xì)胞化療抵抗產(chǎn)生機制尚未完全闡明，研究表明骨肉瘤患者圍手術(shù)期應(yīng)用的麻醉藥物對癌細(xì)胞增殖、遷移等具有重要調(diào)控作用［3］。研究表明利多卡因（lidocaine）可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞生長［4］。利多卡因還可抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［5］。但利多卡因?qū)侨饬黾?xì)胞的研究尚未可知。近來研究報道指出miRNA 可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為，以miRNA 為靶點可作為化療干預(yù)的重要手段，其中miR-195 在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低，并可增強細(xì)胞化療敏感性［6］。miR-195 可靶向調(diào)控RAF1 表達(dá)抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)展［7］。關(guān)于miR-195 對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為及化療敏感性的研究尚未見報道。本研究于2018年5—12月探究利多卡因是否可通過調(diào)控miR-195 影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑利多卡因購自宜昌人福藥業(yè)公司；骨肉瘤MG63細(xì)胞購自美國ATCC公司。胎牛血清與RPMI 1640 培養(yǎng)基均購自美國Gibco 公司；Trizol、SYBR Green 核酸熒光染料、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa 公司；MTT 與二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒均購自美國Sigma 公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自大連美侖生物公司；cyclinD1、Cleaved Caspase-3 抗體均購自美國Abcam 公司；山羊抗兔IgG 抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000 購自Thermo Scientific 公司；miR-195 模擬物（miR-195 mimics）、陰性對照mimic NC 序列（miR-con）、陰性對照序列（anti-miRcon）、miR-195 抑制物（anti-miR-195）均購自山東維真生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗處理與分組 RPMI 1640 培養(yǎng)基+10%

胎牛血清培養(yǎng)骨肉瘤MG63 細(xì)胞，于37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期MG63 細(xì)胞，利多卡因（0、2、4、8、16 mmol/L）處理細(xì)胞，分為0 mmol/L 組、2 mmol/L 組、4 mmol/L 組、8 mmol/L組、16 mmol/L組，各組分別處理24、48、72 h。經(jīng)MTT篩選適宜利多卡因適宜濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

MG63 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-195 mimics、miR-con，分別命名為miR-195組、miR-con組，未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為NC組，各組處理時間24 h。后續(xù)實驗中將anti-miR-195、anti-miR-con分別轉(zhuǎn)染入MG63細(xì)胞后，用含有4 mmol/L的利多卡因處理48 h，分別命名為lidocaine+anti-miR-195組、lidocaine+anti-miR-con組。

1.2.2 甲基噻唑基四唑（MTT）檢測細(xì)胞增殖取對

數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔板（2×103個/細(xì)胞），按照“1.2.1”分組處理細(xì)胞，每孔加MTT 溶液20μL，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔別加入50 μL 二甲基亞砜（DMSO），用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度值（A值）。

利多卡因、miR-195過表達(dá)或抑制miR-195表達(dá)對順鉑敏感性檢測：取0 mmol/L 組、2 mmol/L 組、4 mmol/L 組、NC 組、miR-con 組、miR-195 組、lidocaine +anti-miR-con 組、lidocaine +anti-miR-195 組對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96 孔板，加入不同濃度梯度順鉑（0.5、1、2、4、8、16 mg/L）的培養(yǎng)基處理24 h［8］，更換為MTT 與正常培養(yǎng)基的混合液（1∶9），避光孵育1 h，用酶標(biāo)儀490 nm 檢測吸光度值（A 值），計算半抑制濃度（IC50值）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取各組骨肉瘤MG63 細(xì)胞，加入500 μL 結(jié)合緩沖液，依次加5 μL Annexin V-FITC與5μL PI，避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測細(xì)胞中miR-195、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）

mRNA 表達(dá)水平用Trizol 法提骨肉瘤MG63 細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。miR-195 以U6 為內(nèi)參，MRP1 以βactin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-195、MRP1 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測cy clinD1、Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)各組骨肉瘤MG63 細(xì)胞，室溫條件下，800 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取適量蛋白上清液加入5×Buffer（4∶1），充分混勻，100 ℃煮沸10 min，采用12%凝膠100 V 恒壓進(jìn)行蛋白電泳實驗，250 V 恒壓轉(zhuǎn)膜1 h，封閉1 h，加稀釋為1∶1 000一抗，4 ℃孵育24 h，加稀釋為1∶2 000二抗，室溫孵育1 h 顯影，應(yīng)用ImageJ 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，每個實驗重復(fù)3 次，多組間用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用LSD 法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利多卡因?qū)侨饬鯩G63 細(xì)胞的增殖的影響用不同濃度的利多卡因處理骨肉瘤MG63 細(xì)胞，MTT 法檢測結(jié)果顯示，與0 mmol/L 組相比，利多卡因2 mmol/L組、4 mmol/L組、8 mmol/L組、16 mmol/L 組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），呈時間-劑量依賴效應(yīng)，見表1。

表1 不同濃度利多卡因?qū)侨饬鯩G63細(xì)胞不同處理時間存活率的影響/（%，±s）

表1 不同濃度利多卡因?qū)侨饬鯩G63細(xì)胞不同處理時間存活率的影響/（%，±s）

注：①與0 mmol/L組比較，P＜0.05。②與0 h比較，P＜0.05。

組別0 mmol/L 2 mmol/L 4 mmol/L 8 mmol/L 16 mmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)3 3333 0 h 100.01±10.01 96.13±9.62①82.26±8.23①67.13±6.71①35.17±3.52①32.64＜0.001 24 h 100.00±10.12 90.46±9.05①70.05±7.01①②58.01±5.80①②24.09±2.41①②48.91＜0.001 48 h 101.27±10.13 82.16±8.22①②52.36±5.24①②38.11±3.81①②21.04±2.11①②73.48＜0.001 72 h 99.76±9.98 79.16±7.92①②55.28±5.53①②43.14±4.32①②23.75±2.38①②61.60＜0.001 F值0.04 7.10 39.63 57.49 49.76 P值0.989 0.001 0.000 0.000 0.000

2.2 利多卡因?qū)侨饬鯩G63 凋亡和化療敏感性的影響與0 mmol/L 組相比，2 mmol/L 組、4 mmol/L組MRP1 mRNA表達(dá)水平、順鉑IC50值顯著下降，凋亡率、Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)

表2 不同濃度利多卡因?qū)侨饬鯩G63細(xì)胞凋亡和化療敏感性的影響/±s

表2 不同濃度利多卡因?qū)侨饬鯩G63細(xì)胞凋亡和化療敏感性的影響/±s

注：Cleaved caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①與0 mmol/L組比較，P＜0.05。

組別0 mmol/L 2 mmol/L 4 mmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)3 Cleave-caspase-3 0.15±0.02 117.32＜0.001細(xì)胞凋亡率/%8.22±0.82 82.43＜0.001 MRP1 mRNA 1.00±0.11±0.08①±0.05①36.06＜0.001對順鉑IC50/（mg/L）9.05±0.92 6.59±0.71①2.16±0.23①78.18＜0.001images/BZ_30_402_1858_918_1984.png

2.3 利多卡因?qū)iR-195 表達(dá)的影響不同濃度的利多卡因處理后，2 mmol/L 組、4 mmol/L 組骨肉瘤細(xì)胞中miR-195 的表達(dá)水平顯著高于0 mmol/L 組［（1.86±0.18）、（2.25±0.22）比（1.00±0.10），P＜0.05］。

2.4 上調(diào)miR-195 對骨肉瘤MG63 細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響 miR-195 組miR-195 的表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯高于miR-con 組（P＜0.05），cyclinD1 蛋白表達(dá)水平、MRP1 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞存活率、順鉑IC50值明顯低于miR-con組（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 miR-195過表達(dá)對骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響/±s

表3 miR-195過表達(dá)對骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響/±s

注：cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，Cleaved caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①與miR-con組比較，P＜0.05。

組別NC miR-con miR-195 F值P值重復(fù)次數(shù)333 miR-195 1.00±0.12 1.12±0.10 2.36±0.04①196.25＜0.001 cyclinD1 1.00±0.09 0.98±0.10 0.40±0.04①53.06＜0.001 Cleave-caspase-3 0.20±0.03 0.18±0.02 0.90±0.09①160.98＜0.001細(xì)胞存活率/%100.00±10.11 101.23±10.13 53.26±5.25①28.96＜0.001細(xì)胞凋亡率/%8.38±0.85 8.30±0.80 22.36±2.28①89.880＜0.001 MRP1 mRNA 1.00±0.11 0.68±0.07 0.40±0.04①43.61＜0.001對順鉑IC50/（mg/L）9.10±0.90 8.99±0.85 4.05±0.40①44.24＜0.001

圖2 上調(diào)miR-195對骨肉瘤MG63細(xì)胞cyclinD1、Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.5 低表達(dá)miR-195能夠逆轉(zhuǎn)利多卡因（4 mmol/L）對骨肉瘤MG63增殖、凋亡和化療敏感性的影響 lidocaine+anti-miR-195 組cyclinD1 蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞存活率、MRP1 mRNA 表達(dá)水平、順鉑IC50值明顯高于lidocaine+anti-miR-con 組（P＜0.05），Cleavedcaspase-3 蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯明顯低于lidocaine+anti-miR-con組（P＜0.05），見圖3、表4。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測cyclinD1、Cleave-caspase-3蛋白表達(dá)

表4 低表達(dá)miR-195能夠逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)侨饬鯩G63增殖、凋亡和化療敏感性的影響/±s

表4 低表達(dá)miR-195能夠逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)侨饬鯩G63增殖、凋亡和化療敏感性的影響/±s

注：cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，Cleaved caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①與NC組比較，P＜0.05。②與lidocaine+anti-miR-con組比較，P＜0.05。

組別NC lidocaine lidocaine+anti-miR-con lidocaine+anti-miR-195 F值P值重復(fù)次數(shù)3333 miR-195 1.00±0.09 2.20±0.22①2.25±0.25 1.35±0.13②34.29＜0.001 cyclinD1 1.00±0.11 0.40±0.04①0.42±0.05 0.88±0.09②47.46＜0.001 Cleave-caspase-3 0.25±0.02 0.98±0.10①1.00±0.11 0.40±0.04②75.30＜0.001細(xì)胞存活率/%100.00±10.18 53.68±5.28①50.88±5.11 92.46±9.25②32.30＜0.001細(xì)胞凋亡率/%8.54±0.85 29.88±3.00①30.86±3.09 15.49±1.55②66.73＜0.001 MRP1 mRNA 1.00±0.10 0.43±0.04①0.41±0.03 0.86±0.09②52.45＜0.001對順鉑IC50/（mg/L）9.15±0.95 2.20±0.25①2.12±0.22 8.14±0.81②101.99＜0.001

3 討論

利多卡因可通過調(diào)節(jié)GOLT1A的表達(dá)而抑制肺癌細(xì)胞增殖［9］。利多卡因通過調(diào)節(jié)miR-539/EGFR分子軸抑制肺癌細(xì)胞發(fā)展［10］。利多卡因抑制胃癌細(xì)胞生長分化［11］。Bax 是Bcl-2 蛋白家族成員，可通過激活線粒體凋亡途徑激活caspase 形成活化cas-pase，加快細(xì)胞發(fā)生凋亡［12］。本研究用利多卡因干預(yù)后，凋亡率、Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞活性降低，說明利多卡因干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞可抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴效應(yīng)。骨肉瘤的主要化療用藥是順鉑，其作用機制是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而化療耐藥性是影響骨肉瘤化療效果的重要原因［13］。研究報道指出七氟醚、異氟醚等可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，還可影響細(xì)胞化療敏感性［14］。因而積極探尋化療增敏劑對提高骨肉瘤化療效果具有重要意義。

MRP1 可通過將異型生物質(zhì)運出細(xì)胞外而保護(hù)細(xì)胞，還可與抗腫瘤藥物、鉑類耐藥等密切相關(guān)［15］。本研究結(jié)果顯示利多卡因處理后骨肉瘤細(xì)胞中MRP1 表達(dá)水平顯著降低，其對順鉑半抑制率濃度（IC50 值）顯著下降，說明利多卡因可提高順鉑敏感性，提示利多卡因下調(diào)MRP1 表達(dá)從而提高細(xì)胞順鉑敏感性。

miR-195 可能通過抑制肝癌細(xì)胞增殖進(jìn)而增加細(xì)胞對5-氟尿嘧啶藥物敏感性［16］。研究表明miR-195 可能通過負(fù)向調(diào)控Raf-1 信號通路從而增加結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性［17］。miR-195 表達(dá)量降低與順鉑的化療敏感性及胃癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)［18］。本研究結(jié)果顯示骨肉瘤細(xì)胞中上調(diào)miR-195 表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡率顯著增加，MRP1 mRNA 表達(dá)水平顯著降低，IC50 值顯著降低，說明上調(diào)miR-195 抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞化療敏感性。cyclinD1 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，還可通過與CDK4/CDK6結(jié)合從而促進(jìn)細(xì)胞由G1 期轉(zhuǎn)為S 期，促進(jìn)細(xì)胞增殖［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-195 表達(dá)可降低cyclinD1 表達(dá)，提示上調(diào)miR-195 表達(dá)可能通過下調(diào)cyclinD1 而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。本研究擬建立利多卡因與miR-195之間的作用關(guān)系，結(jié)果顯示，利多卡因可增加miR-195的表達(dá)，抑制miR-195表達(dá)可逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)侨饬黾?xì)胞凋亡、增殖及化療敏感性的作用。說明利多卡因可通過上調(diào)miR-195促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)展。

利多卡因可通過上調(diào)miR-195 的表達(dá)在骨肉瘤細(xì)胞順鉑抵抗形成過程中發(fā)揮重要抑制作用，利多卡因濃度為4 mmol/L 時作用效果較好，通過體外實驗證實利多卡因可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及增強順鉑化療敏感性，可為臨床合理應(yīng)用利多卡因提供理論依據(jù)。