宋穎，諸佩超，周維，繆穎波，徐翀

（上海市臨床檢驗中心，上海，200126）

抗凝血酶是血漿中重要的生理性抗凝蛋白,主要由肝臟合成?？鼓甘悄傅闹饕种莆?它還可以中和凝血途徑中的其他絲氨酸蛋白酶,如凝血因子IXa、Xa、XIa、XIIa 等?？鼓甘强鼓鞍讬z測系統(tǒng)中的一個重要的檢測項目,目前不僅限于獲得性或遺傳性抗凝血酶缺陷的診斷,也廣泛地應用于早期DIC 監(jiān)測、靜脈血栓高風險人群的篩查、感染性和過敏性炎癥的監(jiān)測、抗凝血酶替代療法的監(jiān)測、肝素類藥物監(jiān)測等。[1]近年來開展抗凝血酶檢測項目的醫(yī)療機構(gòu)呈逐年增多趨勢。

抗凝血酶的分析可分為抗凝血酶活性檢測和含量檢測,分別采用發(fā)色底物法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)。目前在全自動血凝分析儀上,采用發(fā)色底物法檢測抗凝血酶活性的臨床實驗室占主流。

國際上多家室間質(zhì)評機構(gòu)如:英國國家室間質(zhì)評計劃(The United Kingdom National External Quality Assessment Scheme,UK NEQAS),荷蘭診斷分析與檢測外部質(zhì)控(External quality Control of diagnostic Assays and Tests,ECAT)[2]、美國臨床病理家學會(College of American Pathologists,CAP)[3]均開展了抗凝血酶室間質(zhì)評。上海市臨床檢驗中心(Shanghai Center for Clinical Laboratory,SCCL)是上海市臨床檢驗質(zhì)量控制組織評價機構(gòu),為了加強抗凝血酶檢測項目的質(zhì)量管理,從2016年開展此項目的室間質(zhì)評和地區(qū)性室內(nèi)質(zhì)控室間化工作。本研究旨在通過分析2016—2021年12 次室間質(zhì)評活動反饋結(jié)果,了解上海市及部分其他地區(qū)抗凝血酶檢測開展情況及檢測質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 室間質(zhì)評樣本制備 采用商品化制品(上?；葜猩锟萍加邢薰綪retrol 凝血七項非定值質(zhì)控品),以人血漿為基礎,添加了高純度生物提取物、穩(wěn)定劑等,性狀為真空冷凍干燥制品。配制的抗凝血酶活性范圍為(低值17%～29%,中值34%～56%,高值74%～110%)。每次室間質(zhì)評活動使用的質(zhì)評樣本均經(jīng)均勻性和穩(wěn)定性評估,以排除質(zhì)評樣本本身質(zhì)量對質(zhì)量評價的影響。

1.2 室間質(zhì)評方案設計 每年進行2 次室間質(zhì)評活動,每次發(fā)放5 個不同水平樣本。要求參加實驗室根據(jù)臨床標本的常規(guī)操作方法進行檢測,并在規(guī)定日期內(nèi)(樣本接收后3 天內(nèi))將檢測結(jié)果通過網(wǎng)絡端口上報至SCCL 數(shù)據(jù)庫,超過規(guī)定時間系統(tǒng)將不再接收數(shù)據(jù)。

1.3 結(jié)果評價 依據(jù)回報結(jié)果評價各實驗室檢測結(jié)果間的一致性,按照兩種統(tǒng)計匯總方式進行分析。(1)分組原則:一種按所有參加調(diào)查的實驗室數(shù)據(jù)匯總,即不分組;另一種按檢測試劑品牌分組。(2)統(tǒng)計分析采用一般統(tǒng)計描述:檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布,并計算平均值、標準差(s)及變異系數(shù)(CV%)。(3)合格評價:靶值:格拉布斯準則剔除離群值后的平均值。各實驗室檢測結(jié)果與靶值的相對偏差小于TEA(15%)為符合。以總成績≥80 分(即5 個樣本中4個符合)為合格。對數(shù)據(jù)進行匯總,并對超出范圍的檢測結(jié)果進行分析。

1.4 統(tǒng)計方式 本文采用SPSS Statistics 25.0 統(tǒng)計軟件對6年的室間質(zhì)評數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,并采用正態(tài)分布對其數(shù)據(jù)進行描述。

2 結(jié) 果

2.1 總體分布情況 2016—2021年參加抗凝血酶檢測的實驗室數(shù)增長情況見表1,參加的實驗室數(shù)成顯著增加趨勢。參加實驗室以上海本地實驗室為主,占所有參加實驗室的98%。

表1 2016—2021年參加抗凝血酶檢測項目室間質(zhì)評的實驗室數(shù)

2.2 按照室間質(zhì)評樣本活性分類,每次參與室間質(zhì)評的實驗室回饋的總均值、標準差(SD)、變異系數(shù)(CV)%見表2。

表2 2016—2021年抗凝血酶檢測所有樣本的總均值、SD 和CV%匯總情況

不對儀器和試劑分組,數(shù)據(jù)結(jié)果匯總高值樣本的CV%值為3.2～7.0,中位數(shù)為4.3;中值樣本的CV%為4.3～8.3,中位數(shù)為6.3;低值樣本的CV%為6.6～13.9,中位數(shù)為9.0。2016年至2021年總體CV 值呈逐步降低趨勢。此結(jié)果為剔除離群值后的統(tǒng)計結(jié)果。

經(jīng)與離群值所在實驗室溝通,產(chǎn)生離群值的原因為檢測前未對更換試劑批號后的儀器進行定標操作。

2.3 各檢測實驗室所采用的檢測系統(tǒng)分布情況見表3

表3 各檢測實驗室所采用的檢測系統(tǒng)分布情況

其中SYS 系統(tǒng)與I 系統(tǒng)的市場占有率較高。其余檢測系統(tǒng)也呈現(xiàn)逐年增多的趨勢。

2．4 兩種具有代表性的檢測系統(tǒng)間的一致性比較通過各檢測系統(tǒng)的平均值，標準差（SD）和變異系數(shù)（CV%）三個統(tǒng)計指標反映兩個主流檢測系統(tǒng)間的一致性（SYS 檢測系統(tǒng)和I 檢測系統(tǒng)），共計60 次調(diào)查數(shù)據(jù)（每個調(diào)查發(fā)放5 個樣本，一年發(fā)放2 批，共計6年）。參見圖1?3。

圖1 兩個檢測系統(tǒng)間平均值比較

圖2 兩個檢測系統(tǒng)間SD 比較

由圖所示,兩個檢測系統(tǒng)的抗凝血酶檢測結(jié)果間有較好的一致性,I 檢測系統(tǒng)每次調(diào)查的平均值略高于SYS 檢測系統(tǒng)。室間質(zhì)評低值樣本系統(tǒng)間的CV%分別為(檢測系統(tǒng)1:5.5～12.4,中位數(shù)8.0;檢測系統(tǒng)2:4.2～17.0,中位數(shù)為4.2)。室間質(zhì)評中值樣本系統(tǒng)間的CV%分別為(檢測系統(tǒng)1:3.3～9.2,中位數(shù)5.5;檢測系統(tǒng)2:2.9～8.9,中位數(shù)為2.9)。室間質(zhì)評高值樣本系統(tǒng)間的CV%分別為(檢測系統(tǒng)1:2.2～7.1,中位數(shù)3.2;檢測系統(tǒng)2:2.3～6.3,中位數(shù)為3.5)。兩個檢測系統(tǒng)進行配對t檢驗,其組均值、SD 和CV%的p 值分別為P＜0.0001、P=0.0741、P=0.2512(以P＞0.05)。兩個檢測系統(tǒng)間的均值存在顯著性差異外(SYS 檢測系統(tǒng)與I 檢測系統(tǒng)之間的偏倚為4.5%),SD 和CV%均無顯著性差異。

圖3 兩個檢測系統(tǒng)間CV%比較

將兩個檢測系統(tǒng)的60 次調(diào)查數(shù)據(jù)進行回歸分析后得出圖4。

圖4 兩檢測系統(tǒng)間60 次調(diào)查數(shù)據(jù)回歸分析

由圖所示,兩者間的相關系數(shù)R2=0.9935,回歸方程為y=1.076x－1.451。

由此可見,兩種檢測系統(tǒng)間的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)較好相關性。

3 討 論

抗凝血酶檢測作為抗凝蛋白系統(tǒng)的重要組成部分,其檢測價值越來越得到臨床醫(yī)生的關注。從參與室間調(diào)查開展的實驗室數(shù)量來看5年來呈逐年增加趨勢。從2016年開始,上海市臨床檢驗中心在室間質(zhì)評中增加抗凝血酶項目并在此基礎上又開展蛋白C 和蛋白S 兩個項目的室間質(zhì)評,目的在于為上海地區(qū)或其他地區(qū)的實驗室提供能力驗證服務。從5年來匯總的情況看,各實驗室間檢測結(jié)果的變異系數(shù)均小于15%,屬于一致性較好的項目之一。分析原因可能有以下幾點:1.抗凝血酶項目具有可以溯源的國際標準品,此標準品可以從NIBSC 的官網(wǎng)獲得(NIBSC code:06/166)。2.各儀器和試劑生成廠家通過溯源鏈建立各自的檢測系統(tǒng),提供相應的定標品、檢測儀器和試劑。3.實驗室操作人員遵照質(zhì)量管理要求按操作規(guī)程在檢測前對儀器進行定標操作。依據(jù)CLSI H57-A 文件要求,血凝分析儀在臨床標本檢測前應進行性能驗證,并在使用新批號檢測試劑或質(zhì)控結(jié)果失控等情況下進行定標操作。[4]4.實驗室操作人員質(zhì)量控制意識增強,遵照質(zhì)量管理要求進行室內(nèi)質(zhì)控,參加室間質(zhì)評,提高檢測結(jié)果的可靠性。

國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心(原衛(wèi)生部臨床檢驗中心)已于2017年開展抗凝蛋白檢測現(xiàn)狀全國性調(diào)查和分析。從統(tǒng)計數(shù)據(jù)來看,參加抗凝血酶調(diào)查的實驗室為194 家,正常水平質(zhì)控物檢測結(jié)果的CV 范圍為5.7%-12.9%;異常水平質(zhì)控物的CV 范圍為13.3%～38.3%。不同實驗室間檢測結(jié)果可比性較差。[5]

抗凝血酶試劑檢測的技術路線采用兩種方式,一種基于牛凝血酶(Bovine Thrombin),另一種基于凝血因子Xa(Factor Xa),各儀器、試劑生產(chǎn)廠商提供相應的試劑種類用于檢測。目前上海地區(qū)使用的兩個主要的檢測系統(tǒng)分別采用這兩種方式,兩個主要檢測系統(tǒng)相關性數(shù)據(jù)分析,相關性很好R2=0.9935回歸方程為y=1.076x－1.451,但系統(tǒng)間平均值存在顯著性差異,偏倚中位數(shù)為4.9%。

本中心為了提升自身檢測能力參加世界衛(wèi)生組織(WHO)委托英國能力驗證提供機構(gòu)UK NEQAS 組織的抗凝血酶室間質(zhì)評,從回饋的結(jié)果分析,本實驗室具備抗凝血酶檢測能力。UK NEQAS 按照試劑品牌將參加實驗室分為不同組別。我們所參加的UK NEQAS 將近14 次室間質(zhì)評結(jié)果統(tǒng)計分析,SYS 系統(tǒng)與I 系統(tǒng)回歸方程為y=1.2595x－19.453,R2=0.9756,P＜0.0001,偏倚的中位數(shù)為3.9%,與本中心組織的室間質(zhì)評的結(jié)果基本一致。參加UK NEQAS 室間質(zhì)評的實驗室數(shù)共計330 家,其中采用牛凝血酶的實驗室為110 家,采用凝血因子Xa 的實驗室為217 家,其他方法的3 家。

基于抗凝血酶檢測項目具有可溯源的國際標準品,UK NEQAS 在能力驗證報告中還提供抗凝血酶活性檢測項目的標準不確定度中位數(shù)的結(jié)果。此外,在荷蘭一個名為“校準2000”的室間質(zhì)評項目中,研究了抗凝血酶活性測定的一致性。通過多中心互換性研究設計,分析了新鮮冷凍的患者血漿和三個候選的校準品的檢測結(jié)果,比較30 個實驗室(荷蘭)組成15對抗凝血酶檢測結(jié)果,并根據(jù)最佳標準殘差(SDSA)評估候選校準品的互換性。所得的檢測結(jié)果進行回歸線分析,呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)按照3SD 確定范圍。這些候選校準品可用于一致性研究,調(diào)整抗凝血酶檢測結(jié)果。使用這些校準品后,抗凝血酶結(jié)果的實驗室間變異系數(shù)(CV)從6.9%～13.2%(調(diào)整前)減小至5.6%～9.8%。[6]目前上海市臨床檢驗中心尚未開展凝血項目相關的溯源性研究,缺乏溯源性的體系和算法,這六年的室間調(diào)查數(shù)據(jù)也為今后的標準化工作提供數(shù)據(jù)支持,有助于提高抗凝血酶檢測的一致性。