王 輝，張 亮，周美靜

（保定市疾病預(yù)防控制中心，河北 保定 071000）

目前，食品安全因?yàn)榕c人們的生活和健康息息相關(guān)，已經(jīng)成為全社會廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)話題。為了確保食品的安全性，還需要做好相應(yīng)的微生物檢驗(yàn)工作。隨著時代的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，食品的種類也日漸豐富，相應(yīng)地，食品安全問題也更加受到重視。速食食品具有口味繁多、方便快捷等特點(diǎn)，在人們的日常生活中十分常見，帶給大家極大的便利。但是，速食食品也容易受到污染，出現(xiàn)各種致病菌。為此，針對各種速食食品，還需要重視相關(guān)的致病菌檢驗(yàn)。目前，在檢驗(yàn)過程中，可以選擇應(yīng)用不同的檢驗(yàn)方法。在本文的研究中，選擇200份含有食源性致病菌的速食食品樣本進(jìn)行隨機(jī)分組，分別采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法和實(shí)時熒光定量PCR 法進(jìn)行檢驗(yàn)。通過比較不同檢驗(yàn)方法的效果，得出較為合理的檢驗(yàn)方案。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源

此次實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株及其來源于編號情況如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株及其來源于編號情況Tab.1 Source and number of experimental standard strain

1.2 試劑和儀器

此次研究中使用的試劑以及儀器種類分別為：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)）；PCR 擴(kuò)增試劑盒（杭州妙麗生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；沙門氏菌核酸檢測試劑盒（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；副溶血弧菌核酸檢測試劑盒（廣州深華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒（上海創(chuàng)坤生物科技有限公司生產(chǎn)）；志賀氏菌核酸檢測試劑盒（上海滬震生物科技有限公司生產(chǎn)）；單核細(xì)胞增生性李斯特菌核酸檢測試劑盒（廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)）；蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒（上海富勒生物科技有限公司生產(chǎn)）；熒光定量PCR 儀（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)）；臺式高速冷凍離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司生產(chǎn)）。

1.3 方法

采用傳統(tǒng)分離鑒定方式進(jìn)行檢驗(yàn)，包括：前增菌、選擇性增菌、平板分離、生化篩選、血清學(xué)鑒定。在檢驗(yàn)過程中，根據(jù)分離培養(yǎng)后不同致病菌的化學(xué)組成情況或者代謝產(chǎn)物類型，結(jié)合其不同的生理生化等特性，開展生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，動物毒理實(shí)驗(yàn)，溶血實(shí)驗(yàn)，對不同的致病菌予以鑒定。

（1）菌株基因組DNA 制備

選取不同培養(yǎng)基上的單個菌落，嚴(yán)格依照不同細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作，按照操作流程，將不同菌株的基因組DNA提取出來，提取完畢后，置于-20℃條件下凍存?zhèn)溆?，作用是陽性對照?/p>

（2）樣本前處理與DNA 提取

對200份速食食品樣品進(jìn)行處理，于無菌條件下，取25.0 g 食品樣品均質(zhì)，將其添加到已經(jīng)經(jīng)過滅菌處理的液體培養(yǎng)基（225 mL）中。之后，置于37℃條件下開展增菌培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取50 μL 增菌液進(jìn)行DNA 提取。針對不同菌株的情況，選擇相應(yīng)的核酸檢測試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，完成檢測。

（3）實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)體系及程序

將食品提取的DNA以及不同菌株的DNA 作為模板，利用特異性引物與探針進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。研究PCR 擴(kuò)增梯度循環(huán)反應(yīng)相關(guān)循環(huán)數(shù)與反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度如表2所示。

表2 研究PCR 擴(kuò)增梯度循環(huán)反應(yīng)相關(guān)循環(huán)數(shù)與反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度Tab.2 The number of relevant cycles, reaction time and reaction temperature of studying PCR amplification gradient cycle reaction

（4）陽性結(jié)果判定

在完成反應(yīng)之后，對結(jié)果進(jìn)行判定。其中，如果待測樣品檢測所得循環(huán)閾值（cyclethreshold,Ct值）小于等于35，且存在明顯的指數(shù)增長情況，則證明PCR過程中出現(xiàn)目標(biāo)DNA 的擴(kuò)增。在空白對照結(jié)果、陽性對照結(jié)果、陰性對照結(jié)果均正常的情況下，可將其判定為陽性。如果檢測所得的Ct 值在35~38的范圍之內(nèi)，則需要重新進(jìn)行PCR 擴(kuò)增操作。對再次擴(kuò)增后的外源基因Ct 值進(jìn)行觀察，如果該數(shù)值仍然大于35，且存在明顯的指數(shù)增長現(xiàn)象，在空白對照結(jié)果、陽性對照結(jié)果、陰性對照結(jié)果均正常的情況下，可將其判定為陽性。如果經(jīng)過再次擴(kuò)增操作后，外源基因的Ct 值高于38，在空白對照結(jié)果、陽性對照結(jié)果、陰性對照結(jié)果均正常的情況下，可將其判定為陰性。

1.4 觀察指標(biāo)

對兩種檢驗(yàn)方法下的致病菌陽性檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，相關(guān)的致病菌包括計(jì)算出總陽性率。并對兩組檢驗(yàn)所耗費(fèi)的時間進(jìn)行記錄，計(jì)算出平均用時結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對研究過程中采集到的各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，統(tǒng)一導(dǎo)入到統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS 21.0中進(jìn)行出處理。研究中涉及到的各種計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用檢驗(yàn)，各項(xiàng)計(jì)數(shù)資料的表示方法為例，%，組間檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)后實(shí)現(xiàn)（＜ 0.05），則證明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同檢驗(yàn)方法的陽性檢出率統(tǒng)計(jì)比較

經(jīng)統(tǒng)計(jì)與組間比較，實(shí)時熒光定量PCR 法的樣本陽性檢出率為11.00%，較傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的8.00%明顯較高（＜ 0.05），具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。

表3 不同檢驗(yàn)方法的陽性檢出率統(tǒng)計(jì)比較Tab.3 Statistical comparison of the positive detection rate with different detection methods

2.2 不同檢驗(yàn)方法的平均用時統(tǒng)計(jì)比較

對比不同檢驗(yàn)方法下的用時情況，可得實(shí)時熒光定量PCR 法的平均用時明顯短于傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法（＜ 0.05），具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。

表4 不同檢驗(yàn)方法的平均用時統(tǒng)計(jì)比較Tab.4 Statistical comparison of average time with different detection methods±s/h

3 討論

長期以來，食品安全一直都是備受社會各界關(guān)注的重要課題。食源性疾病是公認(rèn)的、全球首要的食品安全問題，也是首要的公共衛(wèi)生問題。食品微生物檢測的3大指標(biāo)是菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌，食品中常見的致病菌有沙門氏菌，變形桿菌，副溶血性弧菌，致病性大腸桿菌，蠟樣芽孢桿菌，肉毒梭狀芽胞桿菌等。食品中的致病菌、污染物（真菌毒素）對消費(fèi)者健康危害較大。近年來，各種致病菌污染所引起的食源性疾病時有出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅到公眾的健康，也造成了一定的經(jīng)濟(jì)損。確保食品安全的關(guān)鍵，在于采取有效的方法，快速篩查受污染的食物。

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，生產(chǎn)模式、生產(chǎn)規(guī)模甚至消費(fèi)習(xí)慣均發(fā)生變化，再加上我國特有的飲食文化，目前，各種不同類型、不同口味的速食食品在人們的生活中十分常見，給大家的日常生活提供了極大的便利。但是，速食食品的制作、加工、包裝、運(yùn)輸、貯藏等過程中極易被各種致病菌所侵染，進(jìn)而影響到食品的質(zhì)量和安全，并直接威脅到廣大消費(fèi)者的身體健康，甚至是生命安全。為此，針對各種速食食品，應(yīng)注意從微生物角度出發(fā)，重視對其相關(guān)致病菌的檢驗(yàn)和分析。在具體的檢驗(yàn)過程中，可以選擇應(yīng)用不同的檢驗(yàn)方法。以往在進(jìn)行檢驗(yàn)的時候，應(yīng)用的大多是傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法。應(yīng)用這一方法進(jìn)行檢驗(yàn)的過程中，需要結(jié)合檢驗(yàn)需求，對各種致病菌進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，不同微生物所需的生長環(huán)境條件也各不相同，為獲得理想的培養(yǎng)效果，還需要針對不同微生物的特點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的培養(yǎng)基選擇和溫度、酸堿度控制等等。例如：腸出血性大腸桿菌0157∶H7可以利用與一般大腸桿菌發(fā)酵山梨醇的特性不同，在SMAC瓊脂上為無色菌落，而一般大腸桿菌為粉紅色菌落來鑒別腸出血性大腸桿菌0157∶H7。整個過程操作十分繁瑣，復(fù)雜，并需要耗費(fèi)大量的人力、物力。而且，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法下，對于那些不容易被培養(yǎng)出來的致病菌，往往難以進(jìn)行檢測。另外，檢驗(yàn)所耗費(fèi)的時間也較長。

目前食物致病菌的檢查通過增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→確認(rèn)試驗(yàn)，整個過程需要7~14 d的時間，周期長，操作繁瑣，已不適應(yīng)時代發(fā)展的需要。因此，開發(fā)快速、靈敏的食源性致病菌檢測方法至關(guān)重要。隨著時代的發(fā)展，各種新型的檢驗(yàn)技術(shù)手段開始被開發(fā)出來，并逐漸應(yīng)用到各種食品的致病菌檢驗(yàn)之中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種快速、靈敏、高通量的方法，目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于多種食源性致病菌的快速檢測之中。熒光定量PCR(Real-Time PCR）技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。具有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、操作簡便、特異性和可靠性更強(qiáng)、自動化程度高、無污染性、具實(shí)時性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。細(xì)菌的PCR檢測流程主要包括核酸提取、擴(kuò)增和檢測，目前，不同的PCR方法，包括常規(guī)PCR、實(shí)時PCR、多重PCR、免疫PCR和微流控PCR等，均有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用于各種細(xì)菌檢測。

在本文的研究過程中，選擇應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)。該技術(shù)是一種新型的檢驗(yàn)技術(shù)，傳統(tǒng)的檢測方法操作繁瑣、準(zhǔn)確度不高，實(shí)時熒光定量PCR方法是基于基因的方法，比傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法更準(zhǔn)確、快速。與傳統(tǒng)定量檢驗(yàn)不同，傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法只能進(jìn)行重點(diǎn)檢驗(yàn)，而采用全封閉管分析的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)可以借助一定的電腦分析軟件對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時動態(tài)地進(jìn)行監(jiān)測和自動定量分析。在檢驗(yàn)過程中，應(yīng)用該技術(shù)，可以根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針，從細(xì)胞或特定組織中提取總RNA。之后，使用設(shè)計(jì)合成的引物，以一定的樣品為模板，進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，確認(rèn)引物模板的反應(yīng)性能，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行定量分析。在實(shí)時熒光定量PCR(qPCR）中，反應(yīng)以循環(huán)中首次檢測到目標(biāo)擴(kuò)增的時間點(diǎn)為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累積的擴(kuò)增量。因此，整個檢驗(yàn)和分析的過程十分方便、快捷、高效，極大地提高了檢測的效率和精密度以及靈敏度。在本文的研究中，選擇應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對速食食品的致病菌情況進(jìn)行檢驗(yàn)。在檢驗(yàn)過程中，選擇了一些常見的食源性致病菌進(jìn)行研究，包括蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、志賀氏菌，以及金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等等。在研究中，對所獲得的200份速食食品樣品進(jìn)行了檢測，檢測中應(yīng)用不同的檢測方法，并對檢測結(jié)果進(jìn)行了分析。通過分析發(fā)現(xiàn)，在樣本陽性檢出率方面，實(shí)時熒光定量PCR 法的樣本陽性檢出率為11.00%，較傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的8.00%明顯較高。這一結(jié)果表明，與傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法相比較，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR法可以更好地對各種陽性標(biāo)本予以檢出，檢驗(yàn)的精確度更高。另外，不同檢驗(yàn)方法在所消耗時間方面也存在一定的差異。此次研究中，對比不同檢驗(yàn)方法下的用時情況發(fā)現(xiàn)，實(shí)時熒光定量PCR 法的平均用時為（2.35±0.12）h，明顯短于傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的（37.35±0.15）h。由此可知，實(shí)時熒光定量PCR 法是一種高效、方便、快捷的檢驗(yàn)方法，在提高檢驗(yàn)效果的同時，也可以有效縮短檢驗(yàn)所需時間，這對提高實(shí)際工作中的致病菌檢驗(yàn)效率意義重大。但是，在具體的應(yīng)用過程中，實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)、也具有一定的缺陷和不足。例如，該方法的檢測的過程中很多因素都可能導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)假陽性結(jié)果，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。出現(xiàn)這一情況主要是因?yàn)镻CR 方法的靈敏度較高，可能會對已經(jīng)死亡的菌體進(jìn)行擴(kuò)增而導(dǎo)致的。另外，該檢驗(yàn)方式的整體檢測成本較高，在實(shí)踐中進(jìn)行大面積推廣還存在一定的難度。因此，如何快速有效鑒定各種致病菌，還有待于進(jìn)一步研究和完善。

4 結(jié)語

總之，隨著生活水平的提高，在人們的生活中，對食品的質(zhì)量安全的關(guān)注度也在逐漸增強(qiáng)。食品不僅僅是充當(dāng)著人們營養(yǎng)的主要來源，還是關(guān)系到人們生活、工作、學(xué)習(xí)的重要角色。是消費(fèi)者和全社會所共同認(rèn)同和關(guān)注的問題之一。所以，對食品的安全監(jiān)測對個人來說可以有效確保生活質(zhì)量的不斷提高。而如果相關(guān)的檢測部門采用科學(xué)有效的方法，對各類食物進(jìn)行認(rèn)真檢測，就能夠從根本上保證食品衛(wèi)生的安全。通過本文的分析也了解到，傳統(tǒng)的檢測方法耗時較長，準(zhǔn)確性也偏低，無法滿足市場的需求。而應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)則能獲得更為理想的檢驗(yàn)效果。為此，在今后的食品致病菌檢驗(yàn)中，可以積極地嘗試對這一方法的推廣應(yīng)用。