王猛，關(guān)思宇，于杰，薛金愛(ài)，狄建兵，王愈，姜進(jìn)舉，崔紅利*，李潤(rùn)植*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷 030801）（2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801）（3.海藻活性物質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266400）

氧化應(yīng)激是機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧（Reactive oxygen species，ROS）過(guò)度積累，細(xì)胞氧化程度超出了氧化物的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞衰老，造成組織損傷[1]。Harman等[2]研究表明，體內(nèi)氧自由基反應(yīng)失衡使得細(xì)胞富集大量ROS，進(jìn)而加速細(xì)胞衰老。衰老是生命周期中必然經(jīng)歷的生理過(guò)程，衰老導(dǎo)致生物體自我更新能力和修復(fù)能力被削弱，此外，衰老常伴隨多種慢性疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性疾病、癌癥、糖尿病和心血管疾病等[3]。因此，當(dāng)體內(nèi)抗氧化酶難以抵擋自由基的過(guò)度富集，需要補(bǔ)充天然無(wú)毒的抗氧化劑來(lái)緩解細(xì)胞損傷。天然活性多糖因毒副作用小而備受關(guān)注。Feng等[4]研究證明，三七多糖雖對(duì)ROS的清除能力較弱，但是能顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命，且該多糖對(duì)熱應(yīng)激的作用可能與提高抗氧化酶活性和降低脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)；潘子康[5]研究證明，小球藻多糖在抗氧化脅迫實(shí)驗(yàn)中提高了線蟲(chóng)的存活時(shí)間，提高了線蟲(chóng)耐熱能力并且提高了線蟲(chóng)L4期的運(yùn)動(dòng)能力。

褐藻多糖（Fucoidan-containing sulfated polysaccharide，F(xiàn)SP）是褐藻細(xì)胞壁基質(zhì)中的一種天然硫酸化多糖[6]。研究表明，F(xiàn)SP具有抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等多種生理活性[7,8]。先前研究表明，F(xiàn)SP是一種能夠清除自由基和調(diào)節(jié)代謝的天然產(chǎn)物，這可能是由于多糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)中帶著不同數(shù)量的活性羥基和活性氫的緣故，這些活性基團(tuán)特異性識(shí)別并配對(duì)單自由基，通過(guò)改變其結(jié)構(gòu)達(dá)到清除自由基的作用[9]。Wang等[10]發(fā)現(xiàn)，不同藻類(lèi)提取的FSP抗氧化能力也大不相同，且硫酸根含量與超氧陰離子自由基清除能力呈正相關(guān)；栗曉慶等[11]認(rèn)為，通過(guò)堿提法獲得的FSP自由基清除率高，還原力較弱，在體外表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。此外，F(xiàn)SP抗氧化能力的關(guān)鍵是其分子量及硫酸根含量[12]。先前的研究多集中于體外驗(yàn)證，然而其體內(nèi)驗(yàn)證及分子機(jī)制尚不明確。

秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans，C.elegans）是一種存在于土壤中的食菌生物，因其生命周期短、易維護(hù)、可獲得數(shù)千個(gè)突變株，被廣泛用作研究抗氧化、抗衰老、抗阿爾茲海默癥、抗糖尿病藥物作用的模式生物[13]。胰島素/類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin/IGF-1，IIS）是調(diào)節(jié)生命周期且高度保守的信號(hào)通路，在線蟲(chóng)的發(fā)育、代謝和衰老過(guò)程中起關(guān)鍵作用[14]。研究表明，天然多糖通過(guò)調(diào)節(jié)某些信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)，引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)控線蟲(chóng)的衰老[15]。Yuan等[16]證明地黃中性多糖通過(guò)IIS增強(qiáng)線蟲(chóng)的抗應(yīng)激能力，從而延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命；Zhang等[17]報(bào)道枸杞多糖主要通過(guò)sir-2.1、daf-12和daf-16延長(zhǎng)了線蟲(chóng)的壽命?；诖耍茰y(cè)FSP通過(guò)調(diào)控Insulin/IGF-1信號(hào)通路增強(qiáng)線蟲(chóng)抵抗氧化應(yīng)激的能力。目前，對(duì)FSP體外抗氧化研究較多，但是其抗氧化及抗衰老的機(jī)理研究鮮有報(bào)道。本研究以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模式動(dòng)物，研究FSP抗氧化性及其作用機(jī)理，為其作為天然食品開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用褐藻多糖（即巖藻多糖）FSP來(lái)自于裙帶菜，由青島明月海藻集團(tuán)有限公司姜進(jìn)舉博士惠贈(zèng)。FSP的化學(xué)組成如表1所示，其中，F(xiàn)SP的總糖和總蛋白的含量分別為70.4%和4.77%，糖醛酸含量為7.22%，硫酸基含量為21.5%，巖藻糖含量為63.38%。菌株購(gòu)自美國(guó)線蟲(chóng)遺傳中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）：N2株系；Nematode Growth Medium（NGM）培養(yǎng)基，尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（Escherichia coli）OP50，DPPH、抗壞血酸，磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH=7.8），Trizol試劑（上海生工），PrimeScript RT試劑盒（Takara），BCA蛋白試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒采購(gòu)自南京建成生物技術(shù)公司。

表1 褐藻多糖化學(xué)組成Table 1 The chemical composition of FSP

1.2 方法

1.2.1 羥基自由基清除率的測(cè)定

在試管中加入0.5 mL不同濃度的FSP溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）、0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、0.5 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，混勻后加入0.5 mL 9 mmol/L的H2O2溶液，在37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h后于510 nm處測(cè)定其吸光度值，Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。

式中：

A0——水代替樣品測(cè)得的吸光度值；A1——多糖溶液測(cè)得的吸光度值；A2——乙醇代替水楊酸-乙醇溶液測(cè)得的吸光度值。

1.2.2 超氧陰離子清除率的測(cè)定

樣液配制同1.2.1，向具塞玻璃試管中分別加入0.026 mol/L的甲硫氨酸1.5 mL，500 μL的磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH=7.8），然后加入300 μL的核黃素（0.02 mmol/L）和300 μL NBT（0.75 mmol/L），混勻后在光照下反應(yīng)30 min，同時(shí)以蒸餾水作為空白對(duì)照A0，以不同濃度的Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定560 nm處的吸光值A(chǔ)，按照如下公式計(jì)算清除率。

1.2.3 總還原力測(cè)定

將1 mL不同濃度FSP（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）放入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）中，與2.5 mL鐵氰化鉀（1%，m/V）混合，50 ℃反應(yīng)20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸（10%，m/V）終止反應(yīng)，5000 r/min離心10 min后取2.5 mL上清液與2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3（0.1%，m/V）混合，靜置10 min后于700 nm處測(cè)定各組吸光度值，Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 FSP對(duì)線蟲(chóng)壽命及運(yùn)動(dòng)能力的影響

隨機(jī)挑取20條同期化至L4期線蟲(chóng)分為4組，分別將其接種至不含或含有不同濃度FSP-L（50 μg/mL）、FSP-M（100 μg/mL）、FSP-H（200 μg/mL）的NGM培養(yǎng)基飼養(yǎng)（飼喂OP50，同時(shí)為防止排卵影響每天轉(zhuǎn)板）。每組3次重復(fù)，每板20條，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)記為線蟲(chóng)壽命的第0 d。每天更換新鮮培養(yǎng)基，第2 d起，在顯微鏡下觀察線蟲(chóng)存活狀態(tài)，死亡標(biāo)準(zhǔn)以用picker輕碰線蟲(chóng)，線蟲(chóng)頭部或身體不擺動(dòng)彎曲為準(zhǔn)，每天對(duì)各板中線蟲(chóng)死亡數(shù)詳細(xì)記錄，計(jì)算存活率；鉆入培養(yǎng)基的線蟲(chóng)及由于其他因素死亡的線蟲(chóng)將從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中排除，以生存率百分比為縱坐標(biāo)繪制生存曲線。

線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]。實(shí)驗(yàn)組各挑取狀態(tài)相當(dāng)?shù)木€蟲(chóng)放置在2%的瓊脂糖凝膠上，先讓線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)約兩分鐘適應(yīng)環(huán)境，在體式顯微鏡下觀察30 s內(nèi)線蟲(chóng)頭部的擺動(dòng)次數(shù)并記錄，用以評(píng)價(jià)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的指標(biāo)。一次頭部擺動(dòng)是指線蟲(chóng)的頭部呈弓形運(yùn)動(dòng)（每組檢測(cè)線蟲(chóng)數(shù)目最少15條）。

1.2.5 脂褐素及細(xì)胞凋亡熒光檢測(cè)

制作2%瓊脂糖凝膠，倒在培養(yǎng)皿蓋里，厚度大概控制在1～3 mm，凝固后，切下一小塊瓊脂放在載玻片上，將線蟲(chóng)挑在培養(yǎng)基上，于熒光顯微鏡激發(fā)485 nm、發(fā)射530 nm波長(zhǎng)藍(lán)光觀察。

線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡程度采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚熒光染色法[19]（DAPI）測(cè)定：取線蟲(chóng)培養(yǎng)平板，切除2.0 cm×2.0 cm的瓊脂，加入M9緩沖液低速離心后收集蟲(chóng)體。熒光檢測(cè)前，將0.5 mol/L碳酸鹽緩沖液與甘油等體積混合，pH=9.5，每個(gè)蟲(chóng)體樣品避光染色10 min，用磷酸鹽-生理鹽水緩沖液沖洗3次，熒光顯微鏡激發(fā)360 nm、發(fā)射400 nm波長(zhǎng)紫外光下鏡檢。

1.2.6 H2O2誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激

隨機(jī)挑取30條同期化至L4期線蟲(chóng)分為4組，分別將其接種至不含或含有不同濃度FSP-L（50 μg/mL）、FSP-M（100 μg/mL）、FSP-H（200 μg/mL）的NGM培養(yǎng)基培養(yǎng)，將培養(yǎng)2 d后的線蟲(chóng)急性暴露于0.1% H2O2的48孔板內(nèi)，每孔10條，每組三次重復(fù)，每隔30 min計(jì)數(shù)線蟲(chóng)的存活個(gè)數(shù)，繪制生存曲線，直至全部死亡。

1.2.7 抗氧化酶測(cè)定

按1.2.4壽命實(shí)驗(yàn)線蟲(chóng)培養(yǎng)方法，用3 mL磷酸鹽緩沖液收集線蟲(chóng)至10 mL離心管，設(shè)置破碎功率和時(shí)間分別為800 W和8 min對(duì)線蟲(chóng)組織破碎，之后對(duì)破碎的組織液離心，離心后取上清[20]。按照BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SOD試劑盒和CAT試劑盒測(cè)定線蟲(chóng)酶活。

1.2.8 mRNA提取及熒光定量PCR檢測(cè)

將同期化L4期線蟲(chóng)FSP處理后，培養(yǎng)2 d。收集蟲(chóng)體于離心管中，PBS緩沖液清洗3次。Trizol法提取線蟲(chóng)的總RNA，Primer 5.0設(shè)計(jì)相關(guān)基因引物。用SYBR Green為DNA熒光染料，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定，以β-actin為內(nèi)參測(cè)定daf-16及其下游靶基因的表達(dá)量，基因表達(dá)以PCR的2-ΔΔCt值表示。

表2 秀麗隱桿線蟲(chóng)抗氧化基因?qū)崟r(shí)定量PCR引物Table 2 Real time quantitative PCR primers for antioxidant genes of C. elegans

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文數(shù)據(jù)處理采用Graghpad Prism 5.0，p＜0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，用One-way ANOVA進(jìn)行處理，活力脂褐素以及DAPI熒光顯微鏡拍照，作圖用Origin 9.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSP對(duì)羥基自由基的清除作用

羥基自由基（·OH）是重要的活性氧之一，氧化能力強(qiáng)且危害性較大。因此，研究FSP對(duì)羥基自由基的清除作用是FSP抗氧化性研究中重要的部分。Fenton 反 應(yīng)（Fe2++H2O2=·OH+OH-+Fe3+）產(chǎn)生·OH，·OH與水楊酸反應(yīng)生成2,3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)在510 nm處有一個(gè)特殊的吸收峰。研究表明，在體系中若加入抗氧化劑時(shí)，會(huì)產(chǎn)生的較少的·OH，吸光度降低[21]。本試驗(yàn)中通過(guò)Fenton法測(cè)定褐藻多糖對(duì)·OH清除效果，如圖1所示。在0.1～0.5 mg/mL濃度時(shí)FSP對(duì)·OH清除作用呈顯著的濃度依賴(lài)性，當(dāng)FSP的濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率是30.13%。FSP對(duì)羥基自由的清除活性低于張志東等[22]提取的從大連海域得到的褐藻多糖，當(dāng)褐藻多糖濃度為0.6 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)50%。

2.2 FSP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

作為機(jī)體誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的原因之一，超氧陰離子自由基是氧化反應(yīng)過(guò)程中最先產(chǎn)生的一種自由基。如圖2所示，F(xiàn)SP具有清除超氧陰離子的能力，但相比于Vc，其清除率較低。在濃度為0.1～0.5 mg/mL內(nèi)，F(xiàn)SP對(duì)超氧陰離子自由基的清除率呈劑量依賴(lài)性增加，并在0.5 mg/mL時(shí)，趨于平緩，清除率達(dá)41.13%。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，與王雪等[23]結(jié)果相似，羊棲菜褐藻糖膠超氧陰離子清除能力隨多糖的濃度的增加而增強(qiáng)，但是此清除率低于其實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 FSP的總還原力

所測(cè)樣品將K3Fe(CN)6還原成K4Fe(CN)6，與Fe3+反應(yīng)產(chǎn)生普魯士藍(lán)，在700 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)普魯士藍(lán)的吸光度，吸光度值越高，樣品的還原能力越強(qiáng)。如圖3所示，在不同濃度下，所測(cè)樣品的還原能力都很低。隨著FSP濃度的增加，F(xiàn)SP的還原能力并未有顯著變化，當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，在700 nm處，F(xiàn)SP最大吸光度也沒(méi)有超過(guò)0.07，這一結(jié)果可能與實(shí)驗(yàn)所用多糖的含糖量有關(guān)。先前研究結(jié)果表明，隨著吸光度不斷增加，還原力逐漸增強(qiáng)，12 mg/mL的羊棲菜褐藻多糖的吸光度值為1.49。盡管本試驗(yàn)中多糖還原力較低，但我們也能發(fā)現(xiàn)吸光度值與多糖濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)[24]。

2.4 FSP對(duì)線蟲(chóng)壽命及運(yùn)動(dòng)能力的影響

在衰老過(guò)程中，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)逐漸衰退，最終導(dǎo)致生命的終結(jié)。壽命長(zhǎng)短作為抗衰老研究的定量指標(biāo)，具有重要意義。如圖4a所示，隨著FSP濃度的增加，線蟲(chóng)存活曲線向右移，表明其最大壽命延長(zhǎng)；圖4b所示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SP干預(yù)后線蟲(chóng)的平均壽命顯著（p＜0.05）提高，其中FSP-L、FSP-M和FSP-H組線蟲(chóng)的平均壽命較對(duì)照組分別延長(zhǎng)了7.24%、26.70%和48.42%。綜上，在一定濃度梯度內(nèi)FSP顯著（p＜0.05）延長(zhǎng)了線蟲(chóng)的壽命。Zhang等[25]的研究結(jié)果表明，高劑量的毛竹多糖處理的線蟲(chóng)，平均壽命為27.3 d；張宗敏等[26]研究表明，與空白對(duì)照組相比，金釵石斛多糖顯著延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)的平均壽命，質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL的多糖延長(zhǎng)了33.89%。本研究發(fā)現(xiàn)FSP可以延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命，且作用效果呈劑量依賴(lài)性，證明了攝食活性物質(zhì)可以延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命。

隨著機(jī)體的衰老，運(yùn)動(dòng)能力也會(huì)減弱，頭部擺動(dòng)和身體彎曲頻率常作為分析線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的指標(biāo)。為了探究FSP是否可以減緩因衰老所致的線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力下降，本實(shí)驗(yàn)選擇線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)次數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)。從表3中可看出，與CK相比，F(xiàn)SP干預(yù)后線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)次數(shù)顯著增加，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。當(dāng)給予FSP多糖濃度為50、100、200 μg/mL時(shí)，其運(yùn)動(dòng)能力比對(duì)照組分別增加了14.62%、35.52%和73.50%，每組之間均有顯著（p＜0.05）差異。Gu等[27]研究黑木耳多糖對(duì)線蟲(chóng)生物學(xué)功能的影響中指出，0.8 mg/mL的黑木耳多糖能顯著增加線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)頻率，且線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)與多糖濃度呈劑量依賴(lài)性，與本研究結(jié)果相一致。

表3 FSP對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響Table 3 Effect of FSP on the head swing of C. elegans

2.5 FSP對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素和細(xì)胞凋亡的影響

脂褐素[28]是線蟲(chóng)氧化應(yīng)激和衰老的指示劑，是一種自發(fā)熒光色素，脂褐素含量隨線蟲(chóng)年齡的增加而逐漸增加，過(guò)多的脂褐素沉淀會(huì)對(duì)線蟲(chóng)的機(jī)體造成損害，最終加速線蟲(chóng)的衰老。由圖5可知，在線蟲(chóng)的同一時(shí)期，F(xiàn)SP處理組的線蟲(chóng)體內(nèi)自發(fā)的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組均有不同程度的降低，所以FSP可以減緩線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素的積累，從而延緩線蟲(chóng)的衰老進(jìn)程。DAPI染色常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)[19]，細(xì)胞形態(tài)的變化如包膜褶皺或出泡，核染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化等都可作為細(xì)胞凋亡的證據(jù)。DAPI染色結(jié)果表明，對(duì)照組中細(xì)胞核染色質(zhì)高度聚集，形態(tài)改變，而FSP一定程度上緩解了細(xì)胞凋亡程度且呈劑量依賴(lài)性。有研究報(bào)道，青錢(qián)柳多糖在線蟲(chóng)生命周期的不同階段均能顯著降低年齡色素的積累[29]。張曉寒等[30]的研究表明，隨著線蟲(chóng)生命的進(jìn)程，機(jī)體衰老導(dǎo)致體內(nèi)脂褐素堆積，根皮素能顯著降低體內(nèi)脂褐素含量，作用效果呈劑量依賴(lài)性，其中75 μg/mL的根皮素脂褐素水平較正常組降低了36.96%。Suetomi等[31]研究表明，在線蟲(chóng)衰老過(guò)程中，伴隨著細(xì)胞失活，凋亡的細(xì)胞在DAPI染色后，呈現(xiàn)亮藍(lán)色，天然的活性物質(zhì)一定程度上會(huì)延緩衰老、緩解細(xì)胞凋亡程度，本研究結(jié)果表明，200 μg/mL的褐藻多糖能夠緩解細(xì)胞凋亡程度。

2.6 FSP對(duì)線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是誘發(fā)衰老的風(fēng)險(xiǎn)因素，線蟲(chóng)抵抗氧化應(yīng)激能力與壽命密切相關(guān)，氧化應(yīng)激會(huì)加速線蟲(chóng)的衰老甚至死亡，這可能是由于氧化劑引起的DNA損傷[32]。線蟲(chóng)壽命的延長(zhǎng)與抗壓能力的增強(qiáng)有關(guān)。為了全面評(píng)價(jià)FSP的抗逆性，測(cè)定了線蟲(chóng)對(duì)氧化應(yīng)激的抗性。H2O2可產(chǎn)生羥基自由基，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞氧化損傷，所以選擇0.1%的H2O2致線蟲(chóng)急性氧化應(yīng)激。由圖6可知，對(duì)照組在氧化應(yīng)激3.5 h時(shí)，線蟲(chóng)已無(wú)存活，但是在4.5 h時(shí)，F(xiàn)SP-M、FSP-H組存活率還為3.3%和6.7%，經(jīng)FSP處理后，生存曲線顯著右移，線蟲(chóng)的平均壽命均顯著（p＜0.05）增加，且與空白對(duì)照組相比分別增加了4.3%、37.2%、62%（表4）。先前研究表明，根皮素可有效保護(hù)線蟲(chóng)抵抗氧化應(yīng)激的影響[30]，且75 μg/mL的根皮素處理后線蟲(chóng)平均壽命延長(zhǎng)了35.96%。

表4 FSP對(duì)線蟲(chóng)氧化應(yīng)激下壽命的影響Table 4 Effect of FSP on longevity of C. elegans under oxidative stress

2.7 FSP對(duì)線蟲(chóng)抗氧化酶活力的影響

抗氧化酶活性及含量直接影響了機(jī)體在氧化損傷中的免疫能力[33]。由圖7可知，線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性和CAT活性均與FSP濃度呈一定的劑量依賴(lài)效應(yīng)關(guān)系。FSP顯著（p＜0.05）增強(qiáng)了SOD和CAT活性。其中FSP-L、FSP-M、FSP-H分別提高SOD活力48.48%、75.91%和82.75%，CAT活性分別增強(qiáng)了58.26%、65.85%和74.95%。結(jié)果表明，F(xiàn)SP通過(guò)促進(jìn)線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶活性清除自由基。先前研究表明，南瓜多糖及其降解產(chǎn)物能顯著提高SOD和CAT等抗應(yīng)激相關(guān)的抗氧化酶活性[34]。Wang等[35]的結(jié)果表明，400 mg/mL的橘皮素能夠顯著（p＜0.05）提高抗氧化酶活性，與對(duì)照組相比，分別提高了2.9倍和2.2倍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200 μg/mL的FSP顯著提高了CAT及SOD活性，與對(duì)照組相比分別提高了1.75倍和1.83倍。

2.8 FSP對(duì)線蟲(chóng)基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步檢測(cè)FSP對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化分子機(jī)制，利用PCR技術(shù)對(duì)（圖8）Insulin/IGF-1信號(hào)通路上關(guān)鍵因子進(jìn)行分析。Insulin/IGF-1信號(hào)通路在調(diào)控線蟲(chóng)衰老中扮演著重要的角色[36]，該通路主要起調(diào)節(jié)作用的信號(hào)基因有daf-2、daf-16和skn-1[37]。在IIS中，轉(zhuǎn)錄因子daf-16是調(diào)控長(zhǎng)壽的關(guān)鍵因子；而其上游基因daf-2可以負(fù)向調(diào)控該通路[38]，當(dāng)daf-2的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制時(shí)，daf-2下游的daf-16在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增加，從而達(dá)到抗壓、延長(zhǎng)壽命的效果[39]。此外，線蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄因子skn-1也可以通過(guò)激活第二階段的解毒反應(yīng)來(lái)抵抗氧化應(yīng)激，而且skn-1延長(zhǎng)壽命的機(jī)制是獨(dú)立于daf-16的[40]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)FSP處理后，線蟲(chóng)體內(nèi)daf-2的基因表達(dá)較對(duì)照組顯著（p＜0.05）下調(diào)，而daf-16和skn-1的基因表達(dá)顯著（p＜0.05）升高，提示FSP通過(guò)下調(diào)daf-2基因和上調(diào)daf-16基因延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命。本研究結(jié)果與大多植物多糖抗衰老作用的機(jī)制相似[41]，F(xiàn)SP通過(guò)調(diào)節(jié)Insulin/IGF-1信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控線蟲(chóng)衰老。

3 結(jié)論

FSP已被證明具有多種生理活性且具有潛在的藥用價(jià)值。以其抗氧化作用為例，本實(shí)驗(yàn)首先研究FSP體外抗氧化活性，隨后研究其在體內(nèi)抗氧化活性。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SP可有效延緩線蟲(chóng)壽命，提升線蟲(chóng)抗氧化酶活性，通過(guò)影響Insulin/IGF信號(hào)通路上關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)而參與了線蟲(chóng)衰老過(guò)程的調(diào)控。綜上，本研究為FSP抗氧化研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為天然抗氧化劑及抗衰老輔助因子的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)，但線蟲(chóng)氧化應(yīng)激分子機(jī)制較為復(fù)雜，更深入的分子水平研究有待進(jìn)一步開(kāi)展。