馮拓，單培，林虹，徐婷，王博，張智宏，高獻(xiàn)禮*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）（2.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東中山 528401）

醬油是起源于我國的一種傳統(tǒng)調(diào)味品，具有悠久歷史，其獨(dú)特的風(fēng)味有助于增添和改善菜肴的味道，深受眾多消費(fèi)者的青睞[1-4]。2020年我國醬油產(chǎn)量7.8×106t，較2019年（6.8×106t）增長14.62%，醬油產(chǎn)銷量恢復(fù)強(qiáng)勁。目前國外先進(jìn)生產(chǎn)設(shè)備和工藝不斷被國內(nèi)醬油企業(yè)采用（如圓盤制曲、高壓短時(shí)蒸煮），企業(yè)生產(chǎn)效率和醬油品質(zhì)得到了一定的提升，但國產(chǎn)醬油二次沉淀問題仍然未得到較好解決[5]。醬油的二次沉淀是指經(jīng)過濾和包裝后的醬油在存儲和銷售的過程中在瓶底形成的一層泥土狀的沉淀[6]。通過實(shí)驗(yàn)室前期研究、超市調(diào)研和醬油生產(chǎn)企業(yè)反饋信息等得出醬油在自然存放3個(gè)月后二次沉淀生成量基本不再增加。二次沉淀雖然不是醬油質(zhì)量的硬性指標(biāo)，但其嚴(yán)重降低了醬油的外觀品質(zhì)，影響醬油的銷售，導(dǎo)致國產(chǎn)醬油在國際市場上競爭力下滑，是困擾我國醬油行業(yè)發(fā)展的重要質(zhì)量問題[5,7]。高獻(xiàn)禮等[5]統(tǒng)計(jì)分析了日本和市售國產(chǎn)醬油二次沉淀，研究發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)醬油二次沉淀含量比日本醬油二次沉淀含量高64%～94%。由于專利和技術(shù)保密的原因，國內(nèi)對日本醬油二次沉淀去除技術(shù)了解不多[7]。

目前，國內(nèi)研究人員已對醬油二次沉淀的組成成分進(jìn)行了初步研究。曾新安等[6]研究表明醬油二次沉淀主要由氯化鈉、蛋白質(zhì)和總糖組成，陳有容等[8]研究表明醬油二次沉淀主要由蛋白質(zhì)、灰分和總糖組成，高獻(xiàn)禮等[9]研究表明醬油二次沉淀主要由氯化鈉、蛋白質(zhì)和總糖組成，張志航等[10]研究表明醬油二次沉淀主要由灰分、蛋白質(zhì)和總糖組成，由此判斷國產(chǎn)醬油二次沉淀的形成可能與蛋白質(zhì)、氯化鈉和總糖等物質(zhì)相關(guān)。曾新安等[6]、高獻(xiàn)禮等[9]、張志航等[11]和孫鵬飛等[12]研究表明谷氨酸是國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白質(zhì)中含量最高的氨基酸，由此推測谷氨酸可能參與了醬油二次沉淀的形成。Tomita等[13]研究顯示日式醬油在60 ℃加熱殺菌過程中可形成促沉因子-谷氨酸丁酯，該酯可促進(jìn)日式醬油形成沉淀，這說明谷氨酸和溫度可能均與醬油二次沉淀形成有關(guān)。乙醇可以使蛋白質(zhì)間正負(fù)電荷結(jié)合力增加，形成厭水性膠體，使蛋白質(zhì)和水間作用力降低，從而使敏感蛋白沉淀；pH值也是影響蛋白質(zhì)溶解度的重要因素，因此，乙醇和pH值可能也與二次沉淀的形成相關(guān)。另外，敏感蛋白和敏感多酚被認(rèn)為是黃酒產(chǎn)生二次沉淀的關(guān)鍵原因，其中敏感蛋白和敏感多酚在鐵離子的催化下形成的敏感蛋白-Fe3+/Fe2+-敏感多酚復(fù)合物是黃酒二次沉淀的主要成分[14]。醬油中同樣也存在較多的Fe3+、Fe2+、蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)，那么醬油中的敏感多酚和敏感蛋白是否也會在鐵離子的催化下形成類似的復(fù)合物？因此，F(xiàn)e3+、Fe2+和多酚也可能是國產(chǎn)醬油產(chǎn)生二次沉淀的重要原因。

目前，國內(nèi)對影響中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀形成的因素及其形成機(jī)制尚未進(jìn)行深入研究。Gao等[15]分析了國產(chǎn)高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀蛋白的主要成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀蛋白的主要成分為大豆11S球蛋白G4蛋白中的B3亞基（76%）和G1蛋白中的A1a亞基（19%），這兩種亞基高比例的“有序”二級結(jié)構(gòu)和強(qiáng)疏水性導(dǎo)致其溶解度低，這是導(dǎo)致醬油形成二次沉淀的誘因。醬油二次沉淀中還含有大量的多糖、NaCl、多酚和少量氨基酸，說明醬油二次沉淀成分和形成機(jī)制比較復(fù)雜，其具體形成機(jī)制仍需深入研究。

由于醬油中B3亞基的定性和定量測定需要電泳、質(zhì)譜等高檔設(shè)備和有毒試劑（如巰基乙醇），且測定過程耗時(shí)。因此直接建立B3亞基與醬油二次沉淀形成量的關(guān)系在具體操作上存在困難。本研究基于軟測量思路，通過保持使用同種醬油且不外加大豆蛋白以保證醬油中B3亞基的量恒定，對各種預(yù)處理后醬油二次沉淀生成量及與二次沉淀生成量相關(guān)指標(biāo)的分析，構(gòu)建一種具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的醬油二次沉淀預(yù)測模型，以期幫助醬油企業(yè)提前發(fā)現(xiàn)二次沉淀生成量多的醬油，避免其流入市場，也為解決高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

高鹽稀態(tài)醬油由廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司提供（使用日期與生產(chǎn)日期間隔不超過一周），醬油瓶底均無肉眼可見的二次沉淀。

可溶性大豆多糖購于河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司。三氯化鐵、二氯化亞鐵、亞鐵氰化鉀、三氯乙酸、鄰菲羅啉、鹽酸羥胺、甲醛、乙醇、氯化鈉、沒食子酸、鹽酸、硫酸、硼酸、硫酸銅、硝酸銀、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉等均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；EX223型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ULTS1368超低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；氣相色譜儀，美國安捷倫公司；5415D高速離心機(jī)，德國艾本德股份公司；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；WFZ UV-2100紫外分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

通過對同一種醬油樣品（廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司提供，理化指標(biāo)見表1）調(diào)節(jié)不同的pH值（使用0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH調(diào)節(jié)）和溫度，外加三氯化鐵、二氯化亞鐵、可溶性大豆多糖、沒食子酸、氯化鈉、乙醇、谷氨酸改變醬油中鐵離子、亞鐵離子、多糖、多酚、氯化鈉、乙醇和谷氨酸的濃度，每個(gè)變量分別設(shè)置4～5個(gè)梯度，共38種樣品。

1.3.2 二次沉淀的收集和制備

參照文獻(xiàn)[9]的方法收集和制備醬油二次沉淀，并做如下修改：經(jīng)過處理結(jié)束后的醬油在0 ℃和5000 r/min條件下離心15 min，采用虹吸法移除上清，收集沉淀；將收集的沉淀冷凍干燥后計(jì)算出醬油二次沉淀生成量。

1.3.3 高鹽稀態(tài)醬油常規(guī)理化指標(biāo)的測定

1.3.3.1 pH的測定

pH采用pH計(jì)直接測定。

1.3.3.2 鐵離子和亞鐵離子的測定

根據(jù)王遷[16]的方法稍加修改，將醬油樣品適當(dāng)稀釋以使其中總鐵離子含量小于1 mg/L后，采用鄰菲羅啉分光光度法測定其中的亞鐵離子含量；用10%鹽酸羥胺將稀釋樣品中的鐵離子還原成亞鐵離子，即可測定其中的總鐵離子含量，用總鐵離子含量減去亞鐵離子含量即為鐵離子含量，使用具有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。

1.3.3.3 多酚的測定

參照Xu等[17]的方法略作修改用以測定醬油中的總酚含量。使用沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，并根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算醬油中的總酚含量，該結(jié)果以g gallic acid equivalent/100 mL（g GAE/100 mL）醬油表示。

1.3.3.4 多糖的測定

參照吳清吟[18]的方法稍加修改，采用Sevage法脫除醬油中的蛋白，進(jìn)而醇沉得到沉淀物，將沉淀物冷凍干燥后得到粗多糖，將其配制成粗多糖溶液后，采用苯酚-硫酸法測定其中的多糖含量，使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品來對多糖進(jìn)行定量。

1.3.3.5 氯化鈉的測定

參照GB/T 5009.39-2003，采用醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法中的沉淀滴定法來測定醬油中氯化鈉的含量。

1.3.3.6 乙醇的測定

在Liu等[19]的方法基礎(chǔ)上稍加修改，采用氣相色譜法來測定醬油中乙醇的含量，該結(jié)果以g/100 mL醬油表示。

1.3.3.7 谷氨酸的測定

根據(jù)Gao等[20]的方法稍加修改來測定醬油中谷氨酸的含量。將醬油樣品用10 g/100 mL三氯乙酸等體積稀釋，再用0.45 μm孔徑的微孔過濾器過濾，通過柱前衍生化后上機(jī)分析。采用PICO·TAG氨基酸分析柱（3.9 mm×150 mm），測定波長為254 nm，溫度為38 ℃，洗脫液流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，采用外標(biāo)法對谷氨酸進(jìn)行定量。

1.3.4 二次沉淀模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

以同一種醬油為研究對象，經(jīng)由不同預(yù)處理后，測得處理后各樣品的各項(xiàng)理化指標(biāo)和存放3個(gè)月后的二次沉淀生成量，利用SPSS 18.0軟件對多樣品的各項(xiàng)理化指標(biāo)和二次沉淀生成量進(jìn)行Person相關(guān)性分析，得出與醬油二次沉淀生成量顯著相關(guān)的指標(biāo)?；谲洔y量思想（應(yīng)用軟件等計(jì)算機(jī)技術(shù)對暫時(shí)不能測量或難以測量的重要變量，選擇另外一些相對容易測量的變量，通過構(gòu)成某種數(shù)學(xué)關(guān)系來估計(jì)或推斷[21]），對與二次沉淀生成量顯著相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行多元線性回歸分析，得出方程，以此構(gòu)建醬油二次沉淀預(yù)測模型。選取20種不同醬油測定其最初理化指標(biāo)（pH值、鐵離子、亞鐵離子、多酚、多糖、氯化鈉、乙醇、谷氨酸和溫度）和存放3個(gè)月的二次沉淀生成量以驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測定3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示各測定數(shù)據(jù)。利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行Person相關(guān)性分析和多元線性回歸分析以建立高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀預(yù)測模型。

2 結(jié)果討論

2.1 預(yù)處理前高鹽稀態(tài)醬油理化指標(biāo)的測定結(jié)果

由表1可知，在進(jìn)行處理前，該高鹽稀態(tài)醬油的pH值為4.56，鐵離子濃度為26.03 mg/L，亞鐵離子濃度為25.86 mg/L，多酚濃度為0.28 g/100 mL，多糖濃度為6.11 g/100 mL，氯化鈉濃度為16.20 g/100 mL，乙醇濃度為0.31 g/100 mL，谷氨酸濃度為0.56 g/100 mL，溫度為16.2 ℃。

表1 預(yù)處理前醬油理化指標(biāo)的測定結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical indexes in soy sauce before pretreatment

林耀盛等[22]測定了30種市售醬油的pH值，結(jié)果顯示30種市售醬油的pH值范圍為4.01～5.18，本研究所測pH值在其中，且符合中式高鹽稀態(tài)醬油正常的pH值范圍。

郭壯等[23]從市場上挑選了33種生抽醬油，并測定了其中的氯化鈉含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)33種醬油樣品的氯化鈉含量在3.79～19.03 g/100 mL，本研究所測氯化鈉含量在此范圍內(nèi)，中式高鹽稀態(tài)醬油在發(fā)酵階段時(shí)醬醪的鹽濃度一般在17%～18%，使醬醪中的多種微生物更好地生長代謝，在出油階段，一部分鹽會隨著醬油渣從醬油中分離出來，從而使醬油中的鹽分含量降低，本研究所測的高鹽稀態(tài)醬油的氯化鈉含量為16.20 g/100 mL，符合中式高鹽稀態(tài)醬油正常的氯化鈉含量范圍。

吳清吟[18]采用低鹽固態(tài)發(fā)酵方式釀造含海帶的醬油，測得其中粗多糖含量的均值為0.473 g/100 mL，遠(yuǎn)低于本研究的6.11 g/100 mL，可能原因在于本研究所選的醬油采用的是高鹽液態(tài)發(fā)酵方式，且發(fā)酵周期一般為3～6個(gè)月，但吳清吟[18]采用的是低鹽固態(tài)發(fā)酵方式，發(fā)酵30 d，發(fā)酵周期的縮短以及較低的液料比可能不利于多糖的溶出及淀粉的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致其所釀造醬油中多糖含量偏低。

蔣瑾華等[24]測定了強(qiáng)化醬油（添加了鐵的營養(yǎng)強(qiáng)化劑的醬油）樣品中的鐵含量，結(jié)果顯示強(qiáng)化醬油中鐵含量的范圍為120～230 mg/kg，遠(yuǎn)高于本研究所測總鐵離子含量，原因可能是本研究所選的高鹽稀態(tài)醬油沒有額外添加鐵的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，其中的鐵離子和亞鐵離子僅來源于釀造原料，從而導(dǎo)致所測得的鐵含量較低。

Gao等[25]測定了發(fā)酵醬油中的總酚含量，結(jié)果顯示未經(jīng)過超聲處理與經(jīng)過超聲處理的醬油的總酚含量分別為1.61、2.04 mg GAE/mL，張歡歡等[26]研究表明經(jīng)過150 d的發(fā)酵的黑豆醬油和黃豆醬油的總酚含量分別為550.75、344.22 mg/100 mL，本研究所測多酚含量介于Gao等[25]和張歡歡等[26]所測多酚含量之間，可能是由于醬油種類及鹽水比例不同而導(dǎo)致測量結(jié)果的差異。

劉曉艷等[27]采用氣相色譜法測定了5種市售醬油中的乙醇含量，結(jié)果顯示5種醬油樣品中乙醇含量在479.60～4809.33 mg/L之間，莫允煥等[28]采用了3種分析方法來測定醬油樣品中的乙醇含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用分光光度法、氣相色譜法和蒸餾測相對密度法所測醬油樣品中乙醇含量范圍分別為0.65%～2.17%（日式醬油）、0.60%～2.10%（日式醬油）和0.59%～2.09%（日式醬油），可以看出中式醬油中乙醇含量均顯著低于日式醬油，原因可能在于在醬醪發(fā)酵階段，日式醬油會人為添加酵母菌，而傳統(tǒng)中式醬油不人為添加酵母菌，而酵母菌會在無氧的環(huán)境下將葡萄糖分解為乙醇和CO2，從而導(dǎo)致日式醬油的乙醇含量顯著高于中式高鹽稀態(tài)醬油[29-31]。

Gao等[31]測定了發(fā)酵醬油中的谷氨酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超聲處理與未經(jīng)過超聲處理的醬油中谷氨酸含量分別為5.75、5.95 g/L，與本研究所測谷氨酸含量基本相當(dāng)。

2.2 預(yù)處理后高鹽稀態(tài)醬油理化指標(biāo)的測定結(jié)果

由表2可知，高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量隨pH值的升高而下降，說明高鹽稀態(tài)醬油中可能含有較多“酸不穩(wěn)定性物質(zhì)”或“酸不溶性物質(zhì)”，隨著醬油pH值的降低，這些物質(zhì)可能會越來越不穩(wěn)定，進(jìn)而析出并與其他物質(zhì)聚合形成二次沉淀。

表2 預(yù)處理后醬油中理化指標(biāo)的測定結(jié)果Table 2 Determination results of physicochemical indexes in soy sauce after pretreatment

高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量隨溫度的升高呈現(xiàn)先下降（20 ℃）后上升（60 ℃）的趨勢，并在溫度達(dá)到60 ℃時(shí)有顯著的上升，原因在于溫度上升到60 ℃后，中式高鹽稀態(tài)醬油中可能也生成了類似于谷氨酸丁酯的促沉因子，促使中式高鹽稀態(tài)醬油形成沉淀[13]。

乙醇含量在0.31～2.13 g/100 mL時(shí)對高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀的生成無顯著影響，日式醬油的乙醇含量能夠達(dá)到1.5%～2.1%，中式醬油的乙醇含量一般低于0.5%，但中式醬油二次沉淀含量比日式醬油二次沉淀含量高64%～94%，顯然，低濃度的乙醇可能不是造成高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成的主要因素，相反，低濃度的乙醇能夠與其他醇類共同賦予醬油醇香的味道。同時(shí)乙醇在微生物和氧氣作用下可轉(zhuǎn)化為多種酸、酮、醛、醇等物質(zhì)，從而形成醬油獨(dú)特的風(fēng)味[3,5]。

此外，高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量均隨鐵離子、亞鐵離子、多酚、多糖、氯化鈉和谷氨酸含量的升高而增加，其中鐵離子比亞鐵離子對醬油二次沉淀生成量的影響更大，多項(xiàng)研究表明，國產(chǎn)醬油二次沉淀主要由蛋白質(zhì)、氯化鈉和總糖等物質(zhì)構(gòu)成[6,8-10]，且二次沉淀蛋白質(zhì)中均含谷氨酸[6,9,11,12]，另外，鐵離子和多酚含量會影響黃酒二次沉淀的生成[14]，而醬油也是發(fā)酵產(chǎn)品的一種，同是膠體溶液，同樣含有較多的亞鐵離子、鐵離子和多酚，且亞鐵離子會在氧氣的影響下會生成鐵離子，使醬油中的鐵離子含量升高，由此可以推斷出醬油中二次沉淀生成量可能與其中多糖、氯化鈉、谷氨酸、亞鐵離子、鐵離子和多酚含量有關(guān)。

續(xù)表2

2.3 二次沉淀生成量與各變量之間的相關(guān)性分析結(jié)果

對測定所得到的38種醬油樣品的二次沉淀生成量（Y，g/L）與各理化指標(biāo)［pH值（X1）、鐵離子含量（X2，mg/L）、亞鐵離子含量（X3，mg/L）、多酚含量（X4，g GAE/100 mL）、多糖含量（X5，g/100 mL）、氯化鈉含量（X6，g/100 mL）、乙醇含量（X7，g/100 mL）、谷氨酸含量（X8，g/100 mL）、溫度（X9，℃）］之間進(jìn)行Person相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。

表3 二次沉淀生成量與各變量之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of secondary precipitation production and variables

由表3可知，與二次沉淀生成量相關(guān)性最顯著的是pH值，呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.454，p＜0.01），其次依次為多酚含量（r=0.396，p＜0.05），氯化鈉含量（r=0.381，p＜0.05）和鐵離子含量（r=0.341，p＜0.05），均呈現(xiàn)為顯著正相關(guān)；而二次沉淀生成量與亞鐵離子含量、多糖含量、乙醇含量、谷氨酸含量和溫度之間的相關(guān)性不顯著。馮拓等[32]研究發(fā)現(xiàn)除乙醇（＜1.8%）外，pH、Fe3+/Fe2+、多酚、大豆多糖、大豆蛋白酶解物、NaCl和溫度均對中式高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀生成量具有顯著影響（p＜0.05），與本研究結(jié)果有所差異，一方面，由于本研究為保證醬油中B3亞基的量恒定而沒有外加大豆蛋白或大豆蛋白酶解物，故二次沉淀生成量與大豆蛋白酶解物含量之間的相關(guān)性沒有體現(xiàn)出來；另一方面，由于馮拓等[32]對醬油的處理方式（將醬油樣品預(yù)處理后置于搖床中，在200 r/min、50 ℃的條件下震蕩7 d，使?jié)撛诘摹岸纬恋怼笨焖傩纬桑┡c本研究的（將醬油樣品預(yù)處理后自然存放3個(gè)月）有所不同，從而導(dǎo)致二次沉淀生成量與亞鐵離子含量、多糖含量和溫度之間的關(guān)系有所差異。

高獻(xiàn)禮等[5]研究發(fā)現(xiàn)醬油二次沉淀的生成與醬油中總糖含量呈顯著正相關(guān)，與醬油的pH值、還原糖、氯化鈉、氨基酸態(tài)氮含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相關(guān)性，可能在于高獻(xiàn)禮等[5]并未對25種市售醬油進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)處理，以致于這些醬油的pH值、氯化鈉含量、多糖含量和相關(guān)氨基酸含量均保持在不足以使醬油產(chǎn)生大量二次沉淀的范圍內(nèi)。

林峰等[33]研究表明黃酒中二次沉淀生成的機(jī)理主要有鐵沉淀、蛋白質(zhì)沉淀和氧化沉淀，其中參與沉淀的物質(zhì)主要有多酚、蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)以及鐵等金屬元素。Prakash等[34]研究了波爾多紅酒沉淀的基本組成及形成機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)波爾多紅酒沉淀的主要成分包括酒石酸鉀、多酚、多糖、有機(jī)酸和游離氨基酸，且酒石酸鉀很容易在葡萄酒沉淀的早期階段結(jié)晶析出，而多酚、多糖、氨基酸和甘油則參與了進(jìn)一步沉淀的形成。由此，不難看出同為發(fā)酵產(chǎn)品的黃酒和葡萄酒在二次沉淀的形成上有諸多相似之處。

基于2.2，并結(jié)合上述研究，醬油二次沉淀形成的機(jī)制可能是隨著存放時(shí)間的延長，醬油的pH值顯著改變，醬油原本穩(wěn)定的體系被打破，同時(shí)醬油中存在的溶解氧氧化亞鐵離子生成鐵離子從而使醬油中的鐵離子含量顯著上升，而醬油中富含的蛋白和多酚在鐵離子的催化下生成類似于黃酒中敏感蛋白-Fe3+/Fe2+-敏感多酚的復(fù)合物，而該復(fù)合物在沉降的過程中可能會由于共沉淀效應(yīng)而吸附氯化鈉等物質(zhì)，從而形成二次沉淀，當(dāng)醬油中的這些物質(zhì)達(dá)到一定濃度后，二次沉淀基本無法繼續(xù)產(chǎn)生，這可能也是醬油在自然存放3個(gè)月后二次沉淀生成量基本不再增加的主要原因。

因此選取與二次沉淀生成量極顯著相關(guān)的pH值以及顯著相關(guān)的多酚含量、氯化鈉含量和鐵離子含量為相關(guān)指標(biāo)，建立預(yù)測醬油存放3個(gè)月后二次沉淀生成量的模型。

2.4 高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀多元線性回歸預(yù)測模型的建立

通過對醬油樣品二次沉淀生成量與各常規(guī)指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，選取與二次沉淀生成量顯著相關(guān)的指標(biāo)，采用SPSS軟件進(jìn)行多元線性回歸分析，建立預(yù)測醬油存放3個(gè)月后二次沉淀生成量的模型。模型的方差分析結(jié)果如表4所示，模型的F檢驗(yàn)值為16.761，p=0.000＜0.01，呈極顯著水平，即符合統(tǒng)計(jì)學(xué)中的要求。

表4 模型的方差分析Table 4 Variance analysis of the model

根據(jù)上文對經(jīng)過各種預(yù)處理后醬油的二次沉淀生成量與各理化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果，選取與二次沉淀生成量極顯著相關(guān)的pH值以及顯著相關(guān)的多酚含量、氯化鈉含量和鐵離子含量為模型自變量，以存放3個(gè)月后的醬油二次沉淀生成量為因變量，建立多元線性回歸方程，預(yù)測存放3個(gè)月后醬油的二次沉淀生成量，模型的回歸參數(shù)如表5所示，常量為3.120，X1的系數(shù)為-0.734，X2的系數(shù)為0.014，X4的系數(shù)為2.086，X6的系數(shù)為0.150。最終模型的回歸方程如下式（1）所示。

表5 建立模型的回歸參數(shù)分析Table 5 Coefficient analysis of the regression model

式中：

Y——二次沉淀生成量，g/L；

X1——pH值；

X2——鐵離子，mg/L；

X4——多酚，g GAE/100 mL；

X6——氯化鈉，g/100 mL。

2.5 高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀模型的驗(yàn)證

選取20種市售醬油（生產(chǎn)時(shí)間和使用時(shí)間不超過一周），并對其中部分醬油進(jìn)行處理，使其在pH值、鐵離子含量、多酚含量和氯化鈉含量等指標(biāo)在一定的合理范圍內(nèi)有較大的差異。由表6可知，在存放3個(gè)月后，20種醬油樣品的二次沉淀程度不盡相同：5%的醬油樣品無明顯二次沉淀，20%的醬油樣品可見明顯二次沉淀，50%的醬油樣品有嚴(yán)重的二次沉淀，25%的醬油樣品有非常嚴(yán)重二次沉淀。上述結(jié)果意味著在醬油存放3個(gè)月后，約75%的醬油瓶底會出現(xiàn)較多泥土狀的沉淀，嚴(yán)重降低了醬油的外觀品質(zhì)，影響醬油的銷售。

表6 高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀預(yù)測模型的驗(yàn)證Table 6 Validation of predictive model for the secondary precipitate in high-salt diluted-state soy sauce

在本研究中，將高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀程度共分為4個(gè)等級：無明顯二次沉淀、可見明顯二次沉淀、嚴(yán)重二次沉淀及非常嚴(yán)重二次沉淀。為了更好地將二次沉淀生成量與二次沉淀的程度情況對應(yīng)起來，對表6中二次沉淀生成量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類，結(jié)果見表7所示。

表7 醬油二次沉淀程度分類Table 7 Classification of secondary precipitate degree in soy sauce

將各數(shù)據(jù)代入高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀模型給出的回歸方程，計(jì)算出醬油存放3個(gè)月二次沉淀量的預(yù)測值，與實(shí)際測得的二次沉淀生成量進(jìn)行分析比較，以驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確程度。由圖1可知，醬油存放3個(gè)月的二次沉淀生成量的預(yù)測值與實(shí)測值具有較好的對應(yīng)性（R2=0.8517）。

3 結(jié)論

本研究通過對同一種醬油進(jìn)行預(yù)處理，測定處理之后的38種醬油樣品的pH值、鐵離子、亞鐵離子、多酚、多糖、乙醇、谷氨酸、溫度等常規(guī)指標(biāo)，利用SPSS 18.0軟件分析醬油二次沉淀生成量與各指標(biāo)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二次沉淀生成量（Y，g/L）與pH值（X1）極顯著相關(guān)，與鐵離子含量（X2，mg/L）、多酚含量（X4，g GAE/100 mL）和氯化鈉含量（X6，g/100 mL）顯著相關(guān)，并以此為基礎(chǔ)利用SPSS 18.0軟件構(gòu)建了它們之間的多元線性回歸方程，方程為Y=3.120-0.734X1+0.014X2+2.086X4+0.150X6。該方程用于預(yù)測存放3個(gè)月后醬油二次沉淀生成量的結(jié)果表明，預(yù)測值與實(shí)測值具有較好的對應(yīng)性（R2=0.8517）。該預(yù)測模型有助于提前發(fā)現(xiàn)會產(chǎn)生嚴(yán)重二次沉淀的醬油，避免其流入市場，這對醬油企業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展及提高國產(chǎn)醬油在國際市場上競爭力具有重要意義。