陳曦冉，張鵬，賈曉昱，李江闊

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

（2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所，國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）為獼猴桃科獼猴桃屬的漿果類水果，果皮光滑細(xì)膩，果肉味美多汁，同時(shí)富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中維生素C含量遠(yuǎn)高于其他類型水果[1,2]。軟棗獼猴桃若在貯藏期間活性氧代謝受到破壞，果實(shí)內(nèi)自由基大量累積，引起細(xì)胞膜脂過氧化，加速植物細(xì)胞衰老，引起品質(zhì)下降[3-5]。因此，維持活性氧代謝平衡是保持軟棗獼猴桃品質(zhì)的重要因素。此前，研究者們主要采用氣調(diào)貯藏、低溫貯藏、UV-C輻照、水楊酸、1-MCP熏蒸等[6-10]物理或化學(xué)方法，來(lái)延緩軟棗獼猴桃品質(zhì)下降。

1-MCP作為一種無(wú)毒高效的乙烯受體抑制劑[11]，優(yōu)先與乙烯受體發(fā)生不可逆的結(jié)合，抑制內(nèi)源乙烯的正常作用，進(jìn)而達(dá)到延緩果實(shí)衰老的目的[12,13]。Li等[14]發(fā)現(xiàn)，用1-MCP浸泡芒果可以推遲乙烯和呼吸速率高峰的出現(xiàn)，誘導(dǎo)POD、CAT和SOD的活性。另外，1-MCP處理可以提高黑莓的抗氧化酶活性[15]。Xu等[16]研究表明，1-MCP可以減少獼猴桃貯藏期間的腐爛率，保持果實(shí)硬度的同時(shí)不同程度的提高APX、SOD和CAT活性。安容慧等[17]采用1-MCP對(duì)娃娃菜進(jìn)行熏蒸處理，發(fā)現(xiàn)可以抑制MDA、H2O2和O2-·的增加，提高POD、CAT、SOD和GR的活性。軟棗獼猴桃屬于呼吸躍變型果實(shí)，乙烯對(duì)貯藏期間品質(zhì)的影響較大[18,19]，而1-MCP在抑制乙烯生成的同時(shí)延緩果實(shí)軟化進(jìn)程[20]，可以減少果實(shí)組織中自由基的積累，延緩果實(shí)的成熟與衰老，維持果實(shí)較好的品質(zhì)。

目前，1-MCP處理采后獼猴桃的研究多集中在維持鮮果品質(zhì)方面，但針對(duì)其在軟棗獼猴桃活性氧代謝相關(guān)變化的研究較少。因此，本文研究了1-MCP處理對(duì)軟棗獼猴桃冰溫貯藏期間抗氧化及活性氧代謝的影響，為軟棗獼猴桃的貯藏保鮮提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃于2020年9月22日采摘自遼寧省丹東市，品種為“龍成二號(hào)”，挑選個(gè)體均一、無(wú)傷病、成熟度（可溶性固形物含量6.5%～7.0%）一致的果實(shí)進(jìn)行處理。小籃（長(zhǎng)×寬×高=17.5 cm×10 cm×11 cm），寧波國(guó)嘉農(nóng)產(chǎn)品保鮮包裝技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PE袋（長(zhǎng)×寬=35 cm×45 cm，厚度34 μm）、1-MCP便攜包，國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津）提供。

氫氧化鈉、草酸、EDTA、偏磷酸醋酸、硫酸、鉬酸銨、三氯乙酸，天津市江天化工有限公司；二硫蘇糖醇、TritionX-100、硫代巴比妥酸，上海麥克林生化科技有限公司；磷酸氫二納、磷酸二氫鈉、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、愈創(chuàng)木酚、30% H2O2，天津市大茂化學(xué)試劑廠；以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；生理鹽水，石家莊四藥有限公司；O2-·試劑盒、H2O2試劑盒、SOD試劑盒、GR試劑盒、GSSG試劑盒、GSH試劑盒，南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma3-30K型高速離心機(jī)，德國(guó)SIGMA離心機(jī)有限公司；Check PiontⅡ便攜式測(cè)氧儀，丹麥Dansensor公司；F-900便攜式乙烯分析儀，美國(guó)FELIX儀器公司；DDS-307A型電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器儀表有限公司；SynergyH1全功能微孔板檢測(cè)儀酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；TU-1810ASPC紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-1恒溫水浴鍋，金壇市金南儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

果實(shí)園內(nèi)采摘后進(jìn)行篩選，在基地冷庫(kù)內(nèi)預(yù)冷并處理，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)處理，CK組不進(jìn)行處理，將分裝成籃的果實(shí)直接裝入PE袋中，封口將其扎緊；1-MCP組將分裝成籃的果實(shí)裝入PE袋內(nèi)，采用1.0 μL/L濃度的1-MCP便攜包密封處理12 h。隨后采用冷鏈物流車（0～4 ℃）12 h內(nèi)運(yùn)回天津?qū)嶒?yàn)室，在冰溫庫(kù)內(nèi)（-0.5±0.3 ℃）開袋預(yù)冷12 h后封口進(jìn)行貯藏。每組處理軟棗獼猴桃各15籃，每籃約2.2 kg，測(cè)定周期為60 d，每15 d各拿出三籃果實(shí)測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 呼吸強(qiáng)度、乙烯生成速率

呼吸強(qiáng)度采用靜置法[21]測(cè)定。

乙烯生成速率參照張鵬等[22]方法。

1.4.2 O2-·活性、H2O2和MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

O2-·活性采用試劑盒（比色法）測(cè)定，結(jié)果以U/g prot表示。

H2O2含量采用試劑盒（比色法）測(cè)定，結(jié)果以mmol/g prot表示。

MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法[23]測(cè)定。

相對(duì)電導(dǎo)率使用電導(dǎo)率儀測(cè)定，稱取果皮0.5 g加入50 mL去離子水，震蕩立即測(cè)定P0；靜置30 min后測(cè)定P1；沸水浴15 min冷卻至室溫測(cè)定P2。

1.4.3 SOD、CAT、POD、APX活性測(cè)定

SOD活性采用試劑盒（羥胺法）測(cè)定，結(jié)果以U/mg prot表示。

CAT活性參照王艷穎等[24]方法稍作改動(dòng)。

POD和APX活性參照曹建康等[25]方法。

1.4.4 GR活性及AsA、GSSG、GSH含量測(cè)定

GR活性采用試劑盒（紫外比色法）測(cè)定，結(jié)果以U/g prot表示。

AsA含量采用鉬藍(lán)比色法[26]測(cè)定。

GSSG含量采用試劑盒（微量酶標(biāo)法）測(cè)定，結(jié)果以μmol/L表示。

GSH含量采用試劑盒（分光光度法）測(cè)定，結(jié)果以mg/g prot表示。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總處理與分析，SPSS 19.0進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著，SMICA 14.1進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），檢驗(yàn)其相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-MCP處理對(duì)軟棗獼猴桃呼吸強(qiáng)度、乙烯生成速率的影響

呼吸是果實(shí)采后的基本代謝活動(dòng)。由圖1a可知，軟棗獼猴桃呼吸強(qiáng)度呈先上升后下降的趨勢(shì)，處理組一直處于較低水平，0～15 d上升速度較快，15 d出現(xiàn)呼吸高峰，對(duì)照組為92.09 mg/(kg·h)，處理組為78.29 mg/(kg·h)。1-MCP處理保持較低的果實(shí)呼吸強(qiáng)度，減少貯藏期間果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，維持貯藏期品質(zhì)，姜毅等[27]的研究發(fā)現(xiàn)1.5 μL/L 1-MCP可以有效抑制兩種無(wú)花果的呼吸強(qiáng)度并且推遲呼吸高峰的出現(xiàn)，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

乙烯是可以促進(jìn)果實(shí)衰老的內(nèi)源激素。如圖1b所示，在貯藏期間，獼猴桃乙烯呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，0～30 d時(shí)乙烯生成速率增加緩慢，45 d時(shí)各處理達(dá)到最大值，隨后又快速下降，在貯藏60 d時(shí)，對(duì)照組乙烯生成速率為3.08 μL/(kg·h)，是處理組的1.3倍。1-MCP能夠顯著（p＜0.05）抑制乙烯生成速率，可能是因?yàn)?-MCP率先與乙烯受體結(jié)合，從而減少果實(shí)乙烯的生成。

2.2 1-MCP處理對(duì)軟棗獼猴桃O2-·活性、H2O2、MDA含量及相對(duì)電導(dǎo)率的影響

O2-·過度積累會(huì)對(duì)植物造成嚴(yán)重的損害。由圖2a可知，在整個(gè)貯藏期間果實(shí)O2-·活性逐漸升高，0 d時(shí)O2-·活性為350.47 U/g prot，60 d時(shí)對(duì)照組O2-·活性上升到863.81 U/g prot，上升幅度為146.47%，處理組O2-·活性為699.62 U/g prot，漲幅為99.62%。貯藏期間處理組O2-·活性顯著（p＜0.05）低于對(duì)照組，說(shuō)明1.0 μL/L 1-MCP處理抑制O2-·效果好，降低對(duì)果實(shí)的傷害。林靜穎等[28]研究也表明，1-MCP處理可以抑制“油?”果實(shí)O2-·生成速率，提高其貯藏品質(zhì)。

過多的H2O2影響正常的細(xì)胞代謝。由圖2b可知，果實(shí)H2O2含量在0～45 d上升緩慢，60 d大幅度升高，此時(shí)對(duì)照組含量為230.17 mmol/g prot，為處理組的1.47倍。統(tǒng)計(jì)分析表明，處理組果實(shí)組織中的H2O2含量顯著（p＜0.05）低于對(duì)照組，說(shuō)明1.0 μL/L 1-MCP處理有效降低H2O2的生成。

MDA含量可以反應(yīng)細(xì)胞膜脂過氧化程度。由圖2c可知，在果實(shí)貯藏的60 d內(nèi)，MDA含量呈直線上升，0～30 d各組處理間的差異不明顯，45 d兩組處理MDA含量大幅度升高，但處理組上升幅度較小。60 d兩組處理同樣繼續(xù)升高，并且達(dá)到最大值，此時(shí)對(duì)照組含量為1.89 nmol/g為處理組的1.39倍，差異顯著（p＜0.05）。這表明，1-MCP處理可以抑制軟棗獼猴桃果實(shí)組織內(nèi)MDA增加，減緩貯藏期果實(shí)細(xì)胞膜的破壞程度。

相對(duì)電導(dǎo)率的大小可以描述果蔬組織衰老伴隨著細(xì)胞膜通透性增加的程度。如圖2d所示，貯藏期間相對(duì)電導(dǎo)率不斷上升，0～15 d各組處理差異較小，30 d后處理效果顯著（p＜0.05），60 d時(shí)對(duì)照組為48.00%，處理組為33.36%。處理組的相對(duì)電導(dǎo)率上升較慢，說(shuō)明1-MCP對(duì)貯藏期間果實(shí)胞膜衰老有抑制作用，維持細(xì)胞微環(huán)境和正常的生理代謝，這與徐冬穎等[29]對(duì)軟棗獼猴桃的研究結(jié)果一致，1-MCP可以有效抑制果實(shí)膜脂損傷，降低貯藏期MDA含量及相對(duì)電導(dǎo)率的增長(zhǎng)。

2.3 1-MCP處理對(duì)軟棗獼猴桃SOD、CAT、POD、APX活性的影響

SOD分布于高等植物葉綠體、線粒體中，可以清除并催化組織中的O2-·轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2。由圖3a可知，在貯藏0～15 d時(shí)SOD含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，隨后開始小幅度升高再繼續(xù)下降，60 d時(shí)對(duì)照組和處理組SOD含量分別為280.18 U/mg prot和323.87 U/mg prot，且整個(gè)貯藏期處理組的SOD含量均顯著（p＜0.05）高于對(duì)照組，這與曹森等[30]對(duì)“東紅”獼猴桃的研究結(jié)果一致。

CAT可以將H2O2催化分解為對(duì)果實(shí)無(wú)害的H2O和O2。CAT活性先升高再減少，0～15 d兩組差異不明顯，30 d活性達(dá)到峰值，此時(shí)對(duì)照組為40.56 U/g，處理組為55.19 U/g，隨后開始下降，貯藏末期處理組CAT活性較對(duì)照組高12.22 U/g。說(shuō)明1-MCP處理可以維持軟棗獼猴桃較高的CAT活性，延緩其活性的下降，差異顯著（p＜0.05）。杜林笑等[31]的研究發(fā)現(xiàn)在貯藏末期1-MCP處理的庫(kù)爾勒香梨CAT活性顯著高于對(duì)照組，這與本研究結(jié)果相似。

貯藏期間POD活性與CAT活性相同呈先上升后下降的趨勢(shì)（圖3c），1-MCP可以促進(jìn)其活性的升高并且延緩下降，15 d時(shí)對(duì)照組與處理組POD活性分別為0.61、0.70 U/g，隨后果實(shí)POD活性開始逐漸下降。0～60 d處理組POD活性顯著（p＜0.05）高于對(duì)照組，說(shuō)明1-MCP對(duì)于維持POD活性有較好的作用。

由圖3d可知，APX活性與POD、CAT活性變化相同，呈現(xiàn)升高再降低的趨勢(shì)。在貯藏15 d時(shí)處理組APX活性達(dá)到高峰，隨后開始下降，60 d時(shí)處理組APX活性下降為3.78 U/g，比對(duì)照組高2.67 U/g?？梢?-MCP處理可以保持軟棗獼猴桃較高的APX活性，提高APX抗氧化酶的活性。這與Xu等[32]采用1-MCP處理對(duì)獼猴桃的研究結(jié)果一致。

2.4 1-MCP處理對(duì)軟棗獼猴桃GR活性、AsA、GSSG、GSH含量的影響

GR可以維持組織中充足的GSH水平。GR活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，貯藏15 d時(shí)對(duì)照組活性較高，30 d兩組處理GR活性開始降低，但處理組下降速度較慢，貯藏中后期處理組GR活性顯著（p＜0.05）高于對(duì)照組，60 d時(shí)為0.12 U/g prot，是對(duì)照組的2.40倍。結(jié)果表明1-MCP可有效維持軟棗獼猴桃較高的GR活性，楊乾等[33]的研究也證實(shí)了水楊酸處理可以維持甜瓜較高的GR活性。

AsA是重要的抗氧化劑可以直接清除H2O2。如圖4b所示，在整個(gè)貯藏期間AsA含量先上升后下降，0～15 d各組AsA含量相差較小，處理組在30 d出現(xiàn)最大值，較對(duì)照組晚15 d，此時(shí)AsA含量為75.88 mg/100 g，30 d后AsA含量開始大幅度下降，但處理組含量始終顯著（p＜0.05）高于對(duì)照組。由此可見，1-MCP可以減少貯藏期間果實(shí)AsA含量的消耗，侯佳迪等[34]研究表明，1-MCP處理可以有效延緩桃果實(shí)AsA含量的下降，與本研究結(jié)果相似。

在GR的催化下GSSG可以轉(zhuǎn)化成GSH，而GSH又可以將脫氫抗壞血酸（DHA）還原成AsA，這對(duì)維持果實(shí)組織H2O2平衡起到了重要的作用。GSSG含量先上升后下降，15 d時(shí)對(duì)照組GSSG含量高于處理組，相較于0 d漲幅分別為24.81%和1.80%。貯藏30 d達(dá)到峰值，且處理組含量顯著（p＜0.05）高于對(duì)照組，45 d時(shí)，對(duì)照組與處理組GSSG含量分別為271.67 μmol/L、409.57 μmol/L，60 d時(shí)為218.61 μmol/L、289.24 μmol/L。30～60 d，處理組GSSG含量高于對(duì)照組，說(shuō)明1-MCP處理可以緩解軟棗獼猴桃貯藏中后期GSSG含量的下降。

如圖4d所示，1-MCP處理在貯藏期間GSH含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，貯藏前期各組處理差異不大，30 d兩組處理分別達(dá)到最大值，處理組的GSH含量顯著（p＜0.05）高于對(duì)照組，此時(shí)對(duì)照組為78.76 mg/g prot，處理組為89.67 mg/g prot，60 d時(shí)分別降低到54.70 mg/g prot、67.55 mg/g prot。由此可知，1-MCP處理可以維持果實(shí)較高的GSH含量，有利于保護(hù)果實(shí)在貯藏期間膜的完整性，與張飛等[35]對(duì)紫背天葵的研究相似，1-MCP處理可以提高GSH含量，維持較高的抗氧化能力。

2.5 基于OPLS-DA法研究1-MCP處理對(duì)軟棗獼猴桃活性氧代謝的影響

兩組處理進(jìn)行OPLS-DA分析，根據(jù)VIP值大于1，可將果實(shí)差異指標(biāo)確定為SOD、GSH、GSSG、AsA和CAT。SOD和CAT為特征成分的主要原因可能是，1-MCP提高了組織中抗氧化酶的活性，本研究中SOD和CAT作用較為明顯，進(jìn)而增強(qiáng)清除自由基的能力，降低對(duì)細(xì)胞膜的傷害。GSSG、GSH、AsA成為特征成分的主要原因可能是，1-MCP激活了果實(shí)的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)，與對(duì)照相比GSSG、GSH含量可以維持在較高的水平，同時(shí)減少AsA作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在貯藏期間的消耗，作為抗氧化物參與到清除活性氧中，進(jìn)而延緩果實(shí)衰老期的到來(lái)。

3 討論

呼吸作用是果實(shí)采后的一個(gè)重要生理活動(dòng)，乙烯作為植物的衰老激素，可以促進(jìn)果實(shí)的后熟進(jìn)程。本研究軟棗獼猴桃的呼吸高峰出現(xiàn)在貯藏的15 d，45 d時(shí)乙烯生成速率最大，1-MCP處理較CK處理可以有效抑制呼吸和乙烯的生成，減緩貯藏期間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，維持果實(shí)品質(zhì)，延緩衰老速度，與洪偉榮等[36]利用1-MCP預(yù)處理對(duì)機(jī)械損傷的獼猴桃的研究結(jié)果相同。

ROS有幾種常見形式，為O2-·、H2O2和羥基自由基（·OH）等，當(dāng)ROS含量過高時(shí)會(huì)加劇果實(shí)組織的衰老進(jìn)程[37]。本研究結(jié)果顯示，CK處理組在貯藏過程中O2-·活性和H2O2含量逐漸升高，說(shuō)明果實(shí)組織遭受到氧化脅迫，而1-MCP處理組可以有效抑制ROS的積累，延緩膜脂氧化進(jìn)程，從而降低MDA含量以及相對(duì)電導(dǎo)率的升高。

果蔬中降解ROS的途徑分為酶促和非酶促兩種[38]。SOD、POD、APX、CAT為酶促系統(tǒng)的主要抗氧化酶[39]。非酶促包括AsA、GSH、總酚等，可直接降低ROS。SOD將O2-·歧化為H2O2再通過POD、APX、CAT去除，本研究發(fā)現(xiàn)，SOD活性在貯藏中期出現(xiàn)峰值，表明抗氧化系統(tǒng)開始作用，1-MCP處理可以持續(xù)提高SOD活性，保持POD、APX、CAT清除H2O2能力，說(shuō)明1-MCP在提高軟棗獼猴抗氧化酶活性的同時(shí)，增強(qiáng)自由基清除能力，這與尹健等[40]對(duì)“金紅寶”甜瓜的研究結(jié)果一致。OPLS-DA法分析將SOD和CAT確定為差異性指標(biāo)，表明這兩種酶對(duì)清除自由基具有重要作用。抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)為植物體內(nèi)的一個(gè)重要抗氧化系統(tǒng)，對(duì)維持果實(shí)正常生理代謝、貯藏期品質(zhì)有著重要的意義[41-43]。本研究結(jié)果表明，CK處理組GR活性一直處于較低水平，1-MCP處理下的差異指標(biāo)AsA、GSSG及GSH含量下降速度較慢，表明處理可以提高該系統(tǒng)的抗氧化能力，提高軟棗獼猴桃的貯藏品質(zhì)，與霍俊偉等[44]對(duì)藍(lán)靛果的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

綜上所述，1.0 μL/L 1-MCP處理降低軟棗獼猴桃呼吸強(qiáng)度和乙烯生成速率，抑制O2-·、H2O2、MDA和相對(duì)電導(dǎo)率的增加，維持較高SOD、CAT、POD、APX、GR活性，減緩AsA、GSSG、GSH含量的下降。1.0 μL/L 1-MCP可以有效降低貯藏期間軟棗獼猴桃的生理活性，緩解膜脂過氧化，維持果實(shí)活性氧代謝平衡，保持較高的果實(shí)品質(zhì)。1-MCP保鮮技術(shù)具有易操作、成本低、效果好等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)果實(shí)抗氧化及活性氧代謝進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，為軟棗獼猴桃采后保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。