馮 波，王 聰，盧增輝，魏 武

（江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院血管外科 江西 南昌 330003）

糖尿病足是導(dǎo)致糖尿病患者致殘、致死的重要并發(fā)癥之一，糖尿病患者足部潰瘍的發(fā)生率為2%，潰瘍預(yù)后較差，3 年生存率在50%左右，其不僅給患者帶來巨大痛苦，也給社會帶來巨大壓力[1]。因此對于糖尿病患者傷口愈合的研究十分必要，但既往研究關(guān)于糖尿病創(chuàng)面難愈的機制仍未闡明。研究顯示，在傷口愈合過程中Wnt 信號通路起著重要作用，其功能涉及細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡的啟動、血管生成、端粒酶活性和細(xì)胞侵襲性等諸多方面，從而導(dǎo)致相應(yīng)生物效應(yīng)[2-3]。本項目擬通過建立糖尿病足潰瘍模型，檢測Wnt 信號通路及其相關(guān)聯(lián)的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、R-脊椎蛋白3（R-spon din 3,Rspo-3）蛋白及mRNA 表達(dá)水平，探討糖尿病足潰瘍的發(fā)生機制及其促進糖尿病足潰瘍的愈合作用，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

于2019 年10 月—2020 年6 月構(gòu)建糖尿病大鼠動物實驗?zāi)Ｐ?，?0 只Sd 大鼠（批號：201648151）為試驗對象，將大鼠分為糖尿病組及對照組各20 只。大鼠群養(yǎng)于墊鋸木屑的飼料籠中，每籠5 只，控制室溫22 ℃，相對濕度50%，采用自然光暗周期，自由飲水。大鼠均由江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院細(xì)菌室提供，本研究中實驗動物、實驗條件、實驗方法遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》，本次經(jīng)院內(nèi)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：2010-院倫審藥臨字第11 號）。

1.2 方法

（1）大鼠糖尿病模型制備。將大鼠捆縛于鼠板，禁食12 h 后腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）40 mg/（kg·d），正常組、對照組和藥物對照組大鼠每天捆綁30 min，并以普通飼料喂養(yǎng)。3 d 后測量血糖，≥16.7 mmol/L 為提示造模成功。（2）糖尿病大鼠足部潰瘍模型制備。采用薄鐵片連續(xù)按壓大鼠足部，并用冰醋酸連續(xù)涂抹，制作糖尿病足模型，待大鼠下肢出現(xiàn)紅腫潰瘍等異樣變化，根據(jù)肢端壞疽情況參考Wagner評分對各給藥組及模型組大鼠四肢進行評估。分成5 級，0 ～5 級分別0 級表示目前無潰瘍；1 級表示足部皮膚顏色呈蒼白或紫紺狀；2 級表示有潰瘍，出現(xiàn)表淺的創(chuàng)面；3 分表示潰瘍出現(xiàn)深部感染；4 分表示局部壞疽但尚未破壞骨質(zhì)。5 級表示全足壞疽或形成假關(guān)節(jié)。于給藥前及給藥后第1、2、3 周末分別進行評估，計算每只大鼠的總積分。（3）創(chuàng)面愈合情況。創(chuàng)面愈合情況觀察創(chuàng)面造模后第3、7、14 d 對創(chuàng)面進行大體觀察，主要包括創(chuàng)面顏色、腫脹程度、滲液量等，并用數(shù)碼相機拍照，通過Photoshop 軟件記錄創(chuàng)面面積。（4）創(chuàng)面組織學(xué)變化。采用免疫組組織化學(xué)方法，10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋并切成4 μm 厚組織切片，滴加山羊血清封閉30 min。滴加磷脂酰肌醇3-激酶（P-PI3K）/蛋白激酶B（P-Akt）/雷帕霉素靶蛋白（P-mTOR）抗體。二抗采用FITC 標(biāo)記或生物素標(biāo)記，采用ABC 法染色。并設(shè)置陰性對照、陽性對照和熒光標(biāo)記物對照組。圖像用IMAGE PRO 5.1 軟件（Media Cybernetics）分析陽性染色的面積及光密度。免疫組化結(jié)果判定：在100 倍放大的顯微鏡下觀察是否著色，后更換400 倍的放大顯微鏡觀察表達(dá)部位，p-Akt 與p-mTOR 分別位于細(xì)胞漿和細(xì)胞質(zhì)，兩者陽性產(chǎn)物均呈棕褐色顆粒。采用Fromowitz 等改良綜合計分法制定-、+、++、+++4 個等級，依次表示0 分（陰性）、2 ～3 分（弱陽性）、4 ～5 分（中陽性）、6 ～7 分（強陽性），陽性細(xì)胞計分標(biāo)準(zhǔn)：0 ～4分依次表示無陽性細(xì)胞、陽性細(xì)胞數(shù)超過25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，切片表達(dá)計分標(biāo)準(zhǔn)：1 ～3 分依次表示切片呈淡黃色、棕黃色、棕褐色[5]。（5）創(chuàng)面組織β-catenin、GSK3β 蛋白的含量檢測。分別于創(chuàng)面造模后第3、7和14 d，對大鼠采用戍巴比妥鈉進行麻醉后，采集創(chuàng)面及創(chuàng)周2 mm 的組織，應(yīng)用ELISA 法檢測其中β catenin、GSK3β 蛋白的的含量。

1.3 觀察指標(biāo)

（1） 觀察兩組創(chuàng)面造模后第3、7、14d 的β-catenin（β-連環(huán)蛋白）及Rspo-3(R-脊椎蛋白3)含量；（2）觀察兩組創(chuàng)面造模第3、7、14d 的創(chuàng)面愈合率；（3）觀察兩組組織病理學(xué)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用（± s）表示，兩獨立樣本采用t檢驗，兩組及兩組以上采用F檢驗；計數(shù)資料用頻數(shù)（n）和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；生存時間和中位肝轉(zhuǎn)移時間、中位生存期等生存資料分析采用Kaplan-Meier 方法計算，組間生存率的比較采用Log-rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組創(chuàng)面造模后各時間點的β-catenin 及Rspo-3 含量比較

創(chuàng)面造模后第3、7、14d，糖尿病組創(chuàng)面組織中βcatenin、Rspo-3 蛋白含量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組大鼠創(chuàng)面造模后各時間點的β-catenin 及Rspo-3含量比較 ± s

表1 兩組大鼠創(chuàng)面造模后各時間點的β-catenin 及Rspo-3含量比較 ± s

β-catenin/ml第3d第7d第14d對照組202.01±0.822.44±0.712.64±0.41糖尿病組 200.98±4.330.85±0.220.86±0.43 t 4.8494.6136.846 P 0.0010.0010.001組別例數(shù)Rspo-3/μg第3d第7d第14d對照組202.25±0.712.04±0.282.28±0.21糖尿病組 200.54±0.820.99±0.300.97±0.32 t 7.2126.8654.623 P 0.0010.0010.001組別例數(shù)

2.2 兩組創(chuàng)面愈合情況比較

創(chuàng)面造模后第3、7、14d，糖尿病組的創(chuàng)面愈合率均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組大鼠創(chuàng)面造模后各時間點的創(chuàng)面愈合率比較（ ± s，%）

表2 兩組大鼠創(chuàng)面造模后各時間點的創(chuàng)面愈合率比較（ ± s，%）

組別例數(shù)第3d第7d第14d對照組200.025±0.0040.018±0.0030.010±0.006糖尿病組 200.031±0.0050.026±0.0040.019±0.005 t 6.84110.3649.872 P＜0.05＜0.05＜0.05

2.3 組織病理學(xué)結(jié)果

換藥處理后第7 天，對照組大鼠潰瘍面在光鏡下呈現(xiàn)出肉芽組織大量炎性細(xì)胞滲出，出血顯著，見少許血管，管腔細(xì)，見壞死帶呈團狀排列，見圖1。糖尿病組潰瘍面在光鏡下見肉芽組織少量炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞出現(xiàn)增殖，且體積較大，見大量新生血管，管腔小且圓，見圖2。

圖1 對照組大鼠潰瘍面光鏡圖

圖2 糖尿病組大鼠潰瘍面光鏡圖

3.討論

據(jù)統(tǒng)計，12%～25%的糖尿病患者會罹患糖尿病足，其不僅給患者帶來巨大痛苦，給社會也帶來巨大壓力，并且該病正隨著人們生活水平的提高而呈上升趨勢[6]。因此，對于糖尿病患者傷口愈合的研究十分必要。慢性糖尿病患者傷口一般由急性傷口發(fā)展而來，但是愈合的過程在不同的階段都發(fā)生了紊亂，導(dǎo)致傷口超過12 個星期不愈合[7]。此外，高糖、慢性炎癥、循環(huán)系統(tǒng)異常、低氧、神經(jīng)病變和神經(jīng)肽信號通路受損也會影響糖尿病患者傷口愈合的進程[8]。

研究表明，Wnt 信號通路中的相關(guān)成員對傷口愈合很重要，其中最被熟知的是經(jīng)典Wnt/β-cateninc-Mye 通路[9]。有研究分析糖尿病大鼠以及正常大鼠的Wnt/βcatenin 信號通路的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在糖尿病足潰瘍患者愈合過程中呈下降趨勢[10]。因此，我們推測激活Wnt/β-catenin 信號通路可能促進創(chuàng)面愈合?；谝陨媳尘?，本項目擬基于Wnt/βcatenin 信號通路研究糖尿病足慢性潰瘍的機制，選取數(shù)只大鼠進行創(chuàng)面造模后。分析結(jié)果可知：創(chuàng)面造模后第3、7、14d，糖尿病組創(chuàng)面組織中βcatenin、Rspo-3 蛋白含量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與趙亞男等[11]研究發(fā)現(xiàn)的高濃度葡萄糖會下調(diào)細(xì)胞中β-catenin 蛋白表達(dá)的結(jié)論一致。其中β-catenin 是Wnt 通路中重要的下游因子，屬于一種多功能蛋白質(zhì)，其胞漿內(nèi)分子量為92 ～95 kd，增強β-catenin 穩(wěn)定性的主要機制是依靠Wnt信號通路刺激，該指標(biāo)與皮膚損傷及愈合間關(guān)系密切，其大量分泌的情況下有助于促進表皮及角質(zhì)細(xì)胞的生成，促使皮膚愈合。而Rspo3 屬于Rspo 蛋白家族，具有激活Wnt 途徑的作用。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，Rspo3 在糖尿病潰瘍大鼠創(chuàng)面組織中呈低表達(dá)，由此，我們推推測，Rspo 蛋白的調(diào)降可能是下調(diào)糖尿病潰瘍中Wnt 信號通路的主要機制[12]。在本實驗中糖尿病組的創(chuàng)面愈合率均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且潰瘍愈合延緩，肉芽生長不佳，證實糖尿病皮膚創(chuàng)面細(xì)胞凋亡增加，也從側(cè)面認(rèn)可了本實驗?zāi)Ｐ椭圃斓某晒Α?/p>

綜上所述，Wnt/β-catenin 信號通路表達(dá)下調(diào)，參與了糖尿病足潰瘍愈合不良的過程。