陸大鵬，蔡秋萍

（湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東湛江 524000）

固相微萃?。⊿olid-phase Microextraction，SPME）法已被廣泛用于萃取食品中的揮發(fā)性成分[1]。根據(jù)該方法的工作原理，通常認(rèn)為對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大的萃取參數(shù)是萃取涂層、萃取溫度、萃取時(shí)間等[2-3]。同時(shí)，氣相色譜（Gas Chromatography，GC）儀器端的條件也直接影響著分析的效果和萃取涂層的使用壽命，大多數(shù)學(xué)者采用兩段升溫程序進(jìn)行分離，分離化合物較聚集[4-5]。為獲得更優(yōu)的SPME的萃取效果及分析效果，需對(duì)SPME的萃取參數(shù)和解吸分析參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。本文以鮮牡蠣為試驗(yàn)材料，建立牡蠣揮發(fā)性成分的分析方法，通過(guò)研究頂空固相微萃?。℉eadspace Solid-phase Microextraction，HS-SPME）萃取效果的主要影響因素及優(yōu)化GC的儀器使用條件，建立萃取效率高、分析結(jié)果準(zhǔn)確的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

近江牡蠣（Ostrea rivularis），2021年1月購(gòu)于湛江市霞山區(qū)上坡塘綜合市場(chǎng)，平均重約20.10 g，長(zhǎng)約6.0 cm，去殼，洗凈，瀝干，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴振蕩器（SHZ-A，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；電子天平（Qumintix 224-1CN，賽多利斯科學(xué)有限公司）；手動(dòng)固相微萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）；萃取纖維頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 和 100 μm PDMS，美國(guó)Supelco公司）；多樣品均質(zhì)系統(tǒng)（GHS-66北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；凝膠色譜-氣質(zhì)聯(lián)用儀（GPC/GCMS-QP2010，日本島津）；分析天平（ME203E梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鮮牡蠣預(yù)處理

開(kāi)殼取鮮牡蠣肉，牡蠣肉洗凈泥沙后勻漿，備用。

1.3.2 HS-SPME萃取方法

準(zhǔn)確稱取一定量的牡蠣勻漿液置于20 mL的頂空瓶中密封，萃取頭在首次使用時(shí)需250 ℃條件下老化1 h。將老化好的固相微萃取針插入樣品瓶中大約1 cm處，推出萃取頭（不要接觸到樣品，以免污染萃取頭），在設(shè)定的溫度下頂空吸附預(yù)設(shè)時(shí)間，收回萃取頭后，拔出萃取裝置，迅速插入氣相進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解吸60 min。

1.3.3 儀器條件

（1）氣相色譜條件。毛細(xì)管色譜柱HP-5MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm，5%苯基/95%聚二甲基硅氧烷），載氣為高純氦氣（99.999%），流速為1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃；柱溫：初始溫度40 ℃，恒溫1 min，以3 ℃/min的速率升到100 ℃，保持10 min，再以5 ℃/min的速率升到150 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升高到250 ℃，保持5 min。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電子轟擊EI；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；掃描模式：全掃描；掃描質(zhì)子范圍：35～500m/z；EI電子能量：70 eV。各組分經(jīng)過(guò)NIST17.0標(biāo)準(zhǔn)普庫(kù)檢索匹配。

1.3.4 萃取和解吸條件參數(shù)的優(yōu)化

SPME法提取牡蠣中的揮發(fā)性成分的影響因素有萃取頭、萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品量和解吸溫度，按照1.3.2和1.3.3的操作方法和儀器條件，通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化以上條件參數(shù)，確定合適的萃取頭和最佳的萃取溫度、時(shí)間、樣品量及解吸溫度。

（1）萃取頭的選擇。準(zhǔn)確稱取樣品2 g，選用4種不同規(guī)格萃取頭，50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 和 100 μm PDMS 進(jìn)行加熱萃取，萃取溫度為60 ℃，萃取時(shí)間為50 min，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）上機(jī)分析。

（2）萃取溫度的選擇。準(zhǔn)確稱取樣品2 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃溫度下萃取40 min，進(jìn)行GC-MS上機(jī)分析。

（3）萃取時(shí)間的選擇。準(zhǔn)確稱取樣品2 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭，萃取溫度為60 ℃，萃取時(shí)間分別為 30 min、40 min、50 min、60 min、70 min和80 min，然后上機(jī)解吸分析，進(jìn)行GC-MS上機(jī)分析。

（4）稱樣量的選擇。分別稱取牡蠣樣品1 g、2 g、3 g、4 g、5 g和6 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭，萃取溫度為60 ℃，萃取40 min，進(jìn)行GC-MS上機(jī)分析。

（5）解吸溫度的選擇。準(zhǔn)確稱取樣品2 g，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭，萃取溫度為60 ℃，萃取40 min，設(shè)置進(jìn)樣口溫度分別為150 ℃、200 ℃、250 ℃和300 ℃解吸，進(jìn)行GC-MS上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取頭的確定

萃取頭的萃取材料及涂層厚度對(duì)分析物的固相吸附量和平衡時(shí)間都有影響[6]。應(yīng)綜合以上因素選擇合適的涂層材料和厚度，萃取頭的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。4種萃取頭中，萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分總峰面積較大的萃取頭規(guī)格是75 μm CAR/PDMS和50/30 μm DVB/CAR/PDMS，萃取總峰面積最小的是100 μm PDMS規(guī)格萃取頭。雖然理論上膜厚度大的萃取頭吸附容量大，但試驗(yàn)結(jié)果表明吸附容量大不代表萃取得到的總峰面積大，原因是牡蠣中的揮發(fā)性成分復(fù)雜，萃取頭的固定相具有選擇性，100 μm PDMS規(guī)格萃取頭是單一的固定相，不適合用于萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分。

圖1 不同萃取頭對(duì)牡蠣萃取效果的影響

僅從總峰面積評(píng)價(jià)萃取頭的吸附效果不全面，總峰面積能表明萃取頭吸附較充分，但可能是對(duì)牡蠣中的一種揮發(fā)性成分或其中的幾種成分有強(qiáng)吸附作用，吸附的揮發(fā)性成分種類(lèi)可能不全。因此，需評(píng)價(jià)峰數(shù)量指標(biāo)。萃取峰數(shù)量最多的萃取頭規(guī)格為50/30 μm DVB/CAR/PDMS， 其 次 是 規(guī) 格 為 65 μmPDMS/DVB的萃取頭，峰數(shù)量越多表明吸附的揮發(fā)性成分種類(lèi)越多，吸附的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量與萃取頭的固定相有關(guān)，規(guī)格為50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取頭為3種復(fù)合固定相，比另外3種規(guī)格的固定相復(fù)合度高，用該規(guī)格萃取頭萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分峰數(shù)量最多。結(jié)合總峰面積和峰數(shù)量綜合評(píng)價(jià)萃取頭，適合萃取牡蠣中揮發(fā)性成分的萃取頭規(guī)格為 50/30 μm DVB/CAR/PDMS。

2.2 萃取溫度的確定

萃取溫度是影響反應(yīng)速率的重要因素，選取合適的萃取溫度，有利于萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分。萃取溫度的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。用萃取頭規(guī)格為50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取牡蠣中的揮發(fā)性成分，萃取的總峰面積隨萃取溫度的升高整體呈先增加后減少的趨勢(shì)，在70 ℃達(dá)到頂峰值；峰數(shù)量隨溫度的升高呈先增加后減少再增加的趨勢(shì)。在熱作用下，分子間的熱運(yùn)動(dòng)隨溫度的升高越來(lái)越激烈，當(dāng)揮發(fā)性成分和涂層固定相間的分配系數(shù)達(dá)到最高，萃取效果達(dá)到最高水平，且溫度繼續(xù)升高，熱運(yùn)動(dòng)加劇，導(dǎo)致分配系數(shù)減少，萃取量反而減少，因此70 ℃的總峰面積比80 ℃大。此外，溫度過(guò)高易導(dǎo)致基質(zhì)中化合物發(fā)生化學(xué)變化，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分發(fā)生變化，不利于樣品真實(shí)成分的檢測(cè)。因此，需選取萃取效果較佳且盡量保持樣品真實(shí)性的的萃取溫度，綜合考慮，確定60 ℃為較佳萃取溫度。

圖2 不同萃取溫度對(duì)牡蠣萃取效果的影響

2.3 萃取時(shí)間的確定

萃取時(shí)間主要是指萃取達(dá)到或接近平衡所需要的時(shí)間，長(zhǎng)時(shí)間的溫?zé)釛l件下，可能產(chǎn)生不利的影響，如微生物的反應(yīng)、化合物間的反應(yīng)等[7]。因此，試驗(yàn)需選取合適的萃取時(shí)間，萃取時(shí)間的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 不同萃取時(shí)間對(duì)牡蠣萃取效果的影響

在同等萃取條件下，萃取的總峰面積和峰數(shù)量在60 min時(shí)達(dá)到最高，之后萃取的總峰面積和峰數(shù)量出現(xiàn)小幅度的先下降后升高的變化。在萃取開(kāi)始時(shí)，萃取頭中固定相中物質(zhì)的量增加較快，當(dāng)接近萃取平衡時(shí)，萃取的速度下降。但隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，加熱可能會(huì)促進(jìn)基質(zhì)中化合物的反應(yīng)，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分發(fā)生變化，萃取涂層的分配系數(shù)發(fā)生變化，因此70 min和80 min時(shí)的萃取效果不一致。為保證樣品的穩(wěn)定性和試驗(yàn)結(jié)果具有良好的萃取效果，綜合考慮，確定60 min為較佳萃取時(shí)間。

2.4 稱樣量的確定

稱樣量對(duì)萃取效果產(chǎn)生的影響主要來(lái)源于樣品量對(duì)頂空體積的影響，樣品量間接影響樣品的萃取效果，因此選取合適的稱樣量有利于提升萃取的效果。稱樣量的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。總峰面積的整體結(jié)果呈先上升后下降的趨勢(shì)。樣品量對(duì)萃取效果的影響明顯，樣品量太少時(shí)，幾乎無(wú)法萃取到樣品中的揮發(fā)性成分。此外，頂空體積的變化對(duì)萃取效果有一定的影響，樣品量大于1 g時(shí)，揮發(fā)性成分的總峰面積整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，但峰數(shù)量總體呈下降趨勢(shì)，樣品量增多的同時(shí)，頂空體積減少，頂空基質(zhì)的壓力升高，導(dǎo)致某些揮發(fā)性成分的萃取分配系數(shù)增大，同時(shí)部分物質(zhì)萃取分配系數(shù)降低，導(dǎo)致萃取的物質(zhì)數(shù)量與物質(zhì)的量不同步。因此，為獲得更多揮發(fā)性成分的信息，應(yīng)以峰數(shù)量為指標(biāo)，同時(shí)參考總峰面積選取最佳樣品量。綜合考慮，樣品量為2 g和3 g時(shí)，牡蠣萃取效果較好，因此確定2.5 g為較佳樣品稱樣量。

圖4 不同稱樣量對(duì)牡蠣萃取效果的影響

2.5 解吸溫度的確定

解吸溫度為氣相進(jìn)樣口的溫度，其決定樣品是否能被全部氣化解吸進(jìn)樣，從而影響樣品分析的結(jié)果。溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致易分解組分分解，分析結(jié)果出現(xiàn)失真情況。因此，須選擇合適的進(jìn)樣口分析溫度，進(jìn)樣口溫度的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 不同進(jìn)樣口溫度對(duì)牡蠣分析效果的影響

圖6 不同解析溫度含硅化合物的響應(yīng)值比例及含硅化合物的峰數(shù)量

進(jìn)樣口溫度對(duì)化合物的分析效果影響較大?？偡迕娣e隨進(jìn)樣口溫度的上升呈先上升后下降的趨勢(shì)，但化合物的峰數(shù)量一直呈增加的趨勢(shì)。在150 ℃和200 ℃時(shí)，牡蠣中的揮發(fā)性成分呈遞增趨勢(shì)被解析進(jìn)行分析。但250 ℃時(shí)，分析的化合物的總峰面積下降，300 ℃時(shí)更低，但此時(shí)的峰數(shù)量仍在增加，可能是由于高于250 ℃熱解吸下的化合物被分解，進(jìn)樣口溫度過(guò)高導(dǎo)致化合物氣化殘留在進(jìn)樣口周?chē)茨苓M(jìn)入色譜柱檢測(cè)。因此，對(duì)牡蠣中揮發(fā)性成分的分析檢測(cè)，進(jìn)樣口的溫度不是越高越好，合適的進(jìn)樣口溫度能保證結(jié)果分析的有效性。此外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)解吸過(guò)程中，分析物中含硅化合物的含量增多，高溫加熱后，會(huì)將萃取頭涂層中的含硅固定相熱解吸下來(lái)，影響萃取頭的使用壽命。

圖6的結(jié)果顯示，含硅化合物峰面積的比例和含硅化合物的峰數(shù)量隨進(jìn)樣口溫度的升高而升高，且兩者增幅趨勢(shì)幾乎同步。高溫?zé)峤馕鼘?duì)固相微萃取頭同樣也有解吸作用，過(guò)高溫度下萃取頭上的固定材料氣化的量增多，從而縮短該固相萃取頭的使用壽命，甚至?xí)绊懺撦腿☆^下一次萃取的效果。綜上所述，200 ℃下，牡蠣的揮發(fā)性成分的分析結(jié)果較為真實(shí)有效，且此溫度下對(duì)固相微萃取頭的使用壽命較為友好，因此選取進(jìn)樣口為200 ℃為GC進(jìn)樣口解吸溫度。

3 結(jié)論

頂空固相微萃取的萃取條件對(duì)萃取效果有明顯的影響，通過(guò)優(yōu)化萃取頭、萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品量和解吸溫度參數(shù)，得到HS-SPME對(duì)牡蠣樣品萃取的最佳萃取參數(shù)為50/30 μm DVB/CAR/PDMS規(guī)格的萃取頭，牡蠣樣品稱樣量為2.5 g，萃取溫度60 ℃，萃取時(shí)間為60 min，解吸溫度為200 ℃。此研究為提高鮮牡蠣的市場(chǎng)價(jià)值、使用價(jià)值提供理論依據(jù)。