張雪穎

（蘇州大學劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇蘇州 215123）

非熱加工是指利用傳統(tǒng)加熱以外的機制來滅活食源性微生物的新興食品保鮮技術，這些技術包括超高壓、脈沖電場、電離輻射和紫外線光等，它們最大的優(yōu)勢在于可在常溫或低溫下對食品中的病原微生物和致腐性微生物進行高效滅活，延長食品保質(zhì)期，同時不影響食物天然風味和口感。

1 超高壓技術概述

超 高 壓 技 術（Ultra-high Pressure Processing，UHP）是一種新型的用于滅活食源性病原菌和腐敗微生物的非熱食品保存技術，該技術的基礎是在比熱加工溫度低得多的情況下應用50～1 000 MPa的靜水壓，對食品的營養(yǎng)和感官品質(zhì)損失最小[1]。UHP在食品中的應用可追溯到大約一個世紀前，直到20世紀80年代中期，UHP作為一種商業(yè)食品保存技術的應用才重新被燃起。目前，經(jīng)UHP處理的食品已應用于大米產(chǎn)品、肉類和家禽、蔬菜、果汁和海產(chǎn)品。然而，UHP并不適用于所有類型的食品。例如，草莓等帶有內(nèi)部氣穴的食物，在加工過程中易被碾碎。另外，由于不能破壞微生物中的孢子，故而單獨UHP不能對一些貨架穩(wěn)定的低酸食品進行滅菌。

不正確折疊方式的蛋白可以在較低的壓力（200 MPa)下進行重新折疊[2]。利用酶對熱和高壓處理的不同穩(wěn)定性，使用高壓選擇性地滅活某些酶類以開發(fā)出新食品。病毒衣殼蛋白在高壓環(huán)境下具有不可逆性，高壓處理可被用作疫苗研制過程中滅活病毒的方法。然而，由于高壓對微生物的高效滅菌的能力，最常見的應用仍然是食品保鮮。

2 UHP誘導的微生物滅活動力學

高壓誘導的微生物滅活并不總是遵循一級模型。當繪制存活種群隨時間變化的對數(shù)圖時，首先出現(xiàn)線性下降，其次是滅活率的下降，后者通常被描述為尾跡效應。在熱處理過程中也觀察到了類似的尾跡效應。對腸道沙門氏菌PT4和大腸桿菌O157:H7的研究表明，熱誘導的尾跡效應主要是熱休克蛋白等蛋白質(zhì)的重新合成所致[3]。然而，壓力誘導的尾跡效應的作用機理仍未完全清楚。對于某些沙門氏菌而言，在分離、繁殖和再次暴露于壓力下時，尾跡效應和原培養(yǎng)物之間并沒有明顯的壓力差異。對大腸桿菌O157:H7的另一項研究發(fā)現(xiàn)，與原培養(yǎng)物相比，尾跡培養(yǎng)對UHP具有更高的抵抗力，這可能是由于細胞質(zhì)膜對壓力的穩(wěn)定性較高所導致。NOMA等同時認為，非離子表面活性劑的加入可能會抑制尾跡現(xiàn)象[4]。

3 UHP引起的微生物損傷

已有研究報道在高壓處理后使用差分電鍍技術會損傷細胞，處理后的存活細胞在非選擇性培養(yǎng)基和添加選擇性培養(yǎng)基上均可恢復生長。受損細胞通常在選擇性培養(yǎng)基上生長緩慢或不能繁殖，兩種培養(yǎng)基之間的群體差異被用來評估壓力誘導的損傷。外膜滲透使受損細胞對溶菌酶或疏水化合物（如膽鹽）致敏，但減壓后受損細胞就能恢復抵抗力[5]。在對大腸桿菌K-12菌株AB1157的研究中發(fā)現(xiàn)，99%的存活群體在膽鹽的存在下不能再次在回收瓊脂上生長，但在胰蛋白酶大豆肉湯中孵育1 h后就完全恢復，受損細胞對酸性條件或鹽的敏感性可歸因于細胞質(zhì)膜的損傷所致[6]。與外膜相比，細胞質(zhì)膜的修復需對代謝的要求更高，且需要更長的時間，而受損細胞的存在將給檢測和計數(shù)帶來困擾。此外，在食品儲存期間，恢復食品中受損的病原體可能對人類健康造成危害。MA[7]在調(diào)查高壓處理受損的大腸桿菌O157:H7的動態(tài)恢復過程中發(fā)現(xiàn)，隨著壓力的增加，抑制作用更強，而致命的作用與傷害不一致，證實了UHP損傷的大腸桿菌O157:H7可以在適當?shù)臈l件下修復。

4 UHP滅活營養(yǎng)菌

革蘭氏陽性細菌對高壓的抵抗力一般比革蘭氏陰性菌強，這可能是由于革蘭氏陰性細菌細胞膜的復雜性，這種細胞外膜比革蘭氏陽性細菌細胞外膜更容易受到UHP的影響。桿狀菌往往比球菌更敏感，球菌表面積減少可能會限制細胞泄漏，這可能是造成UHP失活的部分原因[8]。有研究表明，靜止期的細胞比指數(shù)期的細胞具有更高的耐壓能力，這可能歸因于在固定相合成的特殊蛋白質(zhì)，以抵消高壓的有害影響，熱、氧化應激、高鹽濃度等不良條件也有相似的趨勢。大腸桿菌中的RpoS蛋白的存在和單核細胞增生李斯特菌中SigB蛋白的存在部分保護了靜止期細胞免受高壓的有害影響[9]。固定相位細胞的抗性也可能是由于膜脂的變化、肽聚糖的增稠以及膜蛋白與多肽和脂蛋白之間交聯(lián)的增加所致。當然也有許多例外，因為細菌對高壓的抵抗力表現(xiàn)出較大的變異性，甚至來自同一物種的菌株也是如此。MALONE等[10]調(diào)查了15株大腸桿菌O157:H7對500 MPa高壓處理的抗性，發(fā)現(xiàn)處理后的對數(shù)下降范圍在0.6～3.4 CFU/mL。

5 影響UHP微生物滅活的因素

在UHP處理期間保持溫度對細菌滅活有著顯著的影響。有兩個因素導致產(chǎn)品的初始溫度和加壓過程中的溫度升高，當然這取決于食品成分。當溫度保持在20～35 ℃時，UHP對細菌滅活效果最低；但超過35 ℃時，UHP效果明顯，這種現(xiàn)象可能是脂膜在較高溫度下容易發(fā)生的相變所致。一般來說，隨著保溫溫度的升高，所有病原體的滅活作用都明顯增強。高溫（＞70 ℃）與壓力相結(jié)合，幾乎可以實現(xiàn)產(chǎn)品的完全滅菌。然而，不同微生物之間的高壓和低溫協(xié)同作用也是有報道的[11]。

（1）食物中的成分影響著微生物的耐壓能力。因此，在真正的食品系統(tǒng)中需要更嚴格的高壓處理才能達到與緩沖系統(tǒng)或?qū)嶒炇遗囵B(yǎng)基相同的滅活水平。豐富的培養(yǎng)基具有更強的保護性，可能是因為必需氨基酸和維生素有助于受損細胞的恢復[12]。鈣的存在對高壓處理的大腸桿菌具有保護作用，這可能是由于加壓過程中鈣離子結(jié)合成分的修復造成的。

（2）低水活度保護微生物免受高壓侵害。然而，溶質(zhì)的性質(zhì)對高壓處理后的細胞失活有著顯著的影響。同樣，懸浮在氯化鈉或氯化鈣等離子溶質(zhì)中的凝固芽孢桿菌細胞比蔗糖或甘油等非離子溶質(zhì)中的抗性更強。與甘油相比，單糖和二糖對UHP具有更強的保護作用。

（3）低pH值可協(xié)同高壓作用增強微生物滅活效率。由于水分子的離子離解作用，加壓通常會導致食品基質(zhì)或懸浮緩沖液的pH值降低。壓力釋放后，pH值恢復到原始值，但pH值的突然變化是否對微生物失活有影響尚不清楚。

（4）食品級添加劑的添加可以提高UHP對病原菌的抗菌效果。通過對常用食品添加劑乳酸菌細菌素nisin和叔丁基對苯二酚（TBHQ）進行檢測，顯示UHP可能促進nisin穿透細胞質(zhì)膜，尤其是對革蘭陰性菌，導致細菌的滅活。TBHQ的協(xié)同效應可歸因于通過細胞[Fe-S]簇氧化TBHQ而產(chǎn)生殺菌活性氧所致。

6 UHP對微生物細胞的基本作用

UHP可以引起細胞形態(tài)、膜、生化反應和遺傳機制的一些變化。隨著細胞壁與細胞質(zhì)膜的分離，加壓可以使細胞空泡化，從而使細胞拉伸5～50倍。然而，細胞形態(tài)的一些變化是暫時性的，一旦壓力釋放，細胞會恢復正常形態(tài)。

細胞膜被公認為微生物壓力損傷的主要靶點之一，加壓后細胞膜滲透率的增加表現(xiàn)為ATP或紫外吸收材料的泄漏、滲透反應能力的喪失和熒光染料的吸收增加。壓力通過增加脂質(zhì)分子的堆積密度和誘導脂質(zhì)與膜蛋白的分離而降低細胞膜的流動性，降低脂膜的熔化溫度可以恢復膜的流動性。研究發(fā)現(xiàn)，嗜壓深海細菌對超高壓的適應力涉及膜脂組成從飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)變。膜ATP酶活性的喪失也可能導致高壓失活，但細胞質(zhì)功能的部分喪失或革蘭氏陰性菌外膜的破壞并不一定會導致細胞死亡。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在指數(shù)期細胞中，膜完整的喪失與UHP介導的致死性有關，而在靜止期細胞中，細胞膜則在減壓后重新出現(xiàn)。

UHP傾向于生化反應，導致體積減小，并且通常會延緩涉及體積增大的反應。蛋白質(zhì)內(nèi)部和蛋白質(zhì)之間的靜電和疏水相互作用尤其對壓力敏感，使蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)容易受到高壓破壞，而氫鍵不受UHP的影響。高于300 MPa的蛋白質(zhì)的不可逆變性是大多數(shù)營養(yǎng)細胞和蛋白包被病毒失活的部分原因。

核糖體在加壓過程中可能會變形，從而抑制mRNA的附著。電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，壓力為150～250 MPa時大腸桿菌的核糖體被完全破壞。近期的研究從遺傳學和蛋白質(zhì)組學的角度探討了微生物對UHP處理的反應?；蛐酒偷鞍踪|(zhì)組學的分析揭示了參與微生物耐壓性的可能基因和蛋白。通過將無啟動子的綠色熒光蛋白基因?qū)氪竽c桿菌MG1655基因組片段，篩選出熱休克啟動子和SOS應答基因，以便在暴露于亞致死高壓脅迫后誘導[13]。這些研究表明熱休克蛋白在保護或修復UHP所致的損傷方面起著重要的作用。對大腸桿菌基因組的DNA基因芯片分析表明，壓力升高可同時引起熱應激和冷應激反應。最近的一項DNA基因芯片分析通過比較壓力處理（亞致死性）和未處理大腸桿菌的基因轉(zhuǎn)錄譜，揭示了參與大腸桿菌O157:H7耐高壓的相關基因[10]。研究發(fā)現(xiàn)，超過100個基因?qū)喼滤佬詨毫μ幚碛蟹磻?，包括應激反應、硫?二硫氧化還原系統(tǒng)、鐵硫簇和自發(fā)突變相關基因。負責[Fe-S]團簇生物合成的全鐵操作子在鐵饑餓的條件下被下調(diào)。某些蛋白質(zhì)中的[Fe-S]團簇可能使細菌細胞對壓力敏感。

7 結(jié)語

隨著消費者對加工程度最低的新鮮食品的需求增加，人們對開發(fā)替代食品保鮮技術的興趣也開始顯現(xiàn)出來。非熱加工技術的最大優(yōu)勢是在環(huán)境或制冷溫度下對食品中的微生物具有有效的抵抗力，從而在不影響感官質(zhì)量和營養(yǎng)價值的情況下生產(chǎn)出保質(zhì)期更長、安全性更高的食品。然而，在非熱食品保鮮技術的應用方面也存在一些挑戰(zhàn)。它對孢子的低效率導致替代技術不可能完全取代熱殺菌。此外，非熱處理后的尾跡效應和亞致死性損傷可能會給消費者帶來一定的風險。深入了解微生物滅活機理，有助于提高微生物滅活效率，從而發(fā)揮UHP更大的作用。