李潔花　廖晨希　楊盾　曾友　黃丹　張熙　劉春華　謝明霞

〔摘要〕 目的 觀察“古漢愈瘍方”對(duì)糖尿病皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面的修復(fù)作用，探討其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制，并比較其凝膠劑與噴霧劑的療效。方法 將80只SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（15只）和糖尿病組（65只），糖尿病組大鼠采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型，造模成功的60只糖尿病大鼠與15只對(duì)照組的正常大鼠一起制作皮膚潰瘍模型，對(duì)照組予凡士林紗布換藥，糖尿病組大鼠再隨機(jī)分為模型組、古漢愈瘍方噴霧治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)噴霧組）、古漢愈瘍方凝膠治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)凝膠組）、康復(fù)新液治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)康復(fù)新組），每組15只，分別予以凡士林紗布、古漢愈瘍方噴霧劑、古漢愈瘍方凝膠、康復(fù)新液干預(yù)，每日換藥1次，持續(xù)21 d。肉眼觀察各組大鼠創(chuàng)面愈合情況，并計(jì)算3、7、14、21 d動(dòng)態(tài)創(chuàng)面收縮率，HE染色觀察大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin like growth factor-1， IGF-1）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的蛋白表達(dá)。結(jié)果 （1）給藥3、7、14、21 d時(shí)，對(duì)照組、噴霧組、凝膠組和康復(fù)新組創(chuàng)面收縮率均顯著高于模型組（P<0.01），凝膠組顯著高于噴霧組（P<0.01）;給藥21 d時(shí)，凝膠組與康復(fù)新組、對(duì)照組的創(chuàng)面收縮率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（2）HE染色顯示，模型組創(chuàng)面化膿，有炎性滲出液，創(chuàng)面縮小緩慢;相較模型組，對(duì)照組和凝膠組新鮮肉芽組織明顯增生，毛細(xì)血管生長(zhǎng)迅速，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，噴霧組和康復(fù)新組次之。（3）免疫組化結(jié)果顯示，與模型組比較，其余4組在各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織中IGF-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與對(duì)照組比較，凝膠組各時(shí)間點(diǎn)IGF-1的蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05或P<0.01），而7、21 d噴霧組與康復(fù)新組IGF-1的蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05或P<0.01），14 d對(duì)照組、噴霧組與康復(fù)新組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與凝膠組比較，噴霧組與康復(fù)新組在各時(shí)間點(diǎn)IGF-1的蛋白表達(dá)降低（P<0.01）。與模型組比較，其余4組在各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織中VEGF的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與對(duì)照組比較，噴霧組、凝膠組與康復(fù)新組VEGF的蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與凝膠組比較，康復(fù)新組VEGF的蛋白表達(dá)水平在14 d偏低（P<0.05），噴霧組VEGF的蛋白表達(dá)水平在21 d偏低（P<0.05）。結(jié)論 “古漢愈瘍方”可有效促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面的修復(fù)，其療效機(jī)制可能與上調(diào)IGF-1及VEGF的表達(dá)有關(guān)，且凝膠劑比噴霧劑療效更佳。

〔關(guān)鍵詞〕 糖尿病;古漢愈瘍方;皮膚潰瘍;胰島素樣生長(zhǎng)因子;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;大鼠

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.006

Comparative study on the therapeutic effect of different dosage forms of Guhan

Yuyang Recipe on ulcer wound healing in diabetic rats

LI Jiehua LIAO Chenxi YANG Dun ZENG You HUANG Dan ZHANG Xi LIU Chunhua XIE Mingxia

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of “Guhan Yuyang Recipe” on wound healing of diabetic skin ulcer rats， to explore its mechanism of promoting wound healing， and to compare the curative effect of gel and spray. Methods 80 SPF grade healthy adult male SD rats were randomly divided into control group （n=15） and diabetic group （n=65）. The diabetic model was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin. 60 diabetic rats successfully established and 15 normal rats in the control group were used to make skin ulcer model， and the control group was treated with vaseline gauze. Diabetic rats were randomly divided into model group， Guhan Yuyang Recipe spray treatment group （hereinafter referred to as spray group）， Guhan Yuyang Recipe gel treatment group （hereinafter referred to as gel group） and Kangfuxin liquid treatment group （hereinafter referred to as Kangfuxin group）， with 15 rats in each group. The rats were treated with vaseline gauze， Guhan Yuyang Recipe spray， Guhan Yuyang Recipe gel and Kangfuxin liquid respectively， and the dressing was changed once a day for 21 days. The wound healing of rats in each group was observed with naked eye， and the dynamic wound contraction rate at 3rd， 7th， 14th and 21st day was calculated. The histopathological changes of wounds were observed by HE staining， and the protein expression levels of insulin like growth factor-1 （IGF-1） and vascular endothelial growth factor （VEGF） were detected by immunohistochemistry. Results （1） On the 3rd， 7th， 14th and 21st day after administration， the wound contraction rate in the control group， spray group， gel group and Kangfuxin group was significantly higher than that in the model group （P<0.01）， and that in the gel group was significantly higher than that in the spray group （P<0.01）; on the 21st day of administration， there was no significant difference in wound contraction rate between the gel group， the Kangfuxin group and the control group （P>0.05）. （2） HE staining showed that the wound in the model group suppurated， there was inflammatory exudate， and the wound shrank slowly; compared with the model group， fresh granulation tissue proliferated significantly， capillaries grew rapidly， fibroblasts increased and inflammatory cell infiltration decreased significantly in the control group and gel group， followed by spray group and Kangfuxin group. （3） The results of immunohistochemistry showed that， compared with the model group， the protein expression level of IGF-1 in the other four groups increased significantly at each time point （P<0.05 or P<0.01）; compared with the control group， the protein expression level of IGF-1 in the gel group was higher at each time point （P<0.05 or P<0.01）， on the 7th and 21st day， the protein expression level of IGF-1 in spray group and Kangfuxin group was lower than that in control group （P<0.05 or P<0.01）， on the 14th day， there was no significant difference among control group， spray group and Kangfuxin group （P>0.05）; compared with gel group， the protein expression of IGF-1 in spray group and Kangfuxin group was significantly decreased at each time point （P<0.01）. Compared with the model group， the protein expression level of VEGF in the wound tissue of the other four groups increased significantly at each time point （P<0.05 or P<0.01）; compared with the control group， there was no significant difference in the protein expression level of VEGF among spray group， gel group and Kangfuxin group （P>0.05）; compared with gel group， the protein expression level of VEGF in Kangfuxin group was lower on the 14th day （P<0.05）， and that of VEGF in the spray group on the 21st day （P<0.05）. Conclusion "Guhan Yuyang Recipe" can effectively promote the wound repair of diabetic skin ulcer rats. The mechanism of its curative effect may be related to the up-regulation of the expression of IGF-1 and VEGF， and the curative effect of gel is better than that of spray.

〔Keywords〕 diabetes mellitus; Guhan Yuyang Recipe; skin ulcer; insulin-like growth factor; vascular endothelial growth factor; rat

糖尿?。╠iabetes mellitus， DM）是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，到2030年，全球成年人（20～79歲）糖尿病患病率將從2010年的6.4%上升到7.7%[1]。目前，世界上有高達(dá)20%的糖尿病患者出現(xiàn)糖尿病皮膚潰瘍[2]，糖尿病性潰瘍現(xiàn)已成為慢性難愈性創(chuàng)面的首要病因[3]，嚴(yán)重危害著糖尿病患者的身心健康，使患者生活質(zhì)量顯著降低，給其家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和巨大的生存壓力，同時(shí)，還造成極大的醫(yī)療資源損耗。因此，研發(fā)促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍愈合的藥物刻不容緩。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin like growth factor-1， IGF-1）是參與細(xì)胞肉芽形成和再上皮化的合成胰島素樣生長(zhǎng)因子的多肽之一[4]，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是調(diào)控血管新生的主要因子[5]，二者在糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合中起著重要作用。

項(xiàng)目組前期已開(kāi)展了糖尿病足潰瘍的中藥內(nèi)服、外用治療研究[6]。近年來(lái)，名老中醫(yī)藥專(zhuān)家王凈凈教授受馬王堆漢墓出土的《五十二病方》治“癰”“疽”用藥思路啟發(fā)[7]，突破“清熱解毒、去腐生肌”的固有思維模式，創(chuàng)建出“溫、補(bǔ)、清、消”法兼施的“古漢愈瘍方”，該方最初作為中藥沐足方用于臨床治療糖尿病足潰瘍，療效滿(mǎn)意，后將其改良為便攜的凝膠劑和噴霧劑進(jìn)行研究，具體臨床數(shù)據(jù)正在整理中，并已申報(bào)相關(guān)專(zhuān)利。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察“古漢愈瘍方”對(duì)糖尿病皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面的修復(fù)作用，以公認(rèn)的促進(jìn)各種潰瘍愈合的有效藥物康復(fù)新液作為陽(yáng)性對(duì)照藥，初步探討“古漢愈瘍方”促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制，并比較其凝膠劑與噴霧劑的療效差異，為臨床應(yīng)用及劑型開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠80只，雄性，體質(zhì)量250～280 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009]代購(gòu)于湖南長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，各組分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間室溫控制在20～24 ℃，濕度50%～70%，定時(shí)給予標(biāo)準(zhǔn)飼料與純凈水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)程序由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)（編號(hào)：LL2019110701）。

1.2? 藥品與試劑

“古漢愈瘍方”藥材購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，經(jīng)醫(yī)院制劑中心質(zhì)檢科嚴(yán)格鑒定，符合《中華人民共和國(guó)藥典》和《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定。“古漢愈瘍方”凝膠劑：將卡波姆940加入適量蒸餾水中，放置過(guò)夜，使其充分溶脹，于攪拌下加入三乙醇胺，制成凝膠基質(zhì)。另將“古漢愈瘍方”提取物、羥苯乙酯溶于丙二醇及乙醇中，于攪拌下加入凝膠基質(zhì)中，再加蒸餾水至足量，攪勻，即得，裝罐密封，鈷-60輻照（劑量為5 kGy，符合《輻照食品衛(wèi)生管理辦法》）滅菌，低溫（4 ℃左右）保存?zhèn)溆?。“古漢愈瘍方”噴霧劑：將“古漢愈瘍方”提取液濃縮后加入0.3%苯甲酸鈉，攪勻即得，裝噴霧瓶密封，鈷-60輻照滅菌，低溫（4 ℃左右）保存?zhèn)溆?。康?fù)新液購(gòu)自湖南科倫制藥有限公司，批號(hào)：M171125。

鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：928T020）;10%水合氯醛（Wabcan公司，批號(hào)：ST1002）。

1.3? 主要儀器

CX23型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）;CM3050S型冰凍切片機(jī)（德國(guó) Leica公司）;KD-BM Ⅱ電腦生物組織包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）;HM325石蠟切片機(jī)（Thermo Scientific公司）;YD-A生物組織攤片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）;尼康D7100數(shù)碼相機(jī)（日本Nikon株式會(huì)社）;電子天平（北京六一儀器廠）;三諾GA-3血糖儀和血糖試紙（三諾生物傳感股份有限公司）。

1.4? 造模方法

1.4.1? 制作糖尿病大鼠模型[8]? 所有大鼠禁食不禁水20 h，將STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH4.2～4.5），配制成1%溶液，隨機(jī)選取15只作為對(duì)照組，其余65只大鼠稱(chēng)重后，按STZ 50 mg/kg一次性腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病模型，并分別于STZ腹腔注射前1天及注射后第3、7、14天取大鼠尾靜脈血，檢測(cè)隨機(jī)血糖。以注射后第3天的隨機(jī)血糖值大于16.7 mmo1/L，且穩(wěn)定2周，并表現(xiàn)出明顯的多飲、多食及多尿者，判定為糖尿病大鼠模型成功。共造模成功62只，成模率95.38%，死亡率1.54%。

1.4.2? 制作皮膚潰瘍模型[9]? 篩選出糖尿病造模成功的所有糖尿病大鼠與對(duì)照組的15只正常大鼠一起制作皮膚潰瘍模型，大鼠予以麻醉后俯臥位固定，脫毛，造模區(qū)（頸后脊柱區(qū)）用直徑15 mm的圓形打孔器標(biāo)記造模面積，在嚴(yán)格無(wú)菌操作技術(shù)下，用外科方法剪去標(biāo)記好的造模區(qū)皮膚，深達(dá)皮下筋膜，制成皮膚缺損開(kāi)放性創(chuàng)面的大鼠皮膚潰瘍模型，以無(wú)菌紗布覆蓋，醫(yī)用膠帶固定，分籠飼養(yǎng)。

1.5? 分組與給藥方法

對(duì)照組15只予凡士林紗布覆蓋創(chuàng)面。隨機(jī)選取皮膚潰瘍模型成功的60只糖尿病大鼠按血糖水平編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，分別為模型組、古漢愈瘍方噴霧治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)噴霧組）、古漢愈瘍方凝膠治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)凝膠組）、康復(fù)新液治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)康復(fù)新組），每組15只。模型組予凡士林紗布覆蓋創(chuàng)面;噴霧組噴適量“古漢愈瘍方”噴霧劑，并用內(nèi)側(cè)沾有“古漢愈瘍方”噴霧劑的無(wú)菌紗布覆蓋創(chuàng)面;凝膠組涂抹適量“古漢愈瘍方”凝膠，并用內(nèi)側(cè)沾有“古漢愈瘍方”凝膠的無(wú)菌紗布覆蓋創(chuàng)面;康復(fù)新組涂抹康復(fù)新液，并用內(nèi)側(cè)沾有康復(fù)新液的無(wú)菌紗布覆蓋創(chuàng)面。各組大鼠每日換藥1次，祛除創(chuàng)口硬痂，使用聚維酮碘消毒，連續(xù)換藥21 d。

1.6? 創(chuàng)面愈合情況及動(dòng)態(tài)收縮率的測(cè)定

分別于給藥后0、3、7、14、21 d觀察各組大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合情況，用數(shù)碼相機(jī)在固定高度、固定焦距、固定標(biāo)尺下拍照，并用Imagepro Plus 6.0軟件計(jì)算創(chuàng)面收縮面積及創(chuàng)面收縮率[10]。創(chuàng)面收縮率（%）=（初始創(chuàng)面面積-觀察日創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.7? 標(biāo)本采集與制備

分別在換藥后7、14、21 d隨機(jī)選取5只大鼠的創(chuàng)面肉芽組織，固定于4%多聚甲醛中，然后脫水、包埋、切片，分別做 HE染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.8? HE染色觀察創(chuàng)面肉芽組織病理變化

取各組大鼠的創(chuàng)面肉芽組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h后用蒸餾水清洗，置于不同濃度的乙醇中進(jìn)行梯度脫水，制作組織蠟塊，冰上預(yù)冷切片，二甲苯脫蠟30 min，在不同濃度梯度的乙醇溶液中復(fù)水，使用蘇木精和伊紅染液分別染細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，脫水、透明后用中性樹(shù)膠封片，在光鏡下觀察7、14、21 d不同組間潰瘍創(chuàng)面新鮮肉芽組織、毛細(xì)血管生長(zhǎng)分布、成纖維細(xì)胞形態(tài)數(shù)量及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。

1.9? 免疫組化法檢測(cè)IGF-1和VEGF的蛋白表達(dá)

免疫組化實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，封閉，加入一抗、二抗，DAB顯色（陽(yáng)性為棕黃色），脫水封片等，制片后采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察分析。每張切片隨機(jī)抽取5個(gè)互不重疊的視野觀察照相，圖片使用Imagepro Plus 6.0軟件分析，測(cè)定單位面積陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的光密度值，并計(jì)算平均光密度值（圖片上各點(diǎn)的光密度值累加起來(lái)得到的IOD值與相應(yīng)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的面積Area的比值）作為每張切片該蛋白的表達(dá)情況。

1.10? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“x±s”表示，先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)：符合正態(tài)分布者，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。均以P<0.05或P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 創(chuàng)面愈合情況及動(dòng)態(tài)收縮率

創(chuàng)面形態(tài)學(xué)表明，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組大鼠創(chuàng)面逐漸縮小，21 d創(chuàng)面完全愈合，瘢痕幾乎不可見(jiàn);模型組創(chuàng)面化膿，3 d稠液滲出量較多，7 d形成干燥黃色膿痂，14 d創(chuàng)面縮小緩慢，21 d創(chuàng)面仍未完全愈合、有鮮紅色肉芽生長(zhǎng);噴霧組和凝膠組創(chuàng)面呈向心性生長(zhǎng)，有黑色血痂覆蓋，其中凝膠組創(chuàng)面愈合速度較噴霧組更快，7 d創(chuàng)面明顯縮小、肉芽組織生長(zhǎng)良好，14 d創(chuàng)面大部分上皮化，21 d創(chuàng)面完全愈合、瘢痕較噴霧組更小;康復(fù)新組愈合速度較凝膠組緩慢，21 d創(chuàng)面尚未完全愈合;與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，除21 d凝膠組與之比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，給藥3、7、14、21 d各組創(chuàng)面收縮率均顯著偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，給藥3、7、14、21 d時(shí)，對(duì)照組、噴霧組、凝膠組和康復(fù)新組創(chuàng)面收縮率均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與凝膠組同時(shí)間點(diǎn)比較，除21 d康復(fù)新組與之比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，噴霧組與康復(fù)新組創(chuàng)面收縮率均顯著偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01） 。見(jiàn)圖1-2。

2.2? 創(chuàng)面肉芽組織的病理變化

HE染色結(jié)果顯示，噴霧組和康復(fù)新組可見(jiàn)大量新生的成纖維細(xì)胞和擴(kuò)張的毛細(xì)血管，組織結(jié)構(gòu)緊密，還有新生毛囊組織生成，二者與模型組相比，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少;對(duì)照組和凝膠組中上述現(xiàn)象更為顯著，新鮮肉芽組織明顯增生，毛細(xì)血管生長(zhǎng)迅速，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，促使組織結(jié)構(gòu)緊密。見(jiàn)圖3。

2.3? 創(chuàng)面肉芽組織IGF-1和VEGF的蛋白表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，各組創(chuàng)面肉芽組織IGF-1的蛋白表達(dá)水平在7 d達(dá)峰值后逐漸下降。與模型組比較，其余4組在各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織中IGF-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與對(duì)照組比較，凝膠組各時(shí)間點(diǎn)IGF-1的蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），而7 d、21 d噴霧組與康復(fù)新組IGF-1的蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），14 d對(duì)照組、噴霧組與康復(fù)新組三者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與凝膠組比較，噴霧組與康復(fù)新組在各時(shí)間點(diǎn)IGF-1的蛋白表達(dá)均降低（P<0.01）。各組創(chuàng)面肉芽組織VEGF的蛋白表達(dá)水平均漸增至14 d達(dá)峰值后逐漸下降，且除模型組外，其余4組VEGF的蛋白表達(dá)均處于穩(wěn)定、較高水平。與模型組比較，其余4組在各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織中VEGF的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與對(duì)照組比較，噴霧組、凝膠組與康復(fù)新組VEGF的蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與凝膠組比較，康復(fù)新組VEGF的蛋白表達(dá)水平在14 d 偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），噴霧組VEGF的蛋白表達(dá)水平在21 d偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4-6。

3 討論

糖尿病皮膚潰瘍屬中醫(yī)學(xué)“潰瘍”“瘡瘍”“壞疽”“脫疽”“頑瘡”等范疇，是臨床常見(jiàn)、治療棘手的糖尿病并發(fā)癥，有遷延不愈、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，其多因消渴日久、氣血陰陽(yáng)俱損、氣血不能暢行，本虛而六淫外邪侵襲，并由于郁、瘀、痰、濁錯(cuò)綜復(fù)雜，損傷四末而發(fā)病[11]。宗文靜等[12]認(rèn)為痰瘀在糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，若糖尿病患者皮膚脈絡(luò)瘀阻，皮膚失去氣血濡養(yǎng)，可出現(xiàn)瘙癢、潰瘍等多種皮膚病變。中醫(yī)藥在治療糖尿病皮膚潰瘍上一直未停下研究的腳步，如杜文玉等[13]發(fā)現(xiàn)廣泛外用于嚴(yán)重或難治性皮膚潰瘍的金創(chuàng)抗菌膏也可有效治療糖尿病大鼠的皮膚潰瘍。中醫(yī)藥在治療及研究方面總結(jié)出“益氣養(yǎng)陰，清熱解毒，化瘀祛腐，活血通絡(luò)”等治法[14]，但這些治法有其局限性，臨床療效不甚滿(mǎn)意。因此，需要從不同的思路進(jìn)一步探討糖尿病皮膚潰瘍的中醫(yī)藥治療。王凈凈教授系全國(guó)第五批名老中醫(yī)藥專(zhuān)家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師、國(guó)家中醫(yī)藥管理局全國(guó)名老中醫(yī)藥專(zhuān)家傳承工作室指導(dǎo)專(zhuān)家，其受馬王堆漢墓出土的《五十二病方》治“癰”“疽”用藥思路啟發(fā)[7]，創(chuàng)建出“溫、補(bǔ)、清、消”法兼施的“古漢愈瘍方”，方由肉桂、干姜、黃芪、白芍、白薇、白及、澤蘭等多味藥組成。肉桂、干姜均為辛甘大熱之品，用之可散寒溫陽(yáng)、通暢氣血，著名的用于治療“陰疽”的陽(yáng)和湯就含有此二者，此乃“溫”法。趙光明等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂、干姜等回陽(yáng)生肌方藥能通過(guò)促進(jìn)創(chuàng)面毛細(xì)血管和肉芽組織的生成來(lái)加快創(chuàng)面愈合。黃芪補(bǔ)氣，有良好的托毒生肌功效，為治療氣血不足所致癰疽不潰、潰久不斂之要藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰：“黃芪，味甘，微溫。主癰疽，久敗創(chuàng)，排膿、止痛……補(bǔ)虛，小兒百病”，加白芍養(yǎng)血斂陰，此乃“補(bǔ)”法。已有文獻(xiàn)證實(shí)，黃芪中的黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)抵抗力、抗炎、抗糖尿病以及促進(jìn)與血管新生、組織修復(fù)有關(guān)的生物活性等作用，可能在炎癥和組織重塑的不同階段，通過(guò)多個(gè)途徑參與修復(fù)過(guò)程，促進(jìn)糖尿病難愈性創(chuàng)面愈合[16]。余玲等[17]通過(guò)臨床觀察得出黃芪桂枝湯可改善微炎癥反應(yīng)，促進(jìn)周?chē)杏X(jué)神經(jīng)功能的恢復(fù)，明顯提高患者臨床療效，顯著縮短其療程。白薇味苦、咸，性寒，其所長(zhǎng)為既清實(shí)熱，又退虛熱，還有解毒療瘡之效，此乃“清”法。澤蘭可活血祛瘀、散滯消腫，《玉楸藥解》謂之“一切癰疽癥瘕、金創(chuàng)撲打、吐衄諸證皆醫(yī)”。白及味苦、澀，有寒涼苦泄之性，可收斂止血、消腫生肌，用治瘡癰腫毒更是無(wú)論未潰已潰都可運(yùn)用，若是瘡癰初起，可消癰散結(jié)，若是瘡癰已潰，又可止血生肌，此乃“消”法。雷霆等[18]研究證明了三七-白及膠海綿外敷于糖尿病足潰瘍創(chuàng)面后可有效促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。“古漢愈瘍方”諸藥合用，諸法共施，兼具“益氣活血、溫陽(yáng)通絡(luò)、清熱解毒、去腐生肌”等多重功效，多方位治療糖尿病皮膚潰瘍，以期達(dá)到更好的療效。本研究顯示，“古漢愈瘍方”噴霧劑和凝膠劑均可提高糖尿病大鼠創(chuàng)面收縮率，使用1周后，“古漢愈瘍方”凝膠劑提高糖尿病大鼠創(chuàng)面收縮率的能力顯著高于“古漢愈瘍方”噴霧劑和康復(fù)新液，略低于正常大鼠創(chuàng)面愈合能力。HE染色顯示，“古漢愈瘍方”能促使新鮮肉芽組織增生，毛細(xì)血管生長(zhǎng)迅速，成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，組織結(jié)構(gòu)緊密，且上述作用以“古漢愈瘍方”凝膠劑最為顯著，與提高糖尿病大鼠創(chuàng)面收縮率的能力趨勢(shì)一致，因此，“古漢愈瘍方”可有效促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合。

胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factors，IGFs）是一類(lèi)能促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)和分化的因子。IGFs的缺乏，會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞正常生理再生障礙和病理?yè)p傷后修復(fù)不良，減少神經(jīng)的營(yíng)養(yǎng)支持，導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)病變發(fā)生[19]。IGF-1是合成IGFs的多肽之一，其參與細(xì)胞肉芽形成和再上皮化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞趨化、促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[4]。VEGF是調(diào)控血管新生的主要因子，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)新生血管生成，同時(shí)可以降解血管周?chē)?xì)胞外基質(zhì)，增加血管通透性，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性，創(chuàng)造有利于肉芽組織生長(zhǎng)和創(chuàng)面愈合的環(huán)境[5]。糖尿病患者皮膚組織損傷后，局部VEGF水平下降，是其創(chuàng)面不易修復(fù)的重要原因之一。張東萍等[20]通過(guò)糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)證明，血竭生肌膏可通過(guò)提高潰瘍創(chuàng)面VEGF的表達(dá)，促進(jìn)新生血管形成來(lái)加快創(chuàng)面愈合。由此可見(jiàn)，IGF-1和VEGF是糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的重要指標(biāo)。潰瘍后的前3周是潰瘍愈合的關(guān)鍵時(shí)期，本研究顯示，糖尿病大鼠皮膚潰瘍后的第7、14、21天，“古漢愈瘍方”噴霧劑和凝膠劑均可顯著上調(diào)糖尿病大鼠創(chuàng)面組織中IGF-1、VEGF的蛋白表達(dá)，且“古漢愈瘍方”凝膠劑提高兩個(gè)蛋白表達(dá)水平的能力均顯著強(qiáng)于噴霧劑和康復(fù)新液。綜上所述，可初步推斷糖尿病患者的小血管病變導(dǎo)致潰瘍皮膚微循環(huán)障礙，創(chuàng)面難以愈合，“古漢愈瘍方”在“清熱解毒、去腐生肌”基礎(chǔ)上加用“益氣活血、溫陽(yáng)通絡(luò)”之品，通過(guò)上調(diào)IGF-1、VEGF的表達(dá)，促進(jìn)其分泌，從而促進(jìn)局部血液循環(huán)，創(chuàng)造有利于肉芽組織生長(zhǎng)的環(huán)境，從而加速細(xì)胞肉芽形成和再上皮化，也刺激和加速了炎癥細(xì)胞向傷口床募集，繼而促進(jìn)糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面的愈合。

創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，糖尿病慢性皮膚潰瘍的愈合更是復(fù)雜而漫長(zhǎng)。有研究顯示，水凝膠作為目前最受歡迎的糖尿病足敷料，可為干燥和脫落的傷口提供液體和良好的水合作用，尤其適用于具有壞死性焦痂的干燥傷口[21]。將促進(jìn)創(chuàng)面愈合的相關(guān)生長(zhǎng)因子制成凝膠劑，可大大地加速創(chuàng)面的愈合。如自體富血小板凝膠不僅具有抗菌活性，還可促進(jìn)生長(zhǎng)因子細(xì)胞增殖，加速創(chuàng)面愈合[22]。又如安宏元等[23]發(fā)現(xiàn)rhEGF凝膠較水劑更能促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面肉芽組織的形成和再上皮化，明顯縮短潰瘍愈合時(shí)間，加快潰瘍面積縮小速度，顯著促進(jìn)潰瘍愈合。受此啟發(fā)，除將古漢愈瘍方制成傳統(tǒng)的噴霧劑以外，還制作了凝膠劑，通過(guò)對(duì)比二者的療效來(lái)確定適用于臨床的最佳劑型。本研究證明，凝膠劑比噴霧劑療效更佳，且強(qiáng)于康復(fù)新液。凝膠劑優(yōu)于噴霧劑的原因可能有以下兩點(diǎn)：一是凝膠劑質(zhì)地均勻，生物黏附性好，易全面鋪展于創(chuàng)面，形成一層特有的保護(hù)膜，既隔絕了空氣，不易滋生細(xì)菌，又能使藥物的有效成分充分且持久、緩釋地與創(chuàng)面組織相結(jié)合，從而加速創(chuàng)面愈合;而噴霧劑雖然吸收迅速，但易蒸發(fā)，導(dǎo)致有效成分與創(chuàng)面接觸時(shí)間較短，所以療效不如凝膠劑顯著。二是凝膠劑有舒緩、安撫傷口的作用，還能保濕、潤(rùn)滑傷口，可大大減輕敷料的直接刺激，防止敷料與潰瘍創(chuàng)面粘連，造成二次損傷;而噴霧劑無(wú)此作用，每次換藥揭開(kāi)傷口會(huì)帶有少許血痂，導(dǎo)致傷口再次損傷出血，所以傷口愈合較緩慢。此外，噴霧劑穩(wěn)定性不佳，不利于儲(chǔ)存，洪兵等[24]經(jīng)研究證明，中藥足浴通過(guò)中藥經(jīng)皮吸收和物理溫?zé)岽碳さ碾p重作用，刺激周?chē)つw的血管擴(kuò)張、血流加速，以調(diào)理腠理、暢通血脈、調(diào)理臟腑，從而改善循環(huán)和周?chē)軆?nèi)皮的功能，使藥力直達(dá)病所，更為有效地改善患肢血液循環(huán)，因此，可考慮將噴霧劑作為足浴湯劑，足浴后涂抹凝膠劑，二者配合使用，療效更佳?；隈R王堆漢墓出土的《五十二病方》所創(chuàng)制的“古漢愈瘍方”，作為純中藥制劑用于專(zhuān)治糖尿病皮膚潰瘍的研究前景十分可觀，但其促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的分子機(jī)制、劑型工藝的優(yōu)化及臨床應(yīng)用等將有待進(jìn)一步研究。

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