丁 梅

（梅河口市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，吉林 梅河口 135000）

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉是食品中應(yīng)用最廣泛、最常見的食品添加劑，在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[1]中明確規(guī)定了其使用范圍和限量，被國(guó)家食品安全監(jiān)管部門列為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)項(xiàng)目。目前食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉測(cè)定方法有液相色譜法[2-8]和氣相色譜法[8-10]和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11]，其中高效液相色譜法因檢驗(yàn)成本低、前處理簡(jiǎn)單、設(shè)備通用性和普及性好而成為主要檢測(cè)方法之一。目前色譜分析主要是以保留時(shí)間進(jìn)行定性，對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，相同保留時(shí)間段常有基質(zhì)干擾峰出現(xiàn)，尤其是以一種流動(dòng)相洗脫下的保留時(shí)間進(jìn)行定性往往會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性樣品。本文根據(jù)目標(biāo)物的出峰時(shí)間會(huì)隨著流動(dòng)相pH 值的不同而發(fā)生改變這一現(xiàn)象[12-13]，研究以乙酸銨溶液+甲醇（95+5）為流動(dòng)相出現(xiàn)可疑峰時(shí)，再以（甲酸-乙酸銨溶液）+甲醇（92+8）為流動(dòng)相分析可疑峰，通過不同pH 的兩種流動(dòng)相洗脫下的保留時(shí)間進(jìn)行綜合定性分析，可以有效避免由樣品基質(zhì)干擾出現(xiàn)假陽(yáng)性樣品，在實(shí)際檢測(cè)工作中效果 較好。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC20AT 高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器，日本島津公司）；重載數(shù)顯型渦旋混合器（美國(guó)Talboys公司）；KQ-500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KH20R-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

甲醇、甲酸（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司）。

20 mmol·L-1乙酸銨溶液：稱取1.54 g 優(yōu)級(jí)純乙酸銨（Alfa Aesar），加1 000 mL 水溶解，過0.22 μm濾膜后備用。

甲酸-乙酸銨溶液（2 mmol·L-1甲酸-20 mmol·L-1乙酸銨）：在1 000 mL 乙酸銨溶液（20 mmol·L-1）中加入75.2 μL 甲酸，混合后過0.22 μm 濾膜后備用。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Shimpack VP-ODS（5 μm，250 mm× 4.6 mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流動(dòng)相1：20 mmol·L-1乙酸銨溶液+甲醇（95+5）；流動(dòng)相2：甲酸-乙酸銨溶液（2 mmol·L-1甲酸-20 mmol·L-1乙酸銨）+甲醇（92+8）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.01 g 于10 mL 容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容，配制的儲(chǔ)備液濃度均為 1 mg·mL-1。

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確吸取苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，用超純水逐級(jí)稀釋配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度為 5 μg·mL-1。

1.4 樣品處理

稱取樣品2 g（精確至0.001 g）于50 mL 具塞刻度試管中，加入25 mL 水，渦旋1 min，超聲30 min，加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2 mL，混勻，加水定容至刻度，靜置30 min。取適量上清液于 10 000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm 濾膜備用。

1.5 定性分析

以乙酸銨溶液+甲醇（95+5）為流動(dòng)相，分別進(jìn)樣混標(biāo)液和樣液，經(jīng)色譜柱分離后以保留時(shí)間定性，若出現(xiàn)可疑色譜峰時(shí)，再以甲酸-乙酸銨溶液+甲醇（92+8）為流動(dòng)相分析可疑峰，采用兩種流動(dòng)相洗脫下的保留時(shí)間進(jìn)行綜合定性分析，進(jìn)一步定性驗(yàn)證樣品中可疑色譜峰是否為目標(biāo)峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 以乙酸銨溶液+甲醇為流動(dòng)相的檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)選取市售肉千子、蛋糕、冷面、紅方樣品，經(jīng)前處理后，以乙酸銨溶液+甲醇（95+5）為流動(dòng)相（流動(dòng)相1）進(jìn)行色譜分析，并與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖進(jìn)行比較。以保留時(shí)間定性可知，肉千子中檢出山梨酸，未檢出苯甲酸、糖精鈉（圖1）；蛋糕中檢出糖精鈉，未檢出苯甲酸、山梨酸（圖2）；冷面中檢出山梨酸，未檢出苯甲酸、糖精鈉（圖3）；紅方中檢出苯甲酸，未檢出山梨酸、糖精鈉（圖4）。

圖1 肉千子樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（流動(dòng)相1）

圖2 蛋糕樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（流動(dòng)相1）

圖3 冷面樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（流動(dòng)相1）

圖4 紅方樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（流動(dòng)相1）

2.2 以甲酸-乙酸銨溶液+甲醇為流動(dòng)相的定性確證

將上述肉千子、蛋糕、冷面、紅方樣品，以甲酸-乙酸銨溶液+甲醇（92+8）為流動(dòng)相（流動(dòng)相2）進(jìn)行色譜分析，并與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖進(jìn)行比較。以保留時(shí)間定性可知，肉千子中未檢出苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（圖5）；蛋糕中未檢出苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（圖6）；冷面中檢測(cè)出山梨酸，未檢出苯甲酸、糖精鈉（圖7）；紅方中未檢出苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（圖8）。由兩種流動(dòng)相保留時(shí)間綜合定性分析得出，肉千子中山梨酸為假陽(yáng)性，蛋糕中糖精鈉為假陽(yáng)性，冷面中山梨酸為陽(yáng)性，紅方中苯甲酸為假陽(yáng)性。

圖5 肉千子樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（流動(dòng)相2）

圖7 冷面樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（流動(dòng)相2）

2.3 樣品檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)選取市售樣品基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜的15 種樣品進(jìn)行苯甲酸、山梨酸、糖精鈉測(cè)定，分別以兩種流動(dòng)相洗脫進(jìn)行色譜分析，定性結(jié)果見表1。以乙酸銨溶液+甲醇（95+5）為流動(dòng)相時(shí)，15 種樣品中均檢測(cè)出食品添加劑；以甲酸-乙酸銨溶液+甲醇（92+8）為流動(dòng)相時(shí)，15 種陽(yáng)性樣品中有12 種樣品為假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率80%。這是由于基質(zhì)復(fù)雜樣品僅以一種流動(dòng)相的保留時(shí)間進(jìn)行定性時(shí)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性樣品，而以兩種流動(dòng)相保留時(shí)間綜合定性驗(yàn)證，才能使樣品檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

表1 樣品中山梨酸、苯甲酸、糖精鈉定性確證結(jié)果

圖8 紅方樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（流動(dòng)相2）

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定基質(zhì)復(fù)雜樣品中的山梨酸、苯甲酸、糖精鈉，采用不同pH 的兩種流動(dòng)相洗脫下的保留時(shí)間進(jìn)行綜合定性分析，可有效避免由樣品基質(zhì)干擾出現(xiàn)的假陽(yáng)性樣品的情況。該方法在實(shí)際工作中得到了較好的應(yīng)用，發(fā)揮了有效的作用。