王嘉敏，王逐鹿，常思佳，劉漢雄，王震宇

（大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

我國豬血資源非常豐富，作為我國一大禽畜類血液，我國對動物血液的使用率較低，基本都是被用來制作成一些血腸、血豆腐等食品，但這些傳統(tǒng)食品的加工效率低、帶來的綜合效益也較低[1]。近年來對動物血液的研究才逐漸豐富起來，在食品加工和生物醫(yī)藥中的應(yīng)用也逐漸增多，如制作一些新型血液制品等，提高了我國血液的開發(fā)利用程度[2-4]。豬血作為畜產(chǎn)品加工的副產(chǎn)物，因其血腥味較重、呈現(xiàn)的鮮紅色或者深紅色的色澤差、儲藏期短，限制了對豬血的利用，諸多因素導(dǎo)致目前我國血液加工利用率水平低、產(chǎn)品附加值低，寶貴的血資源得不到充分的利用，更難以發(fā)揮其蛋白的價值。已有研究表明血漿能夠抑制魚糜凝膠劣化過程中組織蛋白酶活性、增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度[5-7]。但是，血漿直接添加可能會導(dǎo)致產(chǎn)品顏色、風(fēng)味的顯著變化，影響魚糜品質(zhì)，因此開發(fā)基于血漿的組織蛋白酶抑制肽能夠有效避免上述劣勢，為豬血漿的綜合利用及其制品在水產(chǎn)加工中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 原料與試劑

新鮮豬血（已加入抗凝劑），購買于大連市仟和市場；胰蛋白酶與組織蛋白酶L 購買于江蘇南京沃瑞達(dá)斯有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器

超高效液相四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCQ-TOF Impact II），德國Bruker 公司；分子對接軟件Discovery Studio v2017，法國Dassault Systèmes 公司；AKTA avant-25 蛋白純化儀，美國Cytiva 公司。

1.3 方法

1.3.1 豬血漿蛋白的制備

新鮮豬血漿在4 000 g、10 min 條件下進(jìn)行離心，取上清液。加入硫酸銨至30%飽和度，4 ℃靜置6 h后，8 000 g 離心20 min 取上清，在上清液中繼續(xù)添加硫酸銨至60%飽和度，4 ℃靜置6 h 后10 000 g 離心 20 min 取沉淀的蛋白，加入3 倍（v/w）的PB 緩沖液 （20 mmol·L-1，pH 6.8），在3 500 Da 透析袋中透析12 h，去除其中多余的硫酸銨，4 ℃保存用于后續(xù)酶解反應(yīng)。

1.3.2 多肽的酶解制備

在透析過的蛋白溶液中，按200 ∶1（原料蛋白∶胰蛋白酶）（w/w）的比例加入胰蛋白酶，在45 ℃，pH 8.0 的條件下酶解3 h，每隔30 min 用0.5 mol·L-1的NaOH 溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)維持pH 恒定，采用pH-state法對酶解過程中的水解度進(jìn)行測定[8]，水解度的計算公式為

式中：h為酶解液中生成的游離氨基的數(shù)量，mmol·g-1protein；hhot為底物中蛋白質(zhì)中肽鍵的總數(shù)，mmoL·g-1protein，在本實驗中根據(jù)原料種類選取8.8 mmoL·g-1protein[9]；B為滴定消耗NaOH 的體積，mL；Nb為用于滴定的NaOH 濃度，mol·L-1；a為氨基的解離度，其計算參考公式（2）；Mp為底物中蛋白質(zhì)的總含量，g。

式中：pH取酶解體系pH 值8.5；堿滴定的情況下pK為氨基解離常數(shù)，取值7.5。

1.3.3 多肽混合物的弱陰離子交換層析

酶解后的多肽混合物使用AKTA avant-25 儀器以及DEAE-Sepharose 柱進(jìn)行分離純化[10]，用含有不同氯化鈉濃度的流動相進(jìn)行梯度洗脫，梯度設(shè)置為 0.1 mol·L-1、0.2 mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4 mol·L-1和 0.5 mol·L-1氯化鈉濃度，每個濃度梯度沖洗一個柱體積，流速為1 mL·min-1，按峰收集，并測定抑制活性。

1.3.4 多肽混合物的超濾分級

取抑制活性最強(qiáng)的陰離子交換組分，分別采用 3 kDa 和10 kDa 的超濾膜進(jìn)行分級，分別得到分子量為0 ～3 kDa、3 ～10 kDa 以及10 kDa 以上3 個分子量組分。分別進(jìn)行凍干，超純水復(fù)溶后測定抑制活性。

1.3.5 多肽組織蛋白酶抑制活性的測定

組織蛋白酶L 活性的測定按照Barrett 方法[11-12]，并略微有改動。

（1）組織蛋白酶L 活力的測定。一個酶活力單位（U）定義為在反應(yīng)溫度37 ℃及條件下，1 min 內(nèi)能夠水解底物并釋放出1 nmol AMC 所需的酶量（1 nmol AMC·min-1）。①溶液配制。反應(yīng)終止液：0.1 mol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖液，含0.1 mol·L-1氯乙酸（pH為6.0）；反應(yīng)緩沖液：0.34 mol·L-1乙酸鈉、0.06 mol·L-1冰乙酸、4 mmol·L-1EDTA-2Na、8 mmol·L-1DTT；底物：Z-苯丙胺酰-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素配制成40 μmol·L-1的溶液，作為組織蛋白酶L 的專一性底物。②組織蛋白酶L 活力的測定。組織蛋白酶L 與PB 緩沖液按照5 ∶2 充分混合，取混合液100 μL，加入底物Z-苯丙胺酰-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素25 μL，加入反應(yīng)緩沖液50 μL，充分混勻37 ℃水浴15 min，然后再加入200 μL 反應(yīng)終止液，混勻后終止反應(yīng)，用熒光分光光度計測定其熒光強(qiáng)度。測定所用的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為380 nm和460 nm。

（2）豬血漿對組織蛋白酶L 的抑制活性的測定。樣品1：0 ～3 kDa；樣品2：3 ～10 kDa，樣品3：10 kDa 以上。測樣溶液按照表1 進(jìn)行配制，混勻后37 ℃水浴15 min。

表1 測樣制備

（3）抑制率測定。在激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長460 nm 條件下用熒光分光光度計測定其熒光強(qiáng)度，設(shè)置對照組為A1，空白組為A2，樣品為A3。抑制率測定公式為

1.3.6 超高效液相四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜測定多肽氨基酸序列

通過用超高效液相四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法對多肽溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，具體方法參考文獻(xiàn)[13]，在NCBI 網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)庫檢索豬（S.scrofa）的基因庫[14]，進(jìn)行氨基酸序列比對。

1.3.7 分子對接

將比對完的多肽氨基酸序列進(jìn)行篩選，用分子對接軟件Discovry Studio 2017 模擬抑制肽與組織蛋白酶L（PDB ID：3BC3）相互作用，并分析具體的相互作用結(jié)合的具體氨基酸，作用活性位點[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬血漿蛋白的水解過程

由圖1 可知，酶解前期，在0 ～1.0 h，由于底物蛋白濃度較高，胰蛋白酶活旺盛，酶解體系pH基本不變，酶解程度較高，蛋白酶水解較快，水解度高幅度增長；隨著酶解的持續(xù)進(jìn)行，從進(jìn)行酶解 1.0 h 后胰蛋白酶酶解速度開始降低，胰蛋白酶降解，酶解體系pH 變化大，酶解速度降低，水解度雖然一直有提升趨勢但增長變得逐漸緩慢。胰蛋白酶酶解 3.0 h 的水解度為3.65%。

圖1 酶解反應(yīng)中蛋白水解度變化曲線

對血漿全蛋白、鹽析得到的蛋白沉淀以及酶解后得到的多肽混合物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2 所示，豬血漿蛋白分子量大小基本集中在50 kDa 以上，少部分為15 kDa 和25 kDa，由此可得出豬血漿中的蛋白大多都可被胰蛋白酶水解為肽；用硫酸銨鹽溶液鹽析后的血漿蛋白分子量大小集中于50 ～75 kDa，少部分為25 kDa 和15 kDa，比鹽析之前的血漿蛋白量有所減少，說明鹽析使得大部分蛋白沉淀下來；血漿蛋白酶解后，大蛋白幾乎被降解，肽的分子量主要集中分布在20 kDa 以下，呈彌散條帶，分布范圍廣，說明大部分蛋白基本都被酶解為肽，且酶解后的肽其中的成分復(fù)雜，由多種小分子肽組成。

圖2 豬血漿蛋白及鹽析和酶解后的SDS-PAGE 凝膠電泳分析

2.2 豬血漿半胱氨酸蛋白酶抑制肽的分離純化

根據(jù)目標(biāo)多肽的性質(zhì)預(yù)測，選用陰離子交換層析作為第一步純化。大量呈正電荷的多肽沒有被填料吸附，在梯度洗脫程序前即流出。使用含有氯化鈉的緩沖液，通過改變進(jìn)入柱子的緩沖液的電導(dǎo)率，將不同結(jié)合力的蛋白沖洗下來并進(jìn)行收集。根據(jù)出峰結(jié)果適當(dāng)調(diào)整氯化鈉濃度梯度，最終得到如圖3所示的4 個分離完全、不拖尾的洗脫峰，按出峰位置分別收集洗脫液。

圖3 豬血漿酶解物DEAE-弱陰離子交換層析分離純化

從表2 中可以看出經(jīng)過陰離子交換層析后，帶有負(fù)電荷的多肽組分普遍具有更高的酶活抑制率，其中洗脫峰1 的抑制率最高，為26.83%。雖然其體現(xiàn)出了較顯著的組織蛋白酶抑制活性，但抑制率仍較低，需要對其組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

表2 豬血漿酶解物陰離子交換層析后組分的酶活抑制率

進(jìn)一步采用超濾分級的方式對洗脫峰1 中的組分進(jìn)行分離，并對回收的多肽組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，如圖4 所示。由圖4 可知，10 kDa 以上超濾截留液中含有大量分子量15 kDa 左右以及超 35 kD 的蛋白，而0 ～3 kDa 超濾截留液中幾乎不含有大分子蛋白條帶，僅顯示了最下端的多肽條帶，3 ～ 10 kDa 超濾截留液中大蛋白含量明顯減少，小分子蛋白和多肽的條帶明顯。在對上述3 個組分進(jìn)行組織蛋白酶抑制率分析后（表3），可見小分子量組分普遍具有更高的酶抑制活性，其中洗脫峰1 中分子量0 ～3 kDa 的組分其酶活抑制率最高，達(dá)35.15%。該組分具有一定量的負(fù)電荷，同時分子量較小，能有效與組織蛋白酶相結(jié)合，進(jìn)而達(dá)到競爭性抑制的效果，但具體多肽的氨基酸序列情況以及發(fā)揮功效的作用機(jī)制還有待探究。因此有必要對其中的多肽氨基酸序列進(jìn)行測定分析。

圖4 豬血漿蛋白酶解超濾后肽的SDS-PAGE 凝膠電泳分析

表3 洗脫峰1 中不同分子量組分的酶活抑制率

2.3 組織蛋白酶抑制肽組分中的多肽氨基酸序列

將超濾分級后分子量為0 ～3 kDa 的肽溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。在Mascot 軟件上對UPLC-Q-TOF 聯(lián)用質(zhì)譜后的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，再利用NCBI 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中豬的基因庫進(jìn)行多肽氨基酸序列的比對，一共比對出35 條肽段，如表4 所示，長度范圍為16 ～40 aa，分子量為2 013.9 ～4 306.7 Da，來源蛋白包括假定蛋白質(zhì)、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)錄激活蛋白Pur-alpha、 N-甲基轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞周期素依賴性激酶1、KH 結(jié)構(gòu)域RNA 結(jié)合蛋白、琥珀酰輔酶A 合成酶、血紅蛋白、肌聯(lián)蛋白、纖溶酶原、未表征蛋白、包膜糖蛋白、假定轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、唾液酸胎球蛋白、烯醇化酶1(α)、內(nèi)源性因子鈷胺素、F-box 蛋白、假定胰蛋白酶以及二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶1 等。根據(jù)目標(biāo)蛋白來源、細(xì)胞定位進(jìn)行篩選，例如琥珀酰輔酶A 合成酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄激活蛋白Pur-alpha、N-甲基轉(zhuǎn)移酶都是在酶解血漿蛋白時細(xì)胞所產(chǎn)生的作用酶，用以提供酶解過程的需要或者其他活動，不是豬血漿本身所含有物質(zhì)酶解之后產(chǎn)生的，是細(xì)胞生理活動中所產(chǎn)生的。因此，此類多肽氨基酸序列不做進(jìn)一步研究。根據(jù)上述超濾分級后酶活性測定等實驗的分析得到的分子量為0 ～3 kDa 的多肽氨基酸序列抑制率最高，篩選出分子量為3 kDa 以下的多肽氨基酸序列。再如，某些蛋白在血漿中的含量較少的也不作進(jìn)一步研究。因此本實驗共篩選出分子量小于3 kDa 的兩個肽段，如表4 所示，將序號24 和25 的兩條多肽氨基酸序列命名為PP1、PP2，PP1 蛋白來源為血紅蛋白，其氨基酸序列分別為EAVLGLWGKVNVDEVGGEALGR，長度為22 aa，分子量為2 267.2 Da，PP2 蛋白來源為纖溶酶原，其氨基酸序列為VILGAHEEYHLGEGVQEIDVSK，長度為22 aa，分子量為2 421.2 Da，然后進(jìn)一步通過分子對接模擬探索半胱氨酸蛋白酶抑制劑的作用機(jī)制。

表4 豬血漿中0 ～3 kDa 肽溶液質(zhì)譜分析后氨基酸序列檢索結(jié)果

2.4 抑制肽PP1 和PP2 與組織蛋白酶L 相互作用的機(jī)制

如圖5（a）所示，紅色球部為組織蛋白酶L 的作用部位，圖5（b）中球棍分子模型為PP1，條帶分子模型為組織蛋白酶L，其鉤狀凹下的部位為作用活性部位催化中心，PP1在組織蛋白酶L 的活性位點作用，阻止了組織蛋白酶L 與其他蛋白等物質(zhì)的結(jié)合作用，起到了抑制其作用活性的目的。圖6 所展示的是分子模擬分析二者相互作用位點附近關(guān)鍵氨基酸。表5 可以看出抑制劑與組織蛋白酶L 之間的相互作用情況，其分子間作用力有靜電力、氫鍵，其中氫鍵為二者發(fā)生相互作用的主要作用力，分子間作用力鍵長范圍為1.961 04 ～5.018 80 ?。分子模擬結(jié)果表明組織蛋白酶L 作用的作用位點為H166、H234、H239、H244、H256、H313，其氨基酸位點為LYS117、SER158、GLU159，肽作用位點為H3、H4、H6、H14、N15，其氨基酸位點為GLY20、GLN21、GLY23，在二者的混合體系中，兩者通過活性位點緊密貼合，并相互作用。

表5 PP1 與組織蛋白酶L 相互作用的關(guān)鍵氨基酸化學(xué)作用力類型及鍵長

圖5 組織蛋白酶L 的作用部位及其與PP1 相互作用的分子模擬

圖6 PP1 與組織蛋白酶L 相互作用位點附近的關(guān)鍵氨基酸

如圖7 所示，圖中條帶模型分子為組織蛋白酶L，球棍模型分子為PP2，以抑制劑纖溶酶原作為供體，組織蛋白酶L 為受體，鉤狀凹下的部位為作用活性部位催化中心，PP2 在組織蛋白酶L 的活性位點作用，阻止了組織蛋白酶L 與其他蛋白等物質(zhì)的結(jié)合作用，起到了抑制其作用活性的目的，與PP1 對組織蛋白酶L 的抑制作用原理是相同的。圖8 所顯示的是二者結(jié)合相互作用位點附近的關(guān)鍵氨基酸。抑制劑與蛋白酶之間相互結(jié)合的分子間作用力只有氫鍵，鍵長為2.443 32 ?，肽作用位點氨基酸為GLN21，組織蛋白酶L 作用位點為H243，作用活性位點只有一個的原因可能是PP2 與組織蛋白酶L 的相互結(jié)合的關(guān)系不緊密或PP2 對組織蛋白酶L 的抑制作用不明顯，作用力較弱，需要進(jìn)一步的實際實驗來進(jìn)行驗證和深入的研究。

圖7 PP2 與組織蛋白酶L 相互作用的分子對接模型

圖8 PP2 與組織蛋白酶L 相互作用位點附近的關(guān)鍵氨基酸

3 結(jié)論

本研究以豬血漿為研究對象，將其血漿蛋白經(jīng)過硫酸銨鹽溶液分級沉淀、胰蛋白酶酶解，再利用陰離子交換層析和超濾分級的方法對其中的半胱氨酸蛋白酶抑制肽組分進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)具有少量負(fù)電荷的多肽組分、分子量小于3 kDa 的組分具有更高的酶活抑制率，最高抑制率達(dá)35.15%，再通過UPLC-QTOF 聯(lián)用質(zhì)譜鑒定分析，然后在NCBI 中檢索比對抑制肽的氨基酸序列，并從中篩選出具有有效成分的多肽氨基酸序列PP1 和PP2，通過抑制肽與組織蛋白酶L 模擬分子對接分析抑制肽和組織蛋白酶L 的結(jié)合作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PP1 抑制肽可與組織蛋白酶L 通過活性中心緊密結(jié)合，模擬結(jié)果顯示PP1 與組織蛋白酶L 之間存在13 個作用位點，且分子間作用力主要為氫鍵，極少部分為靜電力。上述研究結(jié)果為豬血漿蛋白高效綜合利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。