盧科宇，閆冰潔，田 貞，何鳳琴，范思媛，李曉茹，常亦昆

(1.西安市秦嶺天然產(chǎn)物開發(fā)與抗癌類創(chuàng)新藥物研究重點實驗室;西安文理學(xué)院基因工程實驗室;西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，西安710065；2.鄭州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，鄭州 450052)

雌二醇(Estradiol，E2)是一種類固醇激素，通過卵巢顆粒細(xì)胞中的芳香化酶系統(tǒng)從睪酮中產(chǎn)生[1]，它有助于青春期和月經(jīng)周期的第二性征的發(fā)育[2]．在人類雌二醇水平的增高和降低對于卵巢等其他疾病有重要的臨床意義；在獸醫(yī)臨床則用于同期發(fā)情，而在動物喂養(yǎng)中加入雌二醇，可以促進生長及提高畜禽瘦肉量[3]．但雌二醇在動物組織內(nèi)的殘留問題所帶來的危害不容忽視．雌二醇?xì)埩魰ㄟ^食物鏈危害人類健康，可能會造成女性幼兒提前發(fā)育，男性兒童乳腺發(fā)育成女性化，男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常與病變[4]．因此肉與肉制品中雌二醇的檢測成為了人類食品安全的必要措施．

本研究為建立雌二醇在肉及肉制品中的快速檢測，通過將半抗原雌二醇合成為雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME)，再通過碳二亞胺(EDC)法與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合，合成完全抗原 ( E2-BSA)．將E2-BSA免疫雌性家兔，制備出抗雌激素的多克隆抗體．通過用酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)實驗對產(chǎn)生的多克隆抗體進行效價鑒定．該抗體的成功制備為以后開發(fā)動物源性食品藥物殘留檢測新技術(shù)提供了幫助．

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

雌二醇(E2，武漢遠(yuǎn)程科技發(fā)展有限公司)；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)；牛血清白蛋白(BSA，武漢博士德)，二抗IgG (羊抗兔，武漢博士德)、弗式完全/不完全佐劑(武漢博士德)，無水二甲基亞砜，KOH，溴乙酸，乙酸乙酯，HCl，DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，甲醇，丙酮，0.01 M PBS，3%蔗糖，纖維素透析袋(源葉生物，SP131060).

1.1.1 制備0.01 M PBS

試劑配方：稱取8.0 g NaCl，0.2 g KCL，3.6 g Na2HPO4.12H2O． 0.24 g KH2PO4，加超純水900 mL，調(diào)pH至7.4后加超純水至1000 mL．

1.1.2 制備10 mg/mL BSA溶液

稱取10 mg的BSA溶于1 mL的0.01M PBS．

1.1.3 制備3%蔗糖溶液

稱取3 g蔗糖溶于100 mL的超純水．

1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫水浴鍋(Sheldon Manufacturing)，倒置顯微鏡(OLYMPUS)，高壓蒸汽滅菌鍋(ZEALWAY)，離心機(湘儀)，振蕩器(SI Vortex-Genie)，1 mL、20 mL注射器(博士德生物公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek，Winooski).

1.3 實驗動物

清潔級雌性家兔3只(體重2～2.5 kg)，購自西安交大醫(yī)學(xué)院．

1.4 實驗方法

1.4.1 雌二醇半抗原(雌二醇-3-羧甲基醚，E2-3-CME)的制備

將300 mg(1.0 mmol)雌二醇攪拌溶于6 mL無水二甲基亞砜，再加入1 g(18 mmol)KOH粉末，攪拌5 min，上述固體完全溶解后，加入300 mg溴乙酸，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2 h，加入50 mL冰水終止反應(yīng)．加入乙酸乙酯進行萃取，除去未反應(yīng)的E2，其中下層水相用2 mol/l HCl酸化，出現(xiàn)白色沉淀物，即為雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME)粗品．過濾，用雙蒸水洗滌，真空干燥2天，最終經(jīng)甲醇-丙酮重結(jié)晶，得到無色晶體即為E2-3-CME純品．

1.4.2 雌二醇完全抗原的制備

經(jīng)過上述實驗獲得8 mg E2-3-CME，加入4.24 mg NHS，7.08 mg EDC，混合并溶于8 mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，避光震蕩活化反應(yīng)8 h，逐滴加入10 mg/mL BSA溶液，出現(xiàn)絮狀沉淀立即停止，4℃震蕩反應(yīng)過夜，用0.01M PBS透析三天．此時，透析袋中即為雌二醇完全抗原(E2-BSA)．雌二醇完全抗原冷凍干燥后，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.4.3 免疫動物及免疫血清的采集

將2～2.5 kg 的清潔級雌性家兔，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，在免疫前對家兔進行耳緣靜脈采血2 mL，并將血液經(jīng)20 000 r/min離心5 min，收集血清作為陰性對照．第二周(第一次)將0.4 mL E2-BSA，與等量的弗氏完全佐劑混合，將混合物在振蕩器上充分振蕩，使其完全乳化．在家兔背部選取 4～5個點，在皮下進行多點注射免疫動物，第三周(第二次)和第四周(第三次)同上，但用弗氏不完全佐劑替代弗氏完全佐劑，如表1所示．在每次免疫之前先采集血清作為第一次、第二次和第三次免疫后的陽性血清，其中第一次、第二次的陽性血清通過耳緣靜脈采血離心后獲得，第三次陽性血清通過心臟采血獲得，共計采血四次，一次陰性對照，三次陽性實驗．收集后的血清，-80℃保存，備用．

表1 不同周次抗原和免疫佐劑的免疫劑量

1.4.4 通過Elisa檢測抗體血清的效價

1.4.4.1 包被抗原

抗原E2-BSA用0.01M PBS稀釋，最終濃度為1 μg/mL．稀釋完成后，在酶標(biāo)板上按每加樣孔100/μL加樣包被．加樣完成后，用封閉膜封閉加樣孔，防止蒸發(fā)并放置4℃冰箱過夜．

1.4.4.2 封閉

取出過夜處理的酶標(biāo)板，用超純水將加樣孔洗三遍，在干燥的吸水紙上拍打，拍出多余的水分．隨后向加樣孔加入1% BSA溶液，200 μL/孔，同樣用封閉膜封閉加樣孔并放置4℃冰箱過夜．

1.4.4.3 加一抗

過夜處理完成后，將酶標(biāo)板加樣孔水分甩干，將具有抗體的血清用0.01M PBS按照1：1 000的比例進行稀釋．將稀釋后的血清和0.01 M PBS 100 μL分別加入到酶標(biāo)板的加樣孔中，加入血清的為實驗組，加入PBS的為對照組，加樣完成后，用封閉膜封閉，放置37℃恒溫水浴鍋，孵育1 h．

1.4.4.4 加二抗

孵育完成后，用超純水洗三遍，在干燥的吸水紙上拍打，拍出多余的水分．隨后向加樣孔中加二抗IgG，每孔50 μL，用封閉膜封閉，放置37℃恒溫水浴鍋，孵育1 h．

1.4.4.5 顯色

孵育后的酶標(biāo)板，用超純水洗3次，在吸水紙上拍打，拍出多余水分．加入顯色液，100 μL/孔，用封閉膜封閉，放置37℃恒溫水浴鍋，孵育15 min．孵育結(jié)束后用50 μL/孔的1 M H2SO4終止顯色反應(yīng)．

1.4.4.6 讀取數(shù)據(jù)

將酶標(biāo)板放在酶標(biāo)儀中，在450 nm處測定OD值，讀取并記錄各加樣孔OD值．

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示．應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差(ANOVA)分析，以Post Hoc法進行組間兩兩比較，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果

三只兔子經(jīng)過三次雌二醇完全抗原的免疫，三只兔子在第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值與免疫前的血清進行比較均沒有明顯的差異(P> 0.05)，且在第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值之間也無明顯差異(P> 0.05)，但在第三次免疫后血清抗體的OD值比沒有進行免疫和第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值均有極明顯升高(P< 0.01)(表2).

表2 不同周次免疫前后OD值的比較

表2顯示將三只兔子分別在第一次，第二次和第三次免疫后血清抗體的OD平均值分別作為實驗的三個組，三只兔子免疫前的血清OD平均值，作為對照組進行比較，同樣，三只兔子在第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值與對照組的血清抗體進行比較均沒有明顯的差異(P> 0.05)，且在第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值之間也無明顯差異(P> 0.05)，但在第三次免疫后血清抗體的OD值比對照組和第一次、第二次免疫后血清抗體的OD值均極明顯升高(P< 0.01)(圖1)．

圖1 三次免疫后血清抗體的OD值注：**： P< 0.01，具有極明顯差異．

3 討論

本次實驗選用雌二醇作為免疫原，雌二醇的分子量為 (272.38)，屬于小分子物質(zhì)，具有抗原性但不具有免疫原性，必須與大分子蛋白偶聯(lián)，通過大分子蛋白上的 T 細(xì)胞表位間接誘導(dǎo) B 細(xì)胞產(chǎn)生針對雌二醇的特異性抗體，常用的載體蛋白有BSA、雞卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HAS)等[1]，本次實驗使用的是BSA．本實驗不足之處是沒有在制備完完全抗原后對其進行檢測和鑒定．

為了增強免疫原性，在動物進行免疫之前注入免疫佐劑，簡稱佐劑[5]．弗氏佐劑是將抗原水溶液與油劑(石蠟油或植物油)等量混合，再加乳化劑(羊毛脂或葉吐溫 80)制成油包水抗原乳劑，稱之為不完全弗氏佐劑．如在不完全佐劑中加入分枝桿菌(如死卡介苗)則稱為完全弗氏佐劑[5]．一般免疫動物第一次注射用抗原+完全弗氏佐劑(比例為1∶1)，第二次，第三次等用抗原+不完全弗氏佐劑(比例為1∶1)，從免疫后的動物獲得血清后要鑒定抗體的效價[2]．不管是用于診斷還是用于治療，制備抗體的目的都是要求較高效價．不同的抗原制備的抗體，要求的效價不一．鑒定效價的方法很多，包括有試管凝集反應(yīng)、瓊脂擴散試驗、Elisa等[6]．Elisa法操作簡便、廉價、快速、通量高，又能進行定量測定，在抗生素、雌激素、農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[7]．在本實驗中，注射三次E2-BSA產(chǎn)生的抗體光密度值(OD)最高，且與對照組，注射第一次和第二次產(chǎn)生的抗體的OD值均具有明顯差異．可能是抗體的產(chǎn)生具有潛伏期、對數(shù)期、平臺期和下降期[8]，注射三周E2-BSA產(chǎn)生的抗體可能處在抗體產(chǎn)生的對數(shù)期，而注射一周和兩周產(chǎn)生的抗體可能處在對數(shù)期以外的其他時期，故而檢測的抗體OD有所不同．通過抗原免疫三次的家兔產(chǎn)生的抗體效價最高，可為后期通過此方法制備抗體和Elisa試劑盒奠定基礎(chǔ)．

為了保障人類的食品安全和身體健康，快速高效的檢測技術(shù)是關(guān)鍵．同時，檢測技術(shù)的完善能夠促進畜牧業(yè)的快速發(fā)展，推動國內(nèi)的養(yǎng)殖業(yè)迅速與國際接軌[9-10]．