林 琳 莫秋蘭 何貴新 黎軍宏 莫霄云 陳天宇 劉布谷

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科二區(qū)，南寧市 530001，電子郵箱：10363973@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧市 530001)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種嚴(yán)重心臟疾病終末階段出現(xiàn)的一種臨床綜合征。心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、免疫應(yīng)激反應(yīng)，并有多種細(xì)胞因子參與，與高血壓、病毒性心肌炎、心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病有密切聯(lián)系[1]。研究表明，MF可導(dǎo)致心肌僵硬、心肌舒張或者收縮功能下降，最終引起心力衰竭[2-3]。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1可以促進(jìn)膠原合成、抑制膠原降解，在MF中TGF-β1被認(rèn)為是最強(qiáng)的促纖維化生長因子[4]。TGF-β1/Smad信號(hào)通路存在于所有真核生物中，是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞增殖、分化等核反應(yīng)的共同途徑或匯聚點(diǎn)，其可能與MF的發(fā)生和發(fā)展有一定的聯(lián)系。黎軍宏等[5]研究發(fā)現(xiàn)，扶陽強(qiáng)心方可以減小心力衰竭兔模型的左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)，增加左室縮短率、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)，從而減輕心力衰竭模型兔的MF?；诖?，我們假設(shè)扶陽強(qiáng)心方可通過干預(yù)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制MF的作用。因此，本研究通過建立大鼠CHF模型，并給予扶陽強(qiáng)心方干預(yù)，觀察其對(duì)大鼠MF及TGF-β1/Smad信號(hào)通路表達(dá)的影響，為扶陽強(qiáng)心方治療CHF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只清潔級(jí)成年健康雄性SD大鼠購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014]，體重(220±10)g。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，恒溫恒濕、采光明暗交替12 h、無菌飼料專人喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 扶陽強(qiáng)心方由制附片30 g、干姜15 g、肉桂15 g、瓜蔞殼15 g、薤白15 g、白術(shù)15 g、茯苓15 g、陳皮15 g、炙甘草6 g組成。扶陽強(qiáng)心方的制備方法：先將制附片煎2 h，之后加入其余藥物共同煎煮，先用武火煮開，再用文火煮0.5 h，倒出藥汁；再加入開水，用武火煮開，再用文火煮 0.5 h，再次倒出藥汁。合并兩次藥汁即為扶陽強(qiáng)心方藥液，放于冰箱保存。 各種中藥材均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購買，經(jīng)專家鑒定，符合《中華人民共和國藥典2020年版一部》的規(guī)定。

1.3 主要儀器與試劑

1.3.1 主要儀器：電泳儀電源(Bio-Rad公司，型號(hào)：PowerPacTM)、垂直電泳槽(Bio-Rad公司，型號(hào)：Mini-PROTEAN Tetra)、電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司，型號(hào)：Trans-Blot? TurboTM)、酶標(biāo)儀(Thermo公司，型號(hào)：Multiskan GO)、超靈敏多功能成像儀(GE公司，型號(hào)：AI600)、漩渦混合器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：VORTEX-5)。

1.3.2 主要試劑：磷酸酶抑制劑(Roche公司，批號(hào)：04906845001)、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF；Solarbio公司，批號(hào)：P0100-10ML)、二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Solarbio公司，批號(hào)：P0100-10ML)、蛋白Marker(10～250 kDa，Thermo公司，批號(hào)：26619)、TGF-β1抗體(Proteintech公司，批號(hào)：21898-1-AP)、Smad7抗體(Proteintech公司，批號(hào)：25840-1-AP)、Smad3抗體(Proteintech公司，批號(hào)：25494-1-AP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)：TA-08)、山羊抗小鼠 IgG(廠家：Proteintech，批號(hào)：SA00001-1)。

1.4 分組與模型建立 將大鼠分為模型組(M組)、西藥組(X組)、扶陽強(qiáng)心方灌胃組(Z組)、假手術(shù)對(duì)照組(K組)，每組10只。除K組外，其他3組采用腹主動(dòng)脈縮窄法[6]制作CHF大鼠模型，用2%戊巴比妥鈉按0.01 mL/g對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，成功麻醉后，于劍突下腹正中做一切口，分層打開腹腔，在腎動(dòng)脈分支以上鈍性游離腹主動(dòng)脈，將7號(hào)注射器針頭平行置于腹主動(dòng)脈上，用4號(hào)手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和注射器針頭一同結(jié)扎，然后緩慢將注射器針頭撤出，關(guān)腹，分層縫合，使大鼠腹主動(dòng)脈直徑縮窄為0.7 mm。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)6周，如大鼠出現(xiàn)呼吸頻率增快、呼吸幅度增加、活動(dòng)明顯減少、飲食減少、毛發(fā)干枯無光澤、爪背紫紺、尿少、水腫等表現(xiàn)，且血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果異常(使用經(jīng)胸高頻超聲心動(dòng)圖測(cè)量，左室舒張末壓>15 mmHg)表示造模成功。K組按上述方法開腹后將手術(shù)絲線穿過腹主動(dòng)脈但不進(jìn)行縮窄腹主動(dòng)脈操作，其他操作與其他組相同。實(shí)驗(yàn)過程中，M組有2只老鼠死亡，X組有1只老鼠死亡，Z組有1只老鼠死亡。

1.5 干預(yù)方法 造模成功后，給予M組、K組大鼠生理鹽水10 mL/kg灌胃， 2次/d，連續(xù)灌胃8周；給予Z組大鼠扶陽強(qiáng)心方中藥10 mL/kg灌胃，2次/d，連續(xù)灌胃8周；給予X組大鼠卡托普利混懸液7.8 mL/kg灌胃(卡托普利用生理鹽水稀釋后按10 mL/kg給藥)，2次/d，連續(xù)灌胃8周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 心肌收縮功能：造模成功后和灌胃8周后分別對(duì)大鼠行心臟彩超檢查。采用2%～4%乙醚5～10 mL吸入的方式麻醉各組大鼠后，充分暴露大鼠胸部，采用美國飛利浦公司 IE33 彩色多普勒超聲診斷儀，以探頭頻率1～5 MHz，行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查。將探頭置于胸骨左緣，于左室長軸最大直徑處使用M型超聲標(biāo)記室間隔與左室后壁收縮末和舒張末心內(nèi)膜位置，隨機(jī)攜帶的軟件自動(dòng)計(jì)算LVEF、LVESD、LVEDD，以上數(shù)據(jù)均測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.6.2 血漿腦鈉肽和肌酸激酶水平檢測(cè)：灌胃8周后，大鼠禁食不禁水12 h，眼內(nèi)眥取血約0.5 mL，自然凝集，低溫高速離心20 min,轉(zhuǎn)速為3 000 r/min,取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血漿腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)和心肌酶水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的試劑盒均購自深圳藍(lán)韻生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：20181146、20190102)。具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.3 病理組織學(xué)檢查：灌胃8周并進(jìn)行眼內(nèi)眥取血后，處死大鼠，迅速取出心臟，切取左心室前壁心肌組織50 mg，置于10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片4 μm，行常規(guī)HE染色后觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的改變。將心肌病理損傷分為4級(jí)[7]。其中，0級(jí)為心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維排列整齊，橫紋清楚，無炎癥細(xì)胞浸潤，無細(xì)胞水腫、壞死或纖維化，間質(zhì)毛細(xì)血管無擴(kuò)張或輕度擴(kuò)張;1級(jí)為心肌細(xì)胞排列稀疏，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤、心肌細(xì)胞水腫，間質(zhì)血管擴(kuò)張，心肌組織可見局灶性纖維化，限于心內(nèi)膜下;2級(jí)為較多炎癥細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞水腫，心肌細(xì)胞纖維化呈片狀分布，累及心壁全層，間質(zhì)可見明顯血管擴(kuò)張;3級(jí)為有明顯的間質(zhì)血管擴(kuò)張、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，心肌廣泛性大面積纖維化，灶間相互連接累及心壁全層。

1.6.4 TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)：按1.6.3的方法取出心臟后，切取左室前壁心肌組織100 mg，加組織裂解液，提取總蛋白，采用二喹啉甲酸法測(cè)定樣品蛋白濃度。蛋白上樣后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行電轉(zhuǎn)印，將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉硝酸纖維素膜1 h，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，4℃孵育一抗(1 ∶2 000)過夜，室溫孵育二抗(1 ∶5 000)1 h。選用ECL(博凌科為公司，批號(hào)：PE0010)熒光檢測(cè)試劑于暗室進(jìn)行顯色，壓片、洗片，使用Image J軟件分析灰度值，各目的條帶灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值之間的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較 灌胃后，其他3組的LVESD、LVEDD均小于M組，而LVEF高于M組(均P<0.05)；與K組相比，Z組的LVESD、X組和Z組的LVEDD減小，X組和Z組的LVEF降低(均P<0.05)；Z組的LVEF高于X組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較(x±s)

2.2 4組大鼠血漿BNP和心肌酶水平的比較 與M組相比，其他3組的血漿BNP及心肌酶水平均降低(均P<0.05);與K組相比，X組、Z組的血漿BNP及心肌酶水平均升高(均P<0.05);但X組、Z組的上述指標(biāo)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血漿BNP和肌酸激酶水平的比較(x±s)

2.3 4組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果 M組大鼠心臟組織部分區(qū)域心肌細(xì)胞排序紊亂，心肌細(xì)胞腫脹、橫紋消失、溶解，胞漿空泡樣變；X組大鼠心臟組織局部心肌細(xì)胞腫脹，心肌纖維呈波浪狀；Z組大鼠心臟組織局部心肌纖維呈波浪狀，個(gè)別心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹；K組大鼠心臟組織心肌纖維結(jié)構(gòu)清楚，排序整齊，橫紋正常，心肌細(xì)胞胞質(zhì)、間質(zhì)均正常。見圖1。

圖1 4組大鼠心肌組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色，100×)

2.4 4組大鼠TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較 與M組相比，其他3組的TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(均P<0.05)；與K組相比，X組、Z組的Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，且X組的TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低(均P<0.05)；4組Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見表3和圖2。

表3 4組大鼠TGF-β1、Smad3、 Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖2 4組大鼠TGF-β1、Smad3、 Smad7蛋白表達(dá)情況

3 討 論

心力衰竭屬中醫(yī)“喘證”“水腫”“心水”等范疇。近代諸多醫(yī)家認(rèn)為CHF為本虛標(biāo)實(shí)之證，其病機(jī)可用“虛”“瘀”“水”概括，以氣虛為主，常兼陽虛、陰虛，標(biāo)實(shí)以血瘀為主，常兼水飲、痰濁[8]。本虛是CHF的基本要素，標(biāo)實(shí)是CHF的變動(dòng)因素，本虛和標(biāo)實(shí)的消長決定了CHF的發(fā)展演變[9]。對(duì)CHF的認(rèn)識(shí)，眾多醫(yī)家各成一派：施今墨教授認(rèn)為CHF多以心氣心陽不足為主[10]；趙錫武教授認(rèn)為本病證屬心腎陽衰，水氣上逆，凌心犯肺[11]；查玉明教授[12]認(rèn)為CHF的發(fā)展系正虛邪實(shí)、心肺兩損，其標(biāo)在心，其本在腎。

《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰：“陽化氣，陰成形?！泵鞔_指出陽氣具有氣化無形，陰氣具有滋生有形的特點(diǎn)。陽氣不足則溫化無力，痰濁、瘀血、水飲等有形之物內(nèi)生。人體的生命活動(dòng)是由陰陽二氣交感氣化完成的，人體正常的狀態(tài)是“內(nèi)陽外陰”的本體結(jié)構(gòu)，疾病的發(fā)生和發(fā)展是由于人體的“內(nèi)陽外陰”的狀態(tài)被打破，走向了“外陰內(nèi)陽”偏離狀態(tài)，超過常態(tài)，即升降中的陰陽超出了常態(tài)[13]?！夺t(yī)法圓通·卷三》記載“病在陽者，扶陽抑陰；病在陰者，用陽化陰?！闭骊幷骊栐谕鶃斫桓羞^程中，如果真陽在本位上，自然有相應(yīng)的真陰與其對(duì)應(yīng)，而形成陰陽對(duì)立統(tǒng)一的一元構(gòu)象，所謂“二氣混為一氣者也”“陽的多少就決定了陰的多少”。而真陰不足的實(shí)質(zhì)必在于真陽不足。因此，只要設(shè)法將本位上的真陽溫扶正常，真陰必相應(yīng)而足，亦“扶陽則精血津液自生而臟腑及周身各部均能滋養(yǎng)”。其用陽化陰者，實(shí)為通過溫補(bǔ)陽氣，運(yùn)化脾土，則不僅后天屬陽的水谷清氣得以化生，而且后天屬陰的精血津液一概得以化生。發(fā)病根源在于常態(tài)的陰陽偏離本位，但最終應(yīng)在先天真陽上下工夫，即腎陽。黃元御先生[14]認(rèn)為：“坎中之陽，火之根也，坎陽升則上交離位而化火，火升于水，是以癸水化氣于丁火。”可見腎陽為心陽之由來，腎陽足，心陽才足，腎陽充足乃常人之體。當(dāng)心腎陽虛不足以溫化痰濁、瘀血、水飲等有形之物時(shí)，則可發(fā)為 “心水”“喘證”“水腫”等病癥，由此可見心腎陽虛乃CHF的基本病機(jī)。

扶陽強(qiáng)心方藥物組成主要有制附片、干姜、肉桂、瓜蔞殼、薤白、茯苓、白術(shù)、陳皮、炙甘草等，其基本功效為扶陽消陰。扶陽強(qiáng)心方中的制附片能大溫腎水，使火盛而水沸，精化成氣，氣升于中，五臟得其營養(yǎng)；并能起少陰之微陽，與太陽交合。附子的辛熱能夠直補(bǔ)坎中的真陽，即先天乾元之氣，乃治療陽衰陰盛、水濕腫滿、寒凝疼痛等病癥之要藥，尤其是其能救治亡陽重癥，拯救生命于垂危，為中醫(yī)治病救命之第一品藥，明代張景岳稱之為藥中之“良將”。藥理學(xué)研究表明，制附片的主要強(qiáng)心成分是消旋去甲烏藥堿，其具有擴(kuò)張血管、抗炎及抗血栓形成的作用[15]；同時(shí)，附片可提高脾臟系數(shù)、外周血紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板數(shù)[16]。干姜能溫中散寒，回陽通脈，故以干姜滌蕩陰邪，迎陽歸舍，合以附子同投，達(dá)到陰陽和合的象，則能回陽立效。肉桂能補(bǔ)火助陽，引火歸元，散寒止痛，活血通經(jīng)。古人認(rèn)為,肉桂色紅，味辛、甘，性大熱，五行主火。心之色為赤，膈膜之上,肺之下,圓而下尖,形如蓮蕊,外有心包衛(wèi)護(hù)；姜色黃，五行主土，土載四行；附子相火下蟄，肉桂君火上升；火之下蟄，實(shí)賴土氣，胃氣右降，金水收藏，則二火沉潛，而不飛揚(yáng)，陰陽平和。制附片、干姜、肉桂合用使得君火壯,相火足,中土旺,達(dá)到祛百病的作用。瓜萎殼、薤白能開胸膈,白術(shù)、陳皮、茯苓、炙甘草可健脾利水滲濕。甘草 能益氣補(bǔ)中,調(diào)和諸藥,在此方中還可以減輕附片的毒性作用。上述諸藥合用,共奏扶陽消陰之功。

LVESD、LVEDD及LVEF常用于評(píng)價(jià)心肌局部及整體的收縮功能，而血漿BNP及心肌酶水平能夠較好地評(píng)估患者心肌損害程度及心力衰竭嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，灌胃后，X組、Z組的LVESD、LVEDD小于M組，LVEF高于M組，血漿BNP及心肌酶水平低于M組(P<0.05)，而X組、Z組兩組的LVESD、LVEDD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但Z組的LVEF高于X組(P<0.05)。這提示扶陽強(qiáng)心方可以改善CHF大鼠的心肌細(xì)胞損害及心功能，抑制心室重構(gòu)，且療效與西藥卡托普利相當(dāng)。

研究表明，TGF-β1可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化、膠原合成，抑制膠原降解，促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分泌及病理性細(xì)胞外基質(zhì)積聚；其還可激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和上調(diào)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的表達(dá)，并可介導(dǎo)炎癥因子白細(xì)胞介素6的產(chǎn)生從而共同促進(jìn)MF進(jìn)展[17-19]。在TGF-β1/Smad信號(hào)通路中，Smad蛋白是信號(hào)通路中下游主要效應(yīng)分子，TGF-β1受體通過使Smad蛋白磷酸化從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，如TGF-β1可抑制膠原酶、彈性蛋白酶等的分泌，誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑包括纖溶酶原激活劑抑制物1、蛋白酶組織抑制劑的表達(dá)等，從而共同促進(jìn)纖維化發(fā)展[20]。Smad7屬于抑制型Smad，其可阻礙R-Smad與Co-Smad異聚體的形成，負(fù)調(diào)控TGF-β1信號(hào)通路，抑制纖維化的發(fā)生；而Smad3作為TGF-β1激酶的底物，是TGF-β1下游受體的作用靶點(diǎn)，刺激TGF-β1可誘導(dǎo)Smad3活化，進(jìn)而調(diào)控促纖維化基因的表達(dá)[21]。TGF-β1/Smad信號(hào)通路是參與MF的關(guān)鍵通路，可通過調(diào)節(jié)Smad蛋白家族成員相互作用介導(dǎo)MF發(fā)生。過度的體力活動(dòng)是心衰的誘因之一，有研究表明長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起TGF-β1的持續(xù)高表達(dá),信號(hào)通路蛋白Smad-4、Smad-7可以介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-1/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2的比例失調(diào)及結(jié)締組織生長因子的表達(dá)增加，使膠原蛋白合成增加而降解異常，導(dǎo)致膠原蛋白的過度堆積而誘發(fā)心肌纖維化，從而引起心臟功能發(fā)生異常[2]。本研究結(jié)果顯示，X組、Z組的TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于M組，Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于M組(P<0.05),且X組、Z組大鼠心臟組織心肌細(xì)胞腫脹程度較M組減輕。提示扶陽強(qiáng)心方可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路，抑制CHF大鼠MF的進(jìn)展，其效果與西藥卡托普利相當(dāng)。但各組Smad3蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，原因可能是Smad3蛋白在MF過程中的調(diào)控作用較小。

綜上所述，扶陽強(qiáng)心方可抑制CHF大鼠的MF并改善心臟收縮功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路的表達(dá)有關(guān)。