姜文霞 趙 燕 杜逸峰

1 上海健康醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，上海市 201318； 2 同濟大學醫(yī)學與生命科學實驗教學中心 200092

目前，基于醫(yī)學形態(tài)學實驗之炎癥實驗內(nèi)容豐富，大多數(shù)醫(yī)學高校和學院使用傳統(tǒng)的演示性和驗證性實驗手段。本實驗進行綜合性、設(shè)計性和探究性實驗改革，激發(fā)學生興趣，探索分層次的實驗教學舉措，嵌入操作性實驗技能，結(jié)合線上線下的實驗教學平臺，來促進學生自主性實驗、動腦動手，更好地培養(yǎng)學生不僅有效地掌握理論知識，更鍛煉實驗操作能力。

1 炎癥實驗教學改革的理念和設(shè)計思想

炎癥實驗項目涉及的理論知識點包括：炎癥的基本病變有三種：變質(zhì)、滲出和增生。變質(zhì)指炎癥局部的組織細胞發(fā)生的變性和壞死，有細胞水腫、脂肪變性、細胞凝固性壞死和液化性壞死等細胞變質(zhì)性改變；還有黏液樣變性和纖維素樣壞死等間質(zhì)變質(zhì)性改變；主要認識炎癥的各類細胞，有急性中性粒細胞、慢性淋巴細胞、過敏反應(yīng)嗜酸性粒細胞等。滲出指血管內(nèi)的液體成分、蛋白質(zhì)及各種炎細胞從血管進入組織間、體腔、體表和黏膜表面的過程，滲出是炎癥最具特征性的改變，包含：血管口徑改變和血流量增加(炎性充血)；血管通透性增高(炎性滲出)；白細胞游出和聚集(炎性浸潤)。增生指在致炎因子、組織壞死的崩解產(chǎn)物或某些理化因子的刺激下，炎癥局部的巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等均可增生，屬于細胞和間質(zhì)細胞的增生，具有限制炎癥擴散和修復的作用。

炎癥局部聚集的白細胞能有效殺傷病原微生物，白細胞的滲出構(gòu)成炎癥防御反應(yīng)中及其重要的一環(huán)。因此，認知各種白細胞/炎癥細胞是掌握炎癥最重要的特征。

以往驗證性實驗主要認知炎癥基本變化中變質(zhì)的變性壞死與急性炎癥細胞；滲出的各種急性炎癥細胞和漿液性纖維素性滲出液；增生性炎癥的肉芽腫性病變和慢性炎癥細胞等，學生僅停留在驗證性認知和觀察水平，通過顯微鏡或電腦圖片觀察各種細胞形態(tài)特征，只能依靠單純記憶，不能舉一反三，容易遺忘。精品實驗設(shè)計思想從綜合性和設(shè)計性入手，實驗內(nèi)容從探索數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)的醫(yī)學分析模塊中的體視學形態(tài)定量分析測量炎癥區(qū)及區(qū)別各種炎癥細胞；再通過基礎(chǔ)科研免疫組化實驗，進一步明白炎癥相關(guān)因子IL-1β和TNF-α的炎癥損傷作用[1]。使以往的驗證性實驗從只停留在動眼的層次上，轉(zhuǎn)向動手、動眼、動腦的設(shè)計性和綜合性實驗，提高實驗教學質(zhì)量。

2 炎癥實驗教學改革的實施

2.1 實驗教學前的預習、引導及準備工作 應(yīng)用中英文PPT課件，改進炎癥的實驗大綱、實習指導及實驗計劃書等作為實驗教學前的預習、引導及準備工作；實驗班分組輪轉(zhuǎn)炎癥實驗的三個模塊：(1)數(shù)字化與實體化的標本與切片形態(tài)結(jié)構(gòu)認知；(2)體視學形態(tài)定量分析炎癥細胞；(3)操作免疫組化實驗，檢測炎癥組織中的炎癥細胞因子。同時，注重實驗教學過程中氛圍的營造[2]，學生積極性的調(diào)動，實踐能力的鍛煉，創(chuàng)新意識的培養(yǎng)，探究性思維的啟發(fā)。

2.2 數(shù)字化與實體化的標本與切片形態(tài)結(jié)構(gòu)認知實驗 根據(jù)理論知識點，基于傳統(tǒng)的顯微鏡下組織切片認知以及大體標本實體認知，從炎癥的基本病理變化，到炎癥局部的組織細胞發(fā)生的變性和壞死。一系列的病變中，主要認識炎癥的各類細胞。同時，緊扣大綱知識點，識別炎性滲出的液體成分、蛋白質(zhì)以及各種炎癥細胞從血管進入組織間、體腔、體表和黏膜表面的過程。同時輔以線上“形態(tài)學數(shù)字化教學平臺”中的大體數(shù)字標本來拓展學生舉一反三的實驗教與學體驗，包括360°全景影像數(shù)據(jù)，讓數(shù)字標本進行旋轉(zhuǎn)、放大，并可以進行測量和標注的病理學數(shù)字化大體標本，采用動態(tài)預聚焦(DPF)方式掃描，其精度可達0.23μm/pixel(40×)高分辨率模式，學生可隨時隨地對大體和顯微切片任何區(qū)域進行觀察，在鼠標操縱下選擇切片任意位置完成無極變倍連續(xù)縮放瀏覽，并提供切片全景導航，使高倍鏡下的圖像與低倍鏡下的位置形成良好對應(yīng)，資料傳輸不受時間和空間的約束。如闌尾炎數(shù)字大體標本圖所示(圖1、2)。

在實驗教學過程中構(gòu)建形成性評價與反饋體系，使用“形態(tài)學實驗操作評價互動系統(tǒng)”，使老師動態(tài)檢測實驗教與學效果，學生隨時隨地了解自身的實驗學習效果，給予實驗教學過程的形成性和即時性評價。

圖1 闌尾炎大體數(shù)字標本放大

圖2 闌尾炎大體數(shù)字標本進行旋轉(zhuǎn)

同時，建立炎癥相關(guān)的數(shù)字化考試切片數(shù)據(jù)庫[3]。實驗考試時，隨機抽取數(shù)碼切片，學生寫出組織切片診斷內(nèi)容，例如闌尾炎[4]數(shù)碼切片從低倍全景到高倍細節(jié)(圖3、4)。

圖3 數(shù)碼切片—闌尾炎低倍

2.3 應(yīng)用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)的醫(yī)學分析模塊——體視學形態(tài)定量分析測量炎癥區(qū) 選擇闌尾炎肌層的中性粒細胞分布區(qū)作為觀察檢測視場，隨機選擇組織切片中的10個高倍鏡視野(200×)來進行分析測量。根據(jù)目標總個數(shù)、目標總面積、統(tǒng)計場面積、面密度、數(shù)密度、周密度等指標，可對多幅圖像的分析結(jié)果自動合并統(tǒng)計二維和三維體視學多項結(jié)構(gòu)參數(shù)和光密度參數(shù)測量炎癥區(qū)。學生從以上分析測量中，不僅從數(shù)碼切片細胞形態(tài)上認知和識別炎癥細胞，還可通過體視學形態(tài)定量分析提供測量和統(tǒng)計出的一系列參數(shù)，來甄別中性粒細胞的真?zhèn)?，只有選中的細胞才能計算各種數(shù)值，從數(shù)值的比較上來即時性確定不典型炎癥細胞，加強學生掌握炎癥細胞的形態(tài)學結(jié)構(gòu)與特征，使學生在二年級開始接觸初級科學研究方法的醫(yī)學圖像測量分析方法，開啟數(shù)據(jù)研究思維，通過鏡下選定目標炎癥區(qū)，根據(jù)步驟，完成分析報告并打印。

2.4 免疫組化檢測炎癥因子實驗 炎癥最明顯的一個主要癥狀是發(fā)熱，發(fā)熱是外源性和內(nèi)源性致熱原共同作用的結(jié)果。細菌產(chǎn)物等外源性致熱原，可以刺激白細胞釋放內(nèi)源性致熱原，例如白細胞介素1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF)。IL-1主要由炎癥的中性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，是一種調(diào)節(jié)自然免疫的細胞因子，可通過活化其他炎癥介質(zhì)，如前列腺素、白三烯和血小板活化因子等損傷組織。

TNF-α是炎癥時最早升高的細胞因子，并起到了核心作用，其主要由單核細胞產(chǎn)生，是重要的炎癥介質(zhì)。TNF-α不但激活自身，還能促進其他因子(如血小板活化因子、一氧化氮、氧自由基等)的產(chǎn)生，引起白細胞活化和細胞黏附分子上調(diào)以及大量其他遞質(zhì)爆發(fā)等一系列連鎖反應(yīng)和放大反應(yīng)，造成這種不可逆的促炎癥遞質(zhì)刺激物大量釋放以及效應(yīng)細胞的活化，即“瀑布樣效應(yīng)”，最終導致重癥患者發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)。

炎癥實驗教學不僅要從炎癥細胞的形態(tài)上認識，更要從本質(zhì)上、分子蛋白水平更深刻地認識。加入基礎(chǔ)形態(tài)學免疫組化實驗，開創(chuàng)學生動手實驗操作技能，更早地接觸基礎(chǔ)科研抗原抗體免疫復合物檢測基因蛋白的免疫組化實驗，完成實驗報告，有助于學生創(chuàng)新意識的培養(yǎng)和探究性思維的啟發(fā)。

分別使用Affinity公司對人、小鼠、大鼠反應(yīng)的多克隆兔抗體IL-1β和TNF-α，對闌尾炎肌層內(nèi)的急性炎癥細胞做定性實驗。實驗步驟從脫蠟及水化→震蕩清洗→阻斷酶活性→抗原熱修復→滴加封閉液→滴加抗體→滴加辣根酶標記鏈霉卵白素→DAB溶液顯色→蘇木素—伊紅復染→分化→脫水→透明→中性樹膠封片→鏡下觀察。其中，“震蕩清洗”需要用0.1MPBS緩沖液連續(xù)震蕩清洗3次，且在“阻斷酶活性”后、“抗原熱修復”后、“滴加抗體”后、“滴加辣根酶標記鏈霉卵白素”后、“DAB溶液顯色”后都必須進行“震蕩清洗”。另外，需要注意的是，蘇木素—伊紅復染浸泡的時間根據(jù)染色的結(jié)果進行調(diào)整，切片分化需在鏡下觀察，若分化過度，應(yīng)水洗后重新染色，若分化不足，應(yīng)依具體情況延長分化時間。實驗中的操作細節(jié)也提高了學生基礎(chǔ)科研實驗的操作技能基礎(chǔ)。

實驗結(jié)果免疫組織炎癥細胞因子陽性表達判定：光學顯微鏡視野下，IL-1的陽性表達結(jié)果為細胞漿以及炎癥基質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色異染性顆粒，TNF-α的陽性表達結(jié)果為細胞漿中出現(xiàn)棕黃色異染性顆粒(圖5、6)。

圖5 IL-1陽性表達細胞漿(400×，1∶100)

實驗結(jié)束后，學生完成實驗報告，包括實驗原理、實驗現(xiàn)象、實驗步驟、結(jié)果與分析、實驗總結(jié)以及提出實驗問題。

2.5 構(gòu)建炎癥“小微課群” 梳理炎癥縱向知識結(jié)構(gòu)從病因?qū)W、發(fā)病機制、病理改變與臨床聯(lián)系。從臨床疾病學有急性炎癥、慢性炎癥等；從知識點有變質(zhì)性炎、漿液性炎、纖維素性炎、化膿性炎、出血性炎、一般慢性炎、各種特異性肉芽腫性炎等；從機制有炎癥介質(zhì)、趨化作用、補體系統(tǒng)等，縱橫交錯，結(jié)合炎癥細胞的特征，以“小微課群”串聯(lián)知識點嵌入實驗教學中。

3 炎癥實驗教學改革的效果與評價

炎癥實驗的設(shè)計以綜合性和操作性為特色[5]，優(yōu)于以往單純的演示性和驗證性實驗手段，將學生僅依靠單純記憶、容易遺忘的靠眼看的實驗，轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鲂?、探索性、操作性實驗，同時結(jié)合線上線下的數(shù)碼切片的形態(tài)學綜合實驗。首先，學生在鞏固炎癥理論知識點的基礎(chǔ)上，對炎癥的基本病理變化，在實驗觀察中有了感性認識：急性炎癥以中性粒細胞為主；慢性炎癥以淋巴細胞、漿細胞為主；過敏性反應(yīng)以嗜酸性粒細胞為主；慢性肉芽腫性炎癥以巨噬細胞、上皮樣細胞及慢性炎癥細胞為主等。通過數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)的體視學形態(tài)定量分析測量炎癥區(qū)的不同細胞，更加直觀認識各種炎癥細胞。第二，通過動手操作免疫組化實驗，對炎癥的機制、炎癥介質(zhì)的作用等，不僅從基因蛋白水平認知炎癥的本質(zhì)，從理論上扎實了基礎(chǔ)知識，更能通過實驗原理、實驗過程、實驗步驟、實驗結(jié)果分析、實驗報告撰寫等一系列的實驗過程，鍛煉了低年級醫(yī)學生的實驗操作和科研能力，實驗中遇到的問題也激發(fā)了學生查文獻、提高解決問題的動腦動手能力。第三，通過構(gòu)建單個知識點的“小微課群”，學生隨時隨地應(yīng)用移動端自由學習，結(jié)合線下實體炎癥不同病變的大體疾病標本和顯微鏡下組織切片的實驗，輔以“形態(tài)學數(shù)字化教學平臺”的數(shù)字大體標本全景影像數(shù)據(jù)，進行旋轉(zhuǎn)、放大觀察，同時，在鼠標操縱下選擇切片任意位置完成無極變倍連續(xù)縮放瀏覽，提高了學習自主性，達到了高效、主動、積極的學習效果。第四，不斷積累改進中英文課件，改進炎癥的實驗大綱、實習指導及實驗計劃書，建立炎癥相關(guān)的數(shù)字化考試切片數(shù)據(jù)庫。實驗考試時，隨機抽取數(shù)碼切片，讓學生寫出組織切片診斷內(nèi)容，杜絕了實驗考試交頭接耳的弊端，提高實驗教學質(zhì)量。同時，運用“形態(tài)學實驗操作評價互動系統(tǒng)”反饋學生在實驗中的問題，批改學生實驗作業(yè)，使老師動態(tài)檢測實驗教與學的效果，使學生隨時隨地了解自身的實驗學習效果，給予實驗教學過程的形成性和即時性評價。實驗考試成績由形成性評價的實驗過程占70%(體視學形態(tài)定量分析報告占30%，免疫組化實驗報告占40%)，終結(jié)性評價的切片考試成績占30%。在充分調(diào)動學習積極性的同時，也讓學生達到大綱要求的知識點掌握程度。相比以往同類實驗中僅單純的大體標本和切片觀察，學生反映設(shè)計性、綜合性實驗的手段豐富、有趣味性，運用“小微課群”的方式更加靈活，節(jié)約了實驗中講授的時間，同時，實驗的考核注重實驗思維和能力，對所需要掌握的實驗要點更能達成目標。

4 結(jié)語

通過炎癥實驗教學改革推陳出新，醫(yī)學生在初期不僅熟知相關(guān)理論知識點和顯微鏡下變質(zhì)、滲出、增生的炎癥基本病理變化以及各種炎癥細胞的識別，更是探索與掌握這些炎癥細胞對損傷組織的意義和機制，夯實了這部分知識點的掌握，同時培養(yǎng)了動手能力，在實驗過程中，鍛煉了實驗技巧和過程設(shè)計以及實驗報告的撰寫能力。切實有效的提高實驗教學質(zhì)量和醫(yī)學生的理論結(jié)合實踐的能力，為培養(yǎng)復合型、高水平的未來卓越醫(yī)師打下堅實的基礎(chǔ)。