范曉良，張純，郭志麗，阮偉峰，方瑞華

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬嘉興中醫(yī)院藥學(xué)部，嘉興 314001；2.嘉興市感染性疾病及細(xì)菌耐藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嘉興 314001；3.嘉興市食品藥品與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院中藥室，嘉興 314001)

白芥子散源自清代張璐所著《張氏醫(yī)通》[1]，是臨床上廣泛用于防治哮喘的穴位貼敷基本方。經(jīng)臨床實(shí)踐，多數(shù)患者(包括兒童)經(jīng)貼敷治療后體質(zhì)有不同程度改善[2]?，F(xiàn)代研究表明，其可有效調(diào)解抑制Th2反應(yīng)，降低血清中單核細(xì)胞趨化蛋白1、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素13、免疫球蛋白和腫瘤壞死因子水平，使Thl/Th2趨于平衡而起到防治哮喘的功效[3-5]。

該方藥在臨床應(yīng)用過程中常引起皮膚變態(tài)反應(yīng)，除與貼敷時(shí)間、患者體質(zhì)等因素相關(guān)外[6-7]，與其自身藥物質(zhì)量也有重大關(guān)系，但目前對該方藥的研究多集中于臨床應(yīng)用、療效機(jī)制、制劑改進(jìn)[8]等方面，而對其質(zhì)量控制方面的研究卻鮮有報(bào)道。有人僅以薄層色譜法鑒別了其中部分藥物，或僅建立了某個(gè)單一成分的測定方法[9-10]。另外，在穴位貼敷干預(yù)哮病的中醫(yī)治未病實(shí)踐指南中[11]，雖明確推薦了該方藥的組成(白芥子、延胡索、細(xì)辛、甘遂)，比例及制備工藝，但未對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作出要求。故對其進(jìn)行全面質(zhì)量控制，建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對保障其臨床用藥安全具有重要意義。本研究除對白芥子散的水分、總灰分進(jìn)行測定外，建立了白芥子等4味藥物的顯微、薄層鑒別法及芥子堿硫氰酸鹽、細(xì)辛脂素兩個(gè)主要成分的同時(shí)測定方法，為建立白芥子散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Eclipse E200MV型生物顯微鏡(日本尼康公司)；Waters E2695-2998高效液相色譜系統(tǒng)，DAD檢測器(美國WATERS公司)；XS205DU型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，感量：0.01 mg)；Mili-Q Reference超純水系統(tǒng)(美國MILLIPORE公司)；USC-502 型超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司)；硅膠G薄層板(德國默克公司)等。

1.2試藥 芥子堿硫氰酸鹽(含量：98.6%，批號(hào)：AF8100802)、細(xì)辛脂素(含量：98.9%，批號(hào)：AF8031912)、大戟二烯醇(含量：98.5%，批號(hào)：18041403)均購自于成都埃法生物科技有限公司；延胡索乙素(含量99.8%，批號(hào)：110726-201516)、延胡索對照藥材(批號(hào)：120928-201609)、細(xì)辛對照藥材(批號(hào)：121204-201606)、甘遂對照藥材(批號(hào)：121042-201605)均購自于中國食品藥品檢定研究院。白芥子散(12批樣品均為自制，批號(hào)分別為180712，180713，180717，180720， 180723， 180724， 180726，180727，180802，180807，180810，180812)。白芥子、延胡索、細(xì)辛、甘遂藥材均由嘉興東方國藥飲片有限公司提供(批號(hào)分別為181102，190226，190323，181209)，經(jīng)嘉興市食品藥品與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院陳葉青副主任中藥師鑒定為《中華人民共和國藥典》規(guī)定品種。

2 方法與結(jié)果

2.1水分及總灰分 參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部0832項(xiàng)下第二法(烘干法)及灰分測定法下的第一項(xiàng)“總灰分測定法”分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[12]，各平行操作3次，取平均值。結(jié)果顯示12批白芥子散的水分含量為9.9%～14.8%，平均值為11.82%；總灰分為2.5%～3.7%，平均值為3.14%。

2.2顯微鑒別 取樣品細(xì)粉適量制片，置顯微鏡下觀察?？梢姲捉孀臃N皮柵狀細(xì)胞成片，表面觀呈類多角形，常與下皮細(xì)胞重疊；延胡索的糊化淀粉粒團(tuán)塊，多數(shù)呈類圓形；大量細(xì)辛草酸鈣砂晶存在，測得直徑約5 μm；甘遂細(xì)長木纖維明顯，扭曲狀。12批次樣本中均可見上述顯微特征，見圖1。

A.種皮柵狀細(xì)胞(白芥子)；B.糊化淀粉粒(延胡索)；C.草酸鈣砂晶(細(xì)辛)；D.木纖維(甘遂)。圖1 白芥子散顯微鑒別(40×10) A.seed coat palisade cells (Semen Sinapis Albae)；B.gelatinized starch granules (Corydalis Rhizoma)；C.calcium oxalate sand crystals ( Asari Radix et Rhizoma)；D.wood fiber (Kansui Radix).Fig.1 Microscopic characteristics of Baijiezi San(40×10)

2.3薄層色譜鑒別

2.3.1白芥子的薄層鑒別 取批號(hào)為180712的白芥子散粉末3.5 g，加甲醇50 mL，30 ℃恒溫條件下超聲(250 W，50 kHz)處理1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液；取除白芥子的其他藥材，按比例制備成缺白芥子的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成缺白芥子陰性溶液；取白芥子對照藥材1.0 g，同法制成白芥子對照藥材溶液；另取芥子堿硫氰酸鹽對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(3.5：5：1：0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，置日光下檢視。結(jié)果見圖2。

1.白芥子對照藥材；2.芥子堿硫氰酸鹽；3.供試品；4.陰性樣品。圖2 白芥子薄層色譜圖 1.reference drug of Semen Sinapis Albae；2.sinapine thiocyanate；3.sample；4.negative sample.Fig.2 TLC chromatogram of Semen Sinapis Albae

2.3.2延胡索的薄層鑒別 取批號(hào)為180712的白芥子散粉末5.0 g，加甲醇50 mL，30 ℃的恒溫條件下超聲(250 W，50 kHz)處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，加濃氨試液調(diào)至堿性，用乙醚振搖提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液；取除延胡索的其他藥材，按比例制備成缺延胡索的陰性對照樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺延胡索陰性溶液；同時(shí)另取延胡索對照藥材1.0 g，同法制成延胡索對照藥材溶液；再取延胡索乙素對照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。吸收上述溶液各2～3 μL，分別點(diǎn)于同一用G薄層板上，以甲苯-丙酮(9：2)為展開劑，展開，取出，晾干，以碘蒸汽熏至顯色，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果見圖3。

1.延胡索對照藥材；2.延胡索乙素；3.供試品；4.陰性樣品。圖3 延胡索薄層色譜圖 1.reference drug of Corydalis Rhizoma；2.tetrahydropalmatine；3.sample；4.negative sample.Fig.3 TLC chromatogram of Corydalis Rhizoma

2.3.3細(xì)辛的薄層鑒別 取批號(hào)為180712的白芥子散粉末3.5 g，加甲醇20 mL，30 ℃的恒溫條件下超聲(250 W，50 kHz)處理45 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液；取除細(xì)辛的其他藥材，按比例制備成缺細(xì)辛的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成缺細(xì)辛陰性溶液；另取細(xì)辛對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液。再取細(xì)辛脂素對照品加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)乙酸乙酯(4：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，放置于105 ℃至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見圖4。

1.細(xì)辛對照藥材；2.細(xì)辛脂素；3.供試品；4.陰性樣品。圖4 細(xì)辛薄層色譜圖 1.reference drug of Asari Radix et Rhizoma；2.Asarinin；3.sample；4.negative sample.Fig.4 TLC chromatogram of Asari Radix et Rhizoma

2.3.4甘遂的薄層鑒別 取批號(hào)為180712的白芥子散粉末3.5 g，加乙醇10 mL，30 ℃的恒溫條件下超聲(250 W，50 kHz)處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液；取除甘遂的其他藥材，按比例制備成缺甘遂的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成缺甘遂陰性溶液；另取甘遂對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液；再取大戟二烯醇對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-丙酮(10：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見圖5。

1.甘遂對照藥材；2.大戟二烯醇；3.供試品；4.陰性樣品。圖5 甘遂薄層色譜圖 1.reference drug of Kansui Radix；2.euphadienol；3.sample；4.negative sample.Fig.5 TLC chromatogram of Kansui Radix

2.4定量測定

2.4.1對照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取芥子堿硫氰酸鹽、細(xì)辛脂素對照品適量，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每毫升中分別含498.82，395.14 μg的混合對照品儲(chǔ)備液。

2.4.2供試品溶液的制備 精密稱取批號(hào)為180712的白芥子散粉末0.5 g，置150 mL錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)40 min，取出，冷卻至室溫，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。搖勻，過濾，取續(xù)濾液，離心，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4.3陰性樣品溶液的制備 按白芥子散處方比例，分別制備缺白芥子、細(xì)辛的陰性對照樣品，同“2.4.2”項(xiàng)下方法，制備陰性對照品溶液。

2.4.4色譜條件 色譜柱為X BridgeTMC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，5%→30%A；20～50 min，30%→60%A，50～60 min，90%A)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；樣品及對照品進(jìn)樣量：10 μL；芥子堿硫氰酸鹽及細(xì)辛脂素檢測波長均為280 nm。

2.4.5專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取上述混合對照品儲(chǔ)備液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。結(jié)果示目標(biāo)成分的色譜峰與相鄰色譜峰分離度>1.5，表明分離良好，且混合對照品溶液及供試品溶液中芥子堿硫氰酸鹽、細(xì)辛脂素對應(yīng)的保留時(shí)間處，陰性對照品溶液無吸收峰出現(xiàn)，因此該方法專屬性較好。見圖6。

A.缺白芥子陰性對照品溶液；B.缺細(xì)辛陰性對照品溶液；C.混合對照品溶液；D.供試品溶液。1.細(xì)辛脂素；2.芥子堿硫氰酸鹽。圖6 白芥子散高效液相色譜圖 A.negative control solution without Semen Sinapis Albae；B.negative control solution without Asari Radix et Rhizoma；C.mixed reference solution；D.sample solution；1.asarinin；2.sinapine thiocyanate.Fig.6 HPLC chromatograms of Baijiezi San

2.4.6線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合對照品儲(chǔ)備液適量，分別以甲醇稀釋2倍、5倍、10倍、50倍、100倍，獲得包括對照品儲(chǔ)備液在內(nèi)的6個(gè)不同濃度對照品液，按“2.4.4”項(xiàng)下色譜條件操作，以對照品濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以測得的峰面積Y為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程分別為：芥子堿硫氰酸鹽：Y=27 564X-49 685 (r=0.999 8)；細(xì)辛脂素：Y=12 279X+7 052.4 (r=0.999 9)，表明芥子堿硫氰酸鹽、細(xì)辛脂素分別在4.99～498.82，3.951～395.1 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7精密度實(shí)驗(yàn) 在室溫條件下，取“2.4.1”項(xiàng)下制備的對照品儲(chǔ)備溶液，按“2.4.4”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示芥子堿硫氰酸鹽、細(xì)辛脂素峰面積的RSD分別為0.84%和1.53%，表明儀器的精密度良好。

2.4.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取白芥子散樣品(批號(hào)：180712)，按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4.4”項(xiàng)下色譜條件操作并測定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽、細(xì)辛脂素平均含量分別為2.0和0.75 mg·g-1，RSD分別為2.23%和1.06%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份樣品溶液(批號(hào)：180712)，依次于樣品配制后0，6，8，12，24，36 h進(jìn)樣，測定峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示芥子堿硫氰酸鹽、細(xì)辛脂素峰面積的RSD分別為0.90%和2.25%(n=6)，表明36 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.4.10加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的白芥子散樣品(批號(hào)：180712)9份，每份約0.25 g，分別按已知含量的50%，100%，150%加入對照品，并按照“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.4.4”項(xiàng)下色譜條進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。最終得芥子堿硫氰酸鹽的平均加樣回收率為99.58%，RSD為1.17%，細(xì)辛脂素的平均加樣回收率為101.92%，RSD為1.55%，表明該方法回收率良好。結(jié)果見表1。

表1 芥子堿硫氰酸鹽和細(xì)辛脂素的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Recovery test results of sinapine thiocyanate and asarinin n=9

2.4.11含量測定 取12批白芥子散樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.4.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄芥子堿硫氰酸鹽、細(xì)辛脂素峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 12批次白芥子散芥子堿硫氰酸鹽及細(xì)辛脂素含量結(jié)果 Tab.2 Content determination results of sinapine thiocyanate and asarinin in 12 batches of Baijiezi San mg·g-1，n=9

3 討論

3.1顯微與薄層鑒別 白芥子散4種藥材的顯微特征較多，本研究選擇了白芥子(種皮柵狀細(xì)胞)、延胡索(糊化淀粉粒)、細(xì)辛(草酸鈣砂晶)、甘遂(木纖維)的特有顯微特征作為觀察要點(diǎn)，并同時(shí)觀察了對應(yīng)的缺味陰性樣品，在陰性樣品中并未見對應(yīng)藥材的特有顯微特征，表明此方法有效可行。

在白芥子、延胡索的薄層色譜鑒別過程中，展開劑的選擇參照了《中華人民共和國藥典》2020年版介紹的方法[13]，分離結(jié)果均較滿意，而在細(xì)辛及甘遂的薄層色譜鑒別中，以《中華人民共和國藥典》推薦的展開劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，兩者的薄層色譜斑點(diǎn)分離均較差。最終筆者發(fā)現(xiàn)以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4：1)為展開劑時(shí)，細(xì)辛各成分分離結(jié)果令人滿意；以石油醚(30～60 ℃)-丙酮(10：1)為展開劑時(shí)，甘遂的各成分斑點(diǎn)分離較好。

3.2含量測定指標(biāo)的選擇 白芥子散中芥子堿硫氰酸鹽目前已證實(shí)具有平喘功效[14]，為主要有效成分指標(biāo)之一，而細(xì)辛脂素具有促進(jìn)其他活性成分經(jīng)皮滲透而利于哮喘的治療[15]，且《中華人民共和國藥典》規(guī)定，芥子堿硫氰酸鹽、細(xì)辛脂素分別是白芥子和細(xì)辛的質(zhì)量控制成分，因此本研究選擇芥子堿硫氰酸鹽及細(xì)辛脂素為含量測定指標(biāo)。

3.3限量標(biāo)準(zhǔn)的建議 根據(jù)測定結(jié)果及《中華人民共和國藥典》對于中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求，并結(jié)合實(shí)際情況，建議白芥子散的水分不得超過15.00%，總灰分不得超過5.00%。考慮到芥子堿硫氰酸鹽及其水解產(chǎn)物對皮膚有強(qiáng)烈的刺激反應(yīng)，對其進(jìn)行限量實(shí)有必要，故建議其含量不得少于2.0 mg·g-1且不得超過4.0 mg·g-1，細(xì)辛脂素含量不得少于0.60 mg·g-1，上述結(jié)論可作為白芥子散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考依據(jù)。