何佳，周越美，趙智慧，譚春梅，張文婷

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310053；2.浙江天冉中藥飲片有限公司，紹興 311800 3.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥所，杭州 310052；4.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310052)

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子(RubuschingiiHu)的干燥果實(shí)，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目的功效[1]。《中華人民共和國(guó)藥典》自2015年版始，新增了覆盆子含量測(cè)定項(xiàng)，為采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定鞣花酸和山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量。鞣花酸一般以鞣花單寧、鞣花酸糖苷以及游離鞣花酸3種形式存在，其中鞣花單寧屬于水解單寧[2-3]，加熱回流過程可使鞣花單寧轉(zhuǎn)化為游離鞣花酸[4]，《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版覆盆子項(xiàng)下的鞣花酸實(shí)為游離鞣花酸?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版對(duì)覆盆子產(chǎn)地加工方法的規(guī)定為除去梗和葉，置沸水中略燙或略蒸[1]。然而通過實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，藥農(nóng)在覆盆子采收后往往未經(jīng)沸水浸煮而是采用直接曬干的方法對(duì)覆盆子進(jìn)行產(chǎn)地加工。此外，當(dāng)年新產(chǎn)覆盆子鞣花酸指標(biāo)易低于限度，而通過貯藏后可提高其含量。對(duì)于不同的產(chǎn)地加工方法、儲(chǔ)存條件與時(shí)間長(zhǎng)短等因素對(duì)覆盆子的質(zhì)量控制指標(biāo)是否會(huì)產(chǎn)生影響，目前研究中鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版覆盆子含量測(cè)定項(xiàng)下鞣花酸與山柰酚-3-O-蕓香糖苷的供試品溶液制備方法與色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用70%甲醇超聲提取75 min的方法制備供試品溶液，采用HPLC-波長(zhǎng)切換法，以乙腈-0.2%磷酸作為流動(dòng)相梯度洗脫，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法穩(wěn)定可靠，簡(jiǎn)便可行。并采用優(yōu)化后的方法分別測(cè)定不同加工方法、加速穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)條件下不同貯藏時(shí)間的覆盆子樣品中指標(biāo)成分的含量，分析指標(biāo)成分的影響因素與變化規(guī)律，以期為覆盆子的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司，配備DAD檢測(cè)器)；XPE205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.1 mg)。Milli-Q advantage A10 超純水儀(美國(guó)millipore SAS 公司)；Minispin12000轉(zhuǎn)離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；ELMASONIC P 超聲波清洗器(ELMA公司)；恒溫水浴鍋(德國(guó)優(yōu)萊博公司)；UF55plus電熱恒溫干燥箱(德國(guó)MEMMERT公司)；冷凍混合球磨儀(德國(guó)RETSCH公司)；蒸鍋；電熱板。

1.2對(duì)照品與試劑 鞣花酸(批號(hào)：111959-201903，含量：88.8%)、山柰酚-3-O-蕓香糖(批號(hào)：112007-201602，含量：90.8%)均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、磷酸為分析純(杭州化學(xué)試劑有限公司)，流動(dòng)相用乙腈為色譜純(MERCK公司)，水為Millipore超純水。

1.3樣品 本實(shí)驗(yàn)收集了10批的覆盆子飲片(S1-S10)用于含量測(cè)定，不同加工方法實(shí)驗(yàn)用樣品為采集自浙江諸暨的覆盆子鮮品，采集后采用不同的初加工方法自行加工制備成實(shí)驗(yàn)用樣品(J1-J6)。不同貯存時(shí)間實(shí)驗(yàn)用樣品是將自行加工后的直接曬干(Z1-Z4)、直接烘干(Z5-Z8)、蒸后曬干(Z9-Z12)3種加工處理的覆盆子放入恒溫恒濕箱，在(40±2) ℃、相對(duì)濕度(75±5)%條件下進(jìn)行加速穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)期間第0，1，2，3個(gè)月末取樣檢測(cè)。其中藥材的包裝與封裝條件應(yīng)與擬上市包裝一致。樣品具體信息見表1，樣品經(jīng)浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院郭增喜主任中藥師鑒定為薔薇科植物華東覆盆子(RubuschingiiHu) 的干燥果實(shí)。

表1 覆盆子樣品信息 Tab.1 Information of Rubus chingii Hu samples

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Besil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)(梯度洗脫0～55 min，8%～25% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～38 min，254 nm，38～55 min，344 nm。柱溫為25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；對(duì)照品、供試品均進(jìn)樣10 μL。供試品溶液與對(duì)照溶液HPLC圖譜見圖1。

1.鞣花酸；2.山柰酚-3-O-蕓香糖苷。圖1 混合對(duì)照品(A)和供試品溶液(B)HPLC圖 1.ellagic acid；2.kaophenol-3-O-rutin.Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A) and test solution(B)

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液的制備 分別取鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含鞣花酸9.88 μg、山柰酚-3-O-蕓香糖苷1.91 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取覆盆子粉末約0.50 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率400 W，頻率50 kHz)75 min，冷卻，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3線性關(guān)系考察 將“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，以1，2，4，8，16，24 μL的進(jìn)樣體積依次進(jìn)樣；以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，結(jié)果鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷在進(jìn)樣量分別為9.88～273.12 ng、1.91～45.84 ng范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，具體結(jié)果見表2。

表2 覆盆子2種指標(biāo)成分線性范圍與回歸方程 Tab.2 Linear range and regression equation of two index components in Rubus chingii Hu

2.4精密度考察 精密吸取混合對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，以各色譜峰的峰面積計(jì)算鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷的峰面積RSD分別為0.3%，1.5%，表明儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性考察 取同一覆盆子樣品(S3)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷6次測(cè)定的RSD分別為2.2%，1.3%，表明方法的重復(fù)性較好。

2.6溶液穩(wěn)定性考察 取同一覆盆子樣品(S3)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品1份，分別在制備0，2，4，6，12，24 h后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，結(jié)果鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷的峰面積RSD分別為0.5%，1.4%。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.7準(zhǔn)確性(回收率)考察 精密稱取已知含量樣品(S3)約0.25 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法2種供試品各稱取6份，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表3，鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷的平均回收率分別為104.27%，96.81%，RSD分別為2.6%，1.7%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求，說明本法準(zhǔn)確度良好。

表3 覆盆子中2個(gè)指標(biāo)成分加樣回收率 Tab.3 Recovery rate of two index components in Rubus chingii Hu with sample addition n=6

2.8樣品的測(cè)定 按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備樣品，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算各樣品中鞣花酸與山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量，結(jié)果見表4。

表4 覆盆子樣品含量測(cè)定結(jié)果 Tab.4 Content determination results of Rubus chingii Hu samples mg·g-1，n=2

3 討論

3.1不同加工方法對(duì)覆盆子2種指標(biāo)成分的影響 《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版對(duì)覆盆子產(chǎn)地加工方法的規(guī)定為除去梗和葉，置沸水中略燙或略蒸。產(chǎn)地加工的主要目的是迅速脫水、殺酶保苷，恰當(dāng)?shù)钠癄C處理可破壞酶的活性[5]。本實(shí)驗(yàn)采用覆盆子實(shí)際使用過程中使用到的6種加工方法對(duì)采集到的覆盆子鮮品進(jìn)行了初加工，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用直接曬干加工得到的覆盆子樣品，其鞣花酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出其他加工方式得到的樣品。由于鞣花單寧在酸、堿或酶的作用下可水解生成游離鞣花酸，直接曬干的加工方式由于溫度較低，無法將植物內(nèi)源酶抑制，因此造成直接曬干樣品鞣花酸含量遠(yuǎn)高于其他樣品，其原因可能是內(nèi)源酶對(duì)鞣花單寧作用。比較2種殺青方法得到的樣品，沸水殺青后得到的樣品鞣花酸含量較蒸汽殺青后樣品低，可能是由于在殺青過程中游離鞣花酸溶于沸水。而采用相同殺青方法殺青后的樣品曬干或烘干2種干燥方式則對(duì)指標(biāo)含量的影響較小。黃酮類山柰酚-3-O-蕓香糖苷較為穩(wěn)定，受加工方法的影響較小，6種加工方法得到的樣品中該成分的含量相差較小，未經(jīng)殺青處理而采用直接曬干與直接烘干加工而成的樣品其含量略高于殺青后的樣品，可能是由于殺青過程對(duì)山柰酚-3-O-蕓香糖苷造成了一定的損失。綜合考慮，產(chǎn)地加工方式中，以《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版方法蒸汽殺青后曬干或烘干來進(jìn)行覆盆子的產(chǎn)地加工較為合理。

3.2不同儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)覆盆子2種指標(biāo)成分的影響 覆盆子在我國(guó)分布較廣，多省多地均有種植，前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)當(dāng)年新產(chǎn)覆盆子鞣花酸指標(biāo)易低于限度，而通過貯藏后可提高其含量。為探索覆盆子貯藏過程中成分的變化，通過對(duì)3種代表性的覆盆子初加工樣品進(jìn)行加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)?zāi)M貯藏過程對(duì)覆盆子指標(biāo)成分的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種加工方法得到的覆盆子樣品中鞣花酸的含量均隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量則隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。將2個(gè)指標(biāo)成分的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 18.0版軟件中進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存時(shí)間與鞣花酸的含量呈極顯著正相關(guān)(r=0.908，P<0.01)，儲(chǔ)存時(shí)間與山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.583，P<0.05)，兩指標(biāo)成分含量直接相關(guān)性不顯著。不同加工方法得到的樣品儲(chǔ)存3個(gè)月較0月相比鞣花酸的含量變化：直接曬干樣品3個(gè)月樣品鞣花酸含量是0月樣品的2.75倍；直接烘干樣品是0月樣品的3.10倍；蒸汽殺青后曬干樣品是0月樣品的2.48倍，山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量變化：直接曬干樣品儲(chǔ)存3個(gè)月后含量為0月的75.62%；直接烘干樣品為82.23%；蒸汽殺青后曬干樣品為85.39%。殺青過的樣品兩指標(biāo)成分的變化較未殺青樣品緩慢。

3.3提取方法的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了回流提取、超聲提取、回流后正丁醇萃取、超聲后正丁醇萃取4種提取方法。4種提取方法得到的色譜圖均能呈現(xiàn)良好的分離。《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版中對(duì)于鞣花酸的提取方法采用的是加熱回流的提取方法，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，已有鞣花單寧可水解生成鞣花酸[6]，在前期實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)回流提取鞣花酸的含量為超聲提取的1.7倍，且隨著回流時(shí)間的增加，鞣花酸的含量在不斷增加，提示鞣花單寧在加熱回流的過程中會(huì)受熱水解生成游離鞣花酸，加熱回流的方法會(huì)影響鞣花酸提取的準(zhǔn)確性，而4種提取方法對(duì)于山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量的影響較小，綜合考慮后采用直接超聲的方法提取2種成分最為合理、簡(jiǎn)便可行。對(duì)提取溶劑進(jìn)行考察時(shí)，分別采用60%，70%，80%甲醇3種溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇對(duì)2種有效成分的提取率最高，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行考察時(shí)，選擇了45，60，75，90 min進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)75 min時(shí)2種成分已經(jīng)基本提取完全，故選擇75 min作為提取時(shí)間。

3.4色譜條件的優(yōu)化 由于鞣花酸與山柰酚-3-O-蕓香糖苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為254及344 nm，故采用HPLC-波長(zhǎng)切換的方法同時(shí)檢測(cè)2種成分?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版中對(duì)于2種成分均采用乙腈-0.2%磷酸(15：85)進(jìn)行等度洗脫，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該梯度下山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰形較差，而采用乙腈-0.2%磷酸進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，峰形得到改善，且可與周圍雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離。

3.5山柰酚-3-O-蕓香糖苷專屬性研究 本實(shí)驗(yàn)收集到覆盆子的偽品山莓、蓬蘽、軟覆盆子、甜葉懸鉤子，采用建立的含量測(cè)定方法對(duì)覆盆子正品及4種偽品進(jìn)行含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，4種偽品均不含有山柰酚-3-O-蕓香糖苷，結(jié)果表明，山柰酚-3-O-蕓香糖苷具有專屬性，可有效鑒別覆盆子與其代表性混偽品。在對(duì)10批覆盆子飲片進(jìn)行含量測(cè)定后，結(jié)果顯示S7、S8、S9等3批樣品含量均低于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版規(guī)定限度，進(jìn)一步對(duì)這3批樣品的性狀進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，S7、S8批樣品為過成熟樣品，《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版規(guī)定覆盆子應(yīng)在由綠變綠黃時(shí)進(jìn)行采收，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量會(huì)隨著覆盆子成熟度的變化而顯著降低[7]，S9號(hào)樣品經(jīng)鑒定后為摻有一定比例山莓的樣品。因此，該將指標(biāo)作為特征性鑒別指標(biāo)并對(duì)其含量進(jìn)行控制對(duì)于覆盆子的質(zhì)量評(píng)價(jià)較為合理。

覆盆子為藥食兩用植物，市場(chǎng)需求量較大，但質(zhì)量參差不齊。對(duì)于覆盆子的質(zhì)量控制，《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版覆盆子項(xiàng)下的2個(gè)指標(biāo)成分中，山柰酚-3-O-蕓香糖苷為覆盆子中主要的黃酮類成分，該成分具備專屬性，可以有效鑒別覆盆子及其代表性混偽品，且該成分含量受不同加工方法的影響較小，會(huì)隨著貯存時(shí)間的增加而降低，因此對(duì)其限量進(jìn)行控制對(duì)于覆盆子的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)較為合理。而鞣花酸成分實(shí)為游離鞣花酸，該成分受提取方法、產(chǎn)地加工方法、貯存時(shí)間的影響均較大，因此該成分不能夠真實(shí)地評(píng)價(jià)覆盆子的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，建議對(duì)該指標(biāo)進(jìn)行修訂。