袁金華，曾憲晶，劉伍才，羅亮

井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 吉安 343000

胃癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，根據(jù)全球癌癥研究機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌位于全球惡性腫瘤發(fā)病的第五位，死亡率位于第三位。我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率和死亡率分別占到全球的42.6%和45.0%［1］，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。當(dāng)前胃癌治療方法主要是手術(shù)、放療和化療，但預(yù)后較差，尋找有效的治療手段對(duì)本病的治療具有重要意義。

研究表明：核因子-κB（NF-κB）是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 信號(hào)通路可以調(diào)控細(xì)胞増殖、分化和凋亡等重要生理功能，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［2］。泛素結(jié)合酶9（Ubc9）是小泛素相關(guān)修飾物（SUMO）過(guò)程中唯一的結(jié)合酶，Ubc9 在細(xì)胞增殖、有絲分裂、周期進(jìn)程、分化等方面發(fā)揮著重要作用［3］，Ubc9 在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，可能參與了腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的病理過(guò)程，并且可能與腫瘤的耐藥相關(guān)［4］，研究已證實(shí)Ubc9 是一個(gè)促癌基因［5］，抑制Ubc9 基因后NF-κB 信號(hào)通路的凋亡蛋白降低［6］?；诖耍覀兺茰y(cè)Ubc9 基因可能通過(guò)影響NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖及凋亡，為治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

胃癌SGC7901 細(xì)胞株（購(gòu)自上海賽默生物有限公司），兔抗Ubc9 單克隆抗體、兔抗p65 單克隆抗體、兔抗IKBα 單克隆抗體、兔抗Bcl-2 單克隆抗體、山羊抗小鼠β-actin（美國(guó)Abcam 公司），Ubc9 引物（Generay Biotech 公司），RNA 提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PCR 檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Opti-DMEM、轉(zhuǎn)染試 劑Lipofectamine 2000（Invitrogen 公 司），Trizol Reagent（Invitrogen 公司），胎牛血清（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），RPIM-1640 培養(yǎng)基（Hyclone公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組、轉(zhuǎn)染

SGC7901 細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPIM-1640 培養(yǎng)基中，于5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每3～4 d 按照1∶3 比例傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。按5×104mL 的細(xì)胞密度接種至六孔板中后放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為四組：正常胃癌細(xì)胞A 組（Normal 組），脂質(zhì)體B 組（Lipo-2000 組），空載質(zhì)粒C 組（NC-shRNA 組），及目的質(zhì)粒D 組（Ubc9-shRNA 組），質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序均由上海吉瑪公司負(fù)責(zé)完成，細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法：準(zhǔn)備5 個(gè)1.5 mL的EP 管，分別向每管內(nèi)加入0.5 mL Opti-DMEM，其中2 個(gè)EP 管做好標(biāo)記分別加入10 μg 空載質(zhì)粒及目的質(zhì)粒，余3 管加入20 μL 的lipo2000，混合后靜置。接著向加入lipo2000 的3 個(gè)EP 管分別加入目的質(zhì)粒、空載質(zhì)粒以及500 μL Opti-DMEM，混勻，最后將配制好的各EP 管內(nèi)液體分別加入所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿中，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，使用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板進(jìn)行qRT-PCR 目的基因擴(kuò)增，結(jié)果計(jì)算根據(jù)LC 480檢測(cè)得出的CT 值為cDNA 熒光強(qiáng)度達(dá)到所設(shè)定閥值的循環(huán)數(shù)，ΔCt=目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值，每個(gè)樣品中mRNA 相對(duì)表達(dá)量=2-ΔCT× 100%。

表1 引物序列

1.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度，上樣SDS-PAGE 膠，電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，抗體孵育，顯影成像，利用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶灰度值，記錄其相對(duì)表達(dá)量。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡

細(xì)胞周期檢測(cè)：調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，離心，棄上清，重懸后收集細(xì)胞，采用1 mL 已配制好的周期試劑檢測(cè)各組細(xì)胞的周期，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)后，30 min 內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期。細(xì)胞凋亡測(cè)定：調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，離心，棄上清，重懸后收集細(xì)胞，滴 入500 μL Binding Buffer溶液重懸后加入5 μL AnnexinV-FITC 混勻，再加入5 μL 碘化丙啶，混勻，室溫避光孵育，1 h 內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

24 h 后在熒光顯微鏡下觀察熒光的顯示情況，當(dāng)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染后，質(zhì)粒進(jìn)入胃癌細(xì)胞即可在熒光顯微鏡呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的綠色熒光，見(jiàn)圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察mir-Ubc9向SGC 7901細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況（×200）

2.2 RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組Ubc9 基因mRNA 的表達(dá)水平

各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)的處理24 h 后，將Normal 組，Lipo-2000 組，空載質(zhì)粒NC-shRNA 組作為對(duì)照組，與對(duì)照組相比，人工合成的針對(duì)Ubc9 基因的miRNA 質(zhì)粒（Ubc9-shRNA 組）能顯著地抑制胃癌SGC7901 中Ubc9 基因的表達(dá)（0.31±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組泛素結(jié)合酶9 mRNA表達(dá)情況：A.正常胃癌細(xì)胞組；B.脂質(zhì)體組；C.空載質(zhì)粒組；D.目的質(zhì)粒組

2.3 Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染mir Ubc9 后細(xì)胞內(nèi)Ubc9與α-SMA 的表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，人工合成的針對(duì)Ubc9 基因的miRNA 質(zhì)粒明顯抑制了SGC7901 中Ubc9 蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.28±0.06，P＜0.05）。同時(shí)SGC7901細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)量也明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.28±0.06，P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

圖3 各組泛素結(jié)合酶9和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)情況：A.正常胃癌細(xì)胞組；B.脂質(zhì)體組；C.空載質(zhì)粒組；D.目的質(zhì)粒組

表2 各組泛素結(jié)合酶9和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白蛋白表達(dá)水平（，n=4）

表2 各組泛素結(jié)合酶9和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白蛋白表達(dá)水平（，n=4）

注：與D組比較，aP＜0.05。

2.4 流式檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 細(xì)胞周期結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后胃癌SGC7901 細(xì)胞的周期被阻滯在G2/M 期，并且能夠促進(jìn)SGC7901 的凋亡，與各對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（20.45±2.71，P＜0.05），提示Ubc9 基因可能調(diào)控SGC7901 細(xì)胞的細(xì)胞周期。見(jiàn)圖4、表3。

圖4 細(xì)胞周期情況：A.正常胃癌細(xì)胞組；B.脂質(zhì)體組；C.空載質(zhì)粒組；D.目的質(zhì)粒組

表3 各組SGC 7901細(xì)胞周期情況（，n=4）

表3 各組SGC 7901細(xì)胞周期情況（，n=4）

注：與D組比較，aP＜0.05。

2.4.2 細(xì)胞凋亡結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞的凋亡增加明顯，與各對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示Ubc9 基因可能參與調(diào)控SGC7901 細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖5、表4。

表4 各組SGC 7901細(xì)胞凋亡率（，n=4）

表4 各組SGC 7901細(xì)胞凋亡率（，n=4）

注：與D組比較，aP＜0.05。

圖5 細(xì)胞凋亡情況：A.正常胃癌細(xì)胞組；B.脂質(zhì)體組；C.空載質(zhì)粒組；D.目的質(zhì)粒組

2.5 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞IKBα、p65 與Bcl-2 蛋白表達(dá)結(jié)果

與對(duì)照組相比，Ubc9-shRNA 組SGC7901 細(xì)胞內(nèi)p65 與Bcl-2 蛋白表達(dá)量明顯下降（0.28±0.06，0.28±0.04，P＜0.05），而IKBα 的表達(dá)量增加明顯（0.9±0.05，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖6 與表5。

圖6 各組相關(guān)蛋白表達(dá)情況：A.正常胃癌細(xì)胞組；B.脂質(zhì)體組；C.空載質(zhì)粒組；D.目的質(zhì)粒組

表5 各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平表

3 討論

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥物治療腫瘤的重要機(jī)制之一［7-8］。研究表明，泛素樣小分子修飾SUMO 參與了多種細(xì)胞進(jìn)程，如細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及DNA 損傷修復(fù)等［9］。SUMO是一個(gè)重要的、多步驟的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程，而Ubc9 在SUMO 化這一過(guò)程中至關(guān)重要，Ubc9 是SUMO 修飾過(guò)程中唯一的E2 結(jié)合酶［10］，能增強(qiáng)SUMO 化修飾從而調(diào)控細(xì)胞凋亡［11］。

人類(lèi)胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)NF-κB 通路極度活躍，它可通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲等相關(guān)環(huán)節(jié)促進(jìn)癌變［12］，NF-κB 是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，與炎癥、凋亡等過(guò)程密切相關(guān)。NF-κB 是普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種快反應(yīng)因子，在靜息狀態(tài)下，它與抑制因子IκB 形成復(fù)合物，以無(wú)活性的潛在狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。NF-κB信號(hào)通路是由細(xì)胞外的刺激引起的，受體蛋白接受刺激后先活化IκB 激酶（IKK）。IKK 將細(xì)胞內(nèi)NFκB·IκB 復(fù)合物的IκB 亞基調(diào)節(jié)位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化，使得IκB 亞基被泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶降解，從而釋放NF-κB 二聚體［13］。p50 和p65 組成的二聚體為NF-κB 的主要形式，p50 是與DNA 結(jié)合的部位，p65 參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)，p65 是NF-κB 的主要活性形式，并可促進(jìn)p50 與DNA 結(jié)合，當(dāng)p65 與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抑制蛋白IκB 結(jié)合，可掩蓋p50 上核定位信號(hào)，僅有p65 的蛋白C 末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，能夠直接啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄［14-15］。本研究中觀察：Ubc9 能抑制SGC7901 細(xì)胞內(nèi)的p65入核，從而抑制NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 特定靶кB 部位結(jié)合，進(jìn)而抑制NF-κB 的活化，同時(shí)本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)胃癌SGC7901 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ubc9 后，與各對(duì)照組比較，Ubc9-shRNA 組IKBα 表達(dá)量增加，p65 的表達(dá)量減少（P＜0.05），提示人工合成的針對(duì)Ubc9 基因的miRNA 質(zhì)粒明顯能夠抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活，證實(shí)了文獻(xiàn)［13］研究結(jié)論，Ubc9 能與IKBα 結(jié)合并發(fā)生相互作用，延緩IKBα 的降解和NF-κB 的轉(zhuǎn)錄激活。

細(xì)胞凋亡一種程序性的細(xì)胞死亡，Bcl-2 基因主要的生理功能是減少細(xì)胞凋亡［16］，研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2 基因在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)。研究證實(shí)，凋亡是由于caspases 家族蛋白的瀑布式反應(yīng)而導(dǎo)致的細(xì)胞自身溶解的過(guò)程，Bcl-2 蛋白不僅能抑制細(xì)胞凋亡，亦可能拮抗抑癌基因所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。作為抗凋亡蛋白，Bcl-2 蛋白能夠通過(guò)抑制腫瘤凋亡來(lái)促進(jìn)其擴(kuò)散。轉(zhuǎn)錄激活后入核的NF-κB 可調(diào)控反向凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax 及細(xì)胞增殖相關(guān)基因Cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們觀察發(fā)現(xiàn)Ubc9 轉(zhuǎn)染后胃癌SGC7901細(xì)胞的周期被阻滯在G2/M 期，并且細(xì)胞的凋亡增加明顯，NF-κB 轉(zhuǎn)錄激活后Bcl-2 水平降低，與各對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示Ubc9 可能是通過(guò)NF-κB 通路影響B(tài)cl-2 基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控胃癌SGC7901 細(xì)胞的凋亡。Mo 等［17］下調(diào)Ubc9 后乳腺癌MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，凋亡增加，Ubc9 是通過(guò)Bcl-2 發(fā)揮作用，結(jié)果表明Ubc9 通過(guò)影響B(tài)cl-2 基因表達(dá)而具有抗凋亡作用。

綜上所述，人工合成的針對(duì)Ubc9 基因的miRNA質(zhì)粒能夠抑制SGC7901 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，為胃癌的治療提供了一種新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而對(duì)于其具體的通路以及如何影響胃癌細(xì)胞周期的分子機(jī)制尚未明確。