王蕾 李琰

[摘要]目的：探究冰石長皮軟膏拆方對皮膚慢性潰瘍大鼠膠原沉淀、炎癥因子及VEGF蛋白水平的影響。方法：把實驗所用的75只小鼠隨機分為5組（n=15），分別為空白組、模型組、原方組、拆方組、西藥組，空白組造普通潰瘍創(chuàng)面模型，其余4組造慢性潰瘍創(chuàng)面模型?？瞻捉M和模型組大鼠創(chuàng)面敷生理鹽水紗布條，原方組大鼠創(chuàng)面敷冰石長皮軟膏原方藥膏紗布條，拆方組大鼠創(chuàng)面敷冰石長皮軟膏拆方藥膏紗布條，西藥組大鼠創(chuàng)面敷凡士林油紗布條。觀察各組大鼠一般狀態(tài)，創(chuàng)面面積及愈合率，HE染色比較各組大鼠創(chuàng)面組織形態(tài)變化，ELISA檢測比較各組大鼠創(chuàng)面血清中炎癥因子IL-8和TNF-α的含量，蛋白質(zhì)印跡及RT-PCR檢測各組大鼠組織中VEGF蛋白和mRNA的表達。結(jié)果：在造模后，各組大鼠一般情況變差;用藥時，大鼠創(chuàng)面顏色變深，肉芽組織相對減少。造模后，創(chuàng)面面積模型組<原方組<拆方組<西藥組，但愈合率原方組>拆方組>西藥組>模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。和模型組大鼠創(chuàng)面組織病理學比較，西藥組、拆方組和原方組大鼠組織的創(chuàng)面和炎細胞浸潤逐漸減少，而組織中毛細血管的數(shù)量逐漸增多。給藥3、7d時，西藥組、拆方組和原方組創(chuàng)面炎癥因子IL-8和TNF-α的含量均低于模型組（P<0.05），且呈逐漸遞減趨勢。VEGF蛋白和mRNA結(jié)果顯示，西藥組、拆方組和原方組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF蛋白和mRNA表達均顯著高于模型組（P<0.05），且呈逐漸遞增趨勢。結(jié)論：冰石長皮軟膏拆方可有效增加慢性皮膚潰瘍膠原沉淀，促進創(chuàng)面愈合，減輕創(chuàng)面組織中炎癥因子的含量及促進血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達。

[關(guān)鍵詞]冰石長皮軟膏拆方;皮膚;慢性潰瘍;膠原沉淀;創(chuàng)面愈合;炎癥因子;VEGF

[中圖分類號]R632.1? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）03-0090-06

Effects of Bingshi Changpi Ointment on Collagen Deposition，Inflammatory Factors and Vegf Protein Levels in Rats with Chronic Skin Ulcer

WANG Lei，LI Yan

（Department of Traditional Chinese Medicine， the Ninth People's Hospital Affiliated to the Medical College of Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200125，China）

Abstract： Objective To explore the effects of Bingshi Changpi ointment on collagen precipitation， inflammatory factors and VEGF protein levels in rats with chronic skin ulcer. Methods The 75 mice used in the experiment were randomly divided into 5 groups （n=15），which were blank group， model group， original formula group， disassembled formula group and Western medicine group. The blank group made ordinary ulcer wound model， and the other 4 groups made chronic ulcer wound model. Rats in the blank group and the model group were applied with normal saline gauze strips， rats in the original formula group were applied with Bingshi Changpi ointment， rats in the simplified group were applied with Bingshi Changpi ointment， rats in the western medicine group were applied with vaseline oil gauze strips. The general state， wound area and healing rate of rats in each group were observed. The morphological changes of wound tissue in each group were compared by HE staining， and the inflammatory factors IL-8 and TNF in wound serum of rats in each group were detected by ELISA-α The expression of VEGF protein and mRNA in rat tissues was detected by Western blot and RT-PCR. Results After modeling， the general condition of the rats in each group became worse; when the drug was administered， the color of the wound surface of the rats became darker， and the granulation tissue was relatively reduced. After modeling， the wound area model group < original recipe group < disassembled recipe group < western medicine group， but the healing rate of the original recipe group > disassembled recipe group > western medicine group > model group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the histopathology of the wounds of the rats in the model group， the wounds and inflammatory cell infiltration in the tissues of the western medicine group， the disassembled prescription group and the original prescription group gradually decreased， while the number of capillaries in the tissues gradually increased. On the 3rd and 7th day of administration， the contents of inflammatory factors IL-8 and TNF-α in the wounds of the western medicine group， the disassembled prescription group and the original prescription group were lower than those of the model group （P<0.05）， and showed a gradually decreasing trend. The results of VEGF protein and mRNA showed that the expressions of VEGF protein and mRNA in the wound tissue of the western medicine group， the split prescription group and the original prescription group were significantly higher than those of the model group （P<0.05）， and showed a gradual increasing trend. Conclusion Bingshi Changpi ointment can effectively increase collagen deposition in chronic skin ulcer， promote wound healing， reduce the content of inflammatory factors and promote the expression of vascular endothelial growth factor VEGF.

Key words： Bingshi Changpi ointment; skin; chronic ulcer; collagen deposition; wound healing; inflammatory factors; VEGF

皮膚潰瘍是指2周以上創(chuàng)面未愈合的皮膚軟組織缺損，手術(shù)刀口、意外創(chuàng)傷等多種原因都會引發(fā)皮膚潰瘍的發(fā)生，其不僅是臨床上較難治愈的疾病之一，也是修復(fù)創(chuàng)面的難題之一[1]。慢性皮膚潰瘍是一種常見的皮膚潰瘍，具有發(fā)病率高、病程長、易反復(fù)等特點，極大地影響患者的生活質(zhì)量。目前，臨床上通常采用保護劑、抗生素、微量元素等局部治療法治療皮膚潰瘍，但治療后的創(chuàng)面一直處于自然愈合階段，這在一定程度上限制了創(chuàng)面的愈合[2]。某些生長因子可促進細胞增殖以及創(chuàng)面愈合，不過創(chuàng)面愈合需多種生長因子共同作用，這一過程中引起的細胞過度增殖又會引發(fā)創(chuàng)面形成增殖性瘢痕甚至是癌變，故其安全性備受人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管再生過程中發(fā)揮著重要的作用，而血管生成與慢性潰瘍性疾病密切相關(guān)[3-4]。腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白介素8（Interleukin-8，IL-8）是炎癥反應(yīng)的重要因子，因此慢性皮膚潰瘍引起的慢性炎癥有致癌風險[5]。中醫(yī)學有著豐富的修復(fù)創(chuàng)面和治療慢性潰瘍疾病的臨床經(jīng)驗[6]。冰石長皮膏是上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院的傳統(tǒng)制劑，經(jīng)過近40年的臨床實踐，對治療難愈性皮膚潰瘍可以明顯促進創(chuàng)面肉芽組織生長，加速創(chuàng)面愈合，縮短治療周期，效果確實可靠，但其具體作用機制尚不明確[7]，因此本文建立慢性皮膚潰瘍大鼠模型，觀察冰石長皮軟膏拆方對大鼠皮膚創(chuàng)面愈合情況、炎癥因子和VEGF蛋白表達。

1? 材料和方法

1.1 動物：75只雄性SD大鼠[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2006-0009]。大鼠質(zhì)量為180～220 g，清潔級，所有大鼠均飼養(yǎng)在清潔的動物房內(nèi)，保持室內(nèi)溫度為20℃～24℃，相對濕度為40%，光照12 h一循環(huán)，晝夜交替。

1.2 藥物：冰石長皮軟膏、冰石長皮軟膏拆方、凡士林（上海交通大學醫(yī)藥院附屬第九人民醫(yī)院制劑室提供）。冰石長皮軟膏由101 g煅石膏、101 g煅硼砂、3 g冰片、30 g升丹、30 g象皮組成;冰石長皮軟膏拆方（去升丹和象皮）由101 g煅石膏、101 g煅硼砂、3 g冰片組成。將各組方涂抹在紗布上制成厚度為3 mm的藥膏紗布。

1.3 試劑和儀器：一次性無菌敷料貼（山東東華醫(yī)療科技有限公司，批號：20130187）;注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：Y051122）;HE染色液（北京中杉金橋公司，批號：ZLI-9610）;VEGF抗體（天津瑞博星科技有限公司）;超純RNA提取試劑盒（美國AppliedBiosystems公司，批號：Cat#CW0581）;EG1140C包埋機、RM2135石蠟切片機（德國Leica公司）;EOSM3數(shù)碼相機（日本佳能公司）。

1.4 動物分組：把75只小鼠隨機分5組，分別為空白組、模型組、原方組、拆方組和西藥組，每組15只。

1.5 模型制備：在實驗前1 d用脫毛膏將大鼠背部皮膚脫毛，實驗當天2.5%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉大鼠，如圖1所示在背部脊柱兩側(cè)制作6個1.5 cm2的全層皮膚缺損潰瘍創(chuàng)面。除空白組外的其余4組大鼠在筋膜下噴灑金黃色葡萄球菌，并用3層紗布覆蓋創(chuàng)面部位，用橡皮膏包扎創(chuàng)面并固定，各組大鼠均肌肉注射氫化可的松3.75 mg/kg。當觀察到各組大鼠的體重及潰瘍的面積沒有明顯的差異時開始給藥干預(yù)。

1.6 給藥：治療時將含不同藥物的紗布條敷在各組大鼠的創(chuàng)面上，空白組和模型組大鼠在創(chuàng)面均覆蓋生理鹽水紗布條治療;原方組大鼠在創(chuàng)面覆蓋冰石長皮軟膏原方藥膏紗布條治療;拆方組大鼠在瘡創(chuàng)面覆蓋冰石長皮軟膏拆方藥膏紗布條治療;西藥組大鼠在創(chuàng)面覆蓋凡士林油紗布條治療，用醫(yī)用紗布和橡皮膏將創(chuàng)面固定，紗布1天更換1次，直至所有創(chuàng)面愈合。

1.7 檢測指標與方法：各組大鼠在造模3 d和7 d后，隨機取出5只大鼠并抽取腹主動脈血，用于指標檢測。在造模3、7、14 d時，各組隨機取出4只大鼠并處死，取各組大鼠傷口組織，石蠟包埋后切片，用于HE染色和RT-PCR檢測。

1.7.1 一般指標：造模成功后，每天觀察各組大鼠的飲食、排便、活動及大鼠體重的變化，并記錄。

1.7.2 皮膚創(chuàng)面面積及愈合率：造模3、7、14 d時，用透明膜覆蓋創(chuàng)面。記號筆畫膜，再將透明膜覆蓋在心電圖紙上計算創(chuàng)面面積。按下列公式計算創(chuàng)面愈合率：愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.7.3 皮膚創(chuàng)面組織學觀察：造模3、7、14 d時，隨機取各組大鼠4只，處死后取皮膚創(chuàng)面組織，用福爾馬林將組織固定48 h后，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片處理;用HE染色后在顯微鏡下觀察各組創(chuàng)面組織的變化情況。

1.7.4 ELISA檢測TNF-α和IL-8含量：各組大鼠在給藥3、7 d時麻醉大鼠，取各組大鼠腹主動脈血，將血液靜置30 min后離心處理，15 min后收集上清液，將其裝置于EP管中，用ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-8、TNF-α的含量，實驗操作均按照試劑盒說明書嚴格進行。

1.7.5 蛋白質(zhì)印跡檢測大鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織VEGF蛋白表達：于造模14 d時，取創(chuàng)面組織50 mg進行12.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出放入TBS-T中清洗3次，每次3 min。封閉：配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，置于4℃過夜。結(jié)合一抗：用封閉液將一抗1：400稀釋，與膜一起孵育3 h，室溫振蕩。洗膜：TBS-T溶液中清洗3次，每次5 min。結(jié)合二抗：用封閉液將二抗1：3 000稀釋，與膜共同孵育1.5 h，洗膜同上。暗室中在膜上滴加ECL，經(jīng)適當顯色后，用保鮮膜將膜包好，將膜放入暗盒中，上置醫(yī)用X光膠片，暴光適當時間，經(jīng)顯影，定影，室溫下晾干。圖像掃描，灰度分析。實驗重復(fù)3次。以VEGF與β-actin的光密度比值表示VEGF蛋白的表達。應(yīng)用圖像分析軟件Image J進行光密度半定量蛋白質(zhì)檢測。

1.7.6 RT-PCR檢測大鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織VEGF mRNA的表達：分別取各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織，PBS將組織清洗后提取總的RNA。按照42℃ 60 min、72℃ 5 min的反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)。擴增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，40個循環(huán)。運用2-△△Ct法計算基因相對表達量。VEGF引物序列：正向引物為5'-CTCGCAGTCCGAGCCGGAGA-3'，反向引物為5'-GCAGCCTGGGACCACTTGGC-3';β-actin引物序列：正向引物5'-GGGAATGGGTCAGAAGGACT-3'，反向引物5'-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3'。

1.8 統(tǒng)計學分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對各組大鼠創(chuàng)面面積、愈合率、血清中TNF-α和IL-8含量，創(chuàng)面組織病理學變化及VEGF蛋白和mRNA的表達進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，采用t檢驗兩組間的數(shù)據(jù)比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況變化比較：在造模過程中，原方組死亡1只大鼠，拆方組死亡1只大鼠;在造模后，各組大鼠飲食減少，排便變稀，體重逐漸下降，出現(xiàn)蜷縮且活動減少的現(xiàn)象，創(chuàng)面組織有腥臭味的分泌物，2 d后發(fā)現(xiàn)大鼠的分泌物減少且變稀;用藥時，大鼠的創(chuàng)面顏色變深，肉芽組織相對減少。

2.2 各組大鼠創(chuàng)面面積及愈合率比較：造模3 d時，各組大鼠皮膚創(chuàng)面面積及愈合率沒有明顯的差異（P>0.05）;造模7、14 d時，各組創(chuàng)面面積逐漸下降，愈合率逐漸上升，其中模型組大鼠創(chuàng)面面積最高，皮膚愈合率最低，符合慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合遲緩的表現(xiàn);原方組創(chuàng)面面積<拆方組創(chuàng)面面積<西藥組創(chuàng)面面積，且原方組愈合率>拆方組愈合率>西藥組愈合率（P<0.05），見表1。

2.3 各組大鼠創(chuàng)面組織學變化比較：各組大鼠創(chuàng)面組織學病理情況見表2，圖2。

2.4 各組大鼠炎癥因子TNF-α和IL-8含量比較：給藥3、7 d時，空白組、模型組、西藥組、拆方組和原方組大鼠創(chuàng)面血清中炎癥因子IL-8和TNF-α的含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），和空白組相比，模型組炎癥因子IL-8和TNF-α含量顯著增加，西藥組、拆方組和原方組炎癥因子含量均顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

2.5 各組大鼠造模14 d時創(chuàng)面組織中VEGF蛋白表達比較：空白組、模型組、西藥組、拆方組和原方組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;和空白組相比，模型組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF蛋白表達顯著降低（P<0.05）;西藥組、拆方組和原方組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF蛋白表達均顯著高于模型組，且呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖3～4。

2.6 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中VEGF mRNA表達比較：空白組、模型組、西藥組、拆方組和原方組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF mRNA表達分別為1.98±0.23、0.36±0.12、0.76±0.19、1.02±0.31、1.53±0.29，五組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;和空白組相比，模型組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF mRNA表達顯著降低（P<0.05）;西藥組、拆方組、原方組VEGF mRNA表達均高于模型組，呈遞增趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖5。

3? 討論

慢性皮膚潰瘍是外科中難治疾病之一，主要是由于于創(chuàng)面局部微環(huán)境的異常變化導致創(chuàng)面難以修復(fù)[8]。目前臨床上常采用清創(chuàng)、換藥、植皮等方法治療創(chuàng)面，但治療的效果還不是十分的理想。有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞是導致慢性皮膚潰瘍炎癥持續(xù)存在的主導因素[9]。研究證實，創(chuàng)面愈合程度從炎癥轉(zhuǎn)為修復(fù)所必須經(jīng)過的過程主要為巨噬細胞的變化，其會由炎性表型過渡到修復(fù)性表型[10-11]。當慢性難以愈合創(chuàng)面中巨噬細胞表型的轉(zhuǎn)化功能出現(xiàn)時，會阻止其抗炎癥的功效，難以發(fā)揮修復(fù)功能，所以巨噬細胞表型轉(zhuǎn)發(fā)發(fā)生異常會讓創(chuàng)面的炎癥一直存在，遲緩了創(chuàng)面的愈合。在中醫(yī)中，慢性皮膚潰瘍屬于“瘡瘍”的范疇，其屬首辨陰陽，其中在慢性難愈合性皮膚潰瘍中最常見的證行為陰瘡，也是導致創(chuàng)面愈合的主要障礙[12]。目前，中醫(yī)學對潰瘍治療有著悠久的歷史和良好的療效，中藥藥膏外敷方法簡單，療效確切，副作用小，一直廣泛應(yīng)用于臨床。冰石長皮膏由煅石膏、冰片、象皮粉、升丹、硼砂組成，諸藥解毒祛腐活血化瘀，生肌斂瘡，奏效迅速。郭仲華等[13]提出皮膚潰瘍創(chuàng)面的愈合規(guī)律是“腐去肌生”和“肌平皮長”。“煨膿長肉”是中醫(yī)傳統(tǒng)的療瘡愈傷的法則。

本研究結(jié)果顯示，皮膚缺損潰瘍大鼠創(chuàng)面組織有大量的炎性細胞浸潤，西藥組、拆方組和原方組均增加成纖維細胞和毛細血管數(shù)量，減少炎性細胞浸潤。創(chuàng)面愈合面積和愈合率結(jié)果顯示，各個給藥組大鼠的創(chuàng)面愈合率也明顯增加，大鼠創(chuàng)面的愈合時間和面積也得到了減少;創(chuàng)面組織中出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)，開啟了愈合的程序，讓炎癥發(fā)展為增殖期，新生大量的膠原，進而形成肉芽組織，表明西藥組、拆方組和原方組均可促進大鼠慢性潰瘍的創(chuàng)面愈合。冰石長皮膏在傳統(tǒng)的中藥生肌散的基礎(chǔ)上研制，半個世紀以來成功治愈各種慢性潰瘍不逾萬例，蕢綱[14]等研究發(fā)現(xiàn)，長皮膏結(jié)合中藥離子可有效減輕指端傷殘傷口的腫脹及疼痛，明顯縮短患指創(chuàng)面愈合時間。

肉芽組織形成是所有創(chuàng)傷修復(fù)的關(guān)鍵，直接影響創(chuàng)傷愈合程度及其預(yù)后，其本質(zhì)是大量的毛細血管和成纖維細胞形成，其中毛細血管再生及血管網(wǎng)形成均起重要作用[15]。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)唯一作用于血管內(nèi)皮細胞的生長因子，在血管新生中起到關(guān)鍵作用[16]。很多研究已經(jīng)證實VEGF可以促進血管的新生，從而促進潰瘍愈合。同時，有研究表明，慢性皮膚潰瘍的發(fā)病與炎癥刺激相關(guān)[17]。有研究表明，炎癥因子 TNF-α及IL-8含量過高不僅可以導致潰瘍組織炎癥反應(yīng)，還會抑制創(chuàng)面的愈合，而降低炎癥因子的水平則可以促進潰瘍的愈合[18]。本研究結(jié)果顯示，藥物干預(yù)后的西藥組、拆方組和原方組大鼠創(chuàng)面組織中的炎癥因子TNF-α和IL-8均少于模型組，且組織中的VEGF蛋白表達均高于模型組，且炎癥因子呈遞減趨勢，VEGF表達呈遞增趨勢，可見在皮膚慢性潰瘍發(fā)生時出現(xiàn)大量的炎癥因子，且VEGF表達減少，冰石長皮軟膏和冰石長皮軟膏拆方均可抑制創(chuàng)面炎癥因子的含量，且有效增加血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF的表達。羊羨等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面組織中炎癥因子TNF-α、IL-6含量顯著升高，VEGF表達顯著降低。冰石長皮軟膏由煅石膏、硼砂、冰片、象皮粉、升丹組成，功效“清熱解毒，祛腐生肌”，方中冰片芳香清熱止痛，能辟一切邪惡，又能引諸藥入竅，硼砂、升丹祛腐解毒，煅石膏、象皮粉清熱斂瘡。近年來，受制于野生保護動物（象皮）和重金屬毒性（升丹），造成藥物時難接續(xù)，對長皮膏藥物應(yīng)用推廣及科室發(fā)展造成較大影響。因此本研究證實，保留原方功效的前提下，依照增效減毒的原則，精簡拆方也可以起到有效的作用。廖明娟[20]等通過對觀察冰石長皮膏對大鼠慢性難愈合創(chuàng)面的療效觀察? 發(fā)現(xiàn)，冰石長皮膏能明顯促進大鼠慢性難愈性創(chuàng)面愈合，縮短愈合時間。

綜上所述，冰石長皮軟膏拆方可有效增加慢性皮膚潰瘍膠原沉淀，促進創(chuàng)面愈合，減輕創(chuàng)面組織中炎癥因子的含量及促進血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達。

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[收稿日期]2021-09-14

本文引用格式：王蕾，李琰.冰石長皮軟膏拆方對皮膚慢性潰瘍大鼠膠原沉淀、炎癥因子及VEGF蛋白水平的影響[J].中國美容醫(yī)學，2022，31（3）：90-95.