李鳳華，李作華，楊 麗，員永春，王素香，王愛香，李 蔚, ，鄭鳳家

（1.山東省疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南 250014；2.山東質(zhì)安信技術(shù)服務(wù)有限公司，山東 濟(jì)南 250000；3.奧邁檢測有限公司，山東 菏澤 274000）

真菌毒素是一類由產(chǎn)毒真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的具有毒性作用的次級代謝產(chǎn)物，目前已知的真菌毒素有300余種[1?2]，其中常見的易對人體產(chǎn)生危害的真菌毒素有：黃曲霉毒素、單端孢霉烯族類毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素和赭曲霉毒素等。部分真菌毒素已被證實(shí)具有致癌、致畸、致突變作用，對人類健康造成很大威脅[3?5]。中藥是我國醫(yī)藥學(xué)發(fā)展的民族瑰寶，隨著國際社會對中醫(yī)藥價(jià)值的普遍認(rèn)可，中藥材的質(zhì)量安全也備受關(guān)注。由于中藥材在種植、采集、加工、儲藏和運(yùn)輸過程中，諸多條件的變化如干燥不及時(shí)、貯存不當(dāng)、加工制備處理不善等均易使其受到真菌污染，產(chǎn)生有毒的真菌毒素，不僅使其功效成分受到影響，進(jìn)而可能影響中藥的質(zhì)量和療效，甚至還會對用藥者的健康造成一定的威脅[6?8]。尤其藥食同源中藥材由于其使用量及使用范圍更加廣泛，其質(zhì)量安全備受重視。隨著真菌毒素風(fēng)險(xiǎn)評估工作的深入，很多國家和地區(qū)開始對部分真菌毒素的含量進(jìn)行了強(qiáng)制性規(guī)定，并制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[9?13]。

目前，國內(nèi)外檢測真菌毒素的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法[14?16]、薄層色譜（TLC）法[17]、高效液相色譜（LC）法[18?21]、氣相色譜（GC）法[22]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）法[23]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[24?29]等。由于真菌毒素的種類較多，且藥食同源中藥材基質(zhì)比較復(fù)雜，同一樣品可能污染多種真菌毒素，因此，建立同時(shí)測定多種毒素且準(zhǔn)確可靠的方法非常必要，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測真菌毒素的技術(shù)日漸成熟，應(yīng)用廣泛，能夠滿足檢測需求。目前，大部分檢測方法主要針對單類型目標(biāo)物，而針對中藥材中多種真菌毒素同時(shí)檢測的方法SN/T 4604-2016適用范圍窄，且多功能免疫親和柱前處理操作復(fù)雜，定量方法采用外標(biāo)法[30?33]，不能滿足同時(shí)檢測復(fù)雜基質(zhì)中多組分目標(biāo)物的快速檢測要求。

本研究擬采用新型的多真菌毒素快速凈化柱，通過優(yōu)化液相色譜-質(zhì)譜條件，建立藥食同源中藥材中16種真菌毒素液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，以期建立能夠校正基質(zhì)效應(yīng)，選擇性好，靈敏度高，快捷、簡便、高效，適用于大批量樣品的快速測定方法。并擬采用該方法對采集的483份樣品進(jìn)行調(diào)查分析，為藥食同源中藥材中真菌毒素的安全風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥食同源中藥材，采集市售藥食同源樣品共483份，按種類分：果實(shí)種子類藥材340份，根及根莖類95份，動物類32份，藻菌類16份 均購自濟(jì)南市大型藥店；乙腈、甲醇、甲酸、氨水、乙酸 色譜純，德國Merck公司；試驗(yàn)用水 Millipore純水機(jī)制取超純水；標(biāo)準(zhǔn)品：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，

100.0 μg/mL）、雪腐鐮刀菌烯醇（NIV，100.1 μg/mL）、黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（AFB1：2.02 μg/mL、AFB2：0.500 μg/mL、AFG1：2.02 μg/mL、AFG2：

0.503 μg/mL）、HT-2毒素（HT-2，100.4 μg/mL）、T-2毒素（T-2，100.1 μg/mL）、伏馬毒素B1（FB1，50.0 μg/mL）、伏馬毒素B2（FB2，50.2 μg/mL）、伏馬毒素B3（FB3，50.2 μg/mL）、玉米赤霉烯酮（ZEN，100.0 μg/mL）、赭曲霉毒素A（OTA，10.04 μg/mL）、3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?-ADON，100.0 μg/mL）、15-乙?；撗跹└牭毒┐迹?5-ADON，100.1 μg/mL）、Fus X毒素（FuX，100.3 μg/mL）、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（13C15-DON，25.0 μg/mL）、13C15-雪腐鐮刀菌烯醇（13C15-NIV，25.12 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素B1（13C17-AFB1，0.501 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素 B2（13C17-AFB2，0.502 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素G1（13C17-AFG1，0.501 μg/mL）、13C17-黃曲霉毒素-G2（13C17-AFG2，0.501 μg/mL）、13C24-T-2毒素（13C24-T-2，25.2 μg/mL）、13C22-HT-2毒素（13C22-HT-2，25.5 μg/mL）、13C34-伏馬毒素B1（13C34-FB1，25.2 μg/mL）、13C34-伏馬毒素B2（13C34-FB2，10.10 μg/mL）、13C34-伏馬毒素B3（13C34-FB3，10.02 μg/mL）、13C18-玉米赤霉烯酮（13C18-ZEN，25.2 μg/mL）、13C20-赭 曲 霉 毒 素A（13C20-OTA，10.04 μg/mL）、13C17-3-乙?；撗跹└牭毒┐迹?3C17-3ADON，25.0 μg/mL）、13C17-15-乙?；撗跹└牭毒┐迹?3C17-15ADON，10.3 μg/mL） 均購自Romer Biopure公司。

Acquity UPLC I CLASS超高效液相色譜儀、XEVO-TQS串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）美國Waters公司；VORTEX GENIE2渦旋混勻器美國Scientific Industries公司；Millipore—Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；CR21N型高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；Multi Reax（EU）振蕩混勻器

德國heidolph公司，MycoSpinTM400多毒素凈化柱 美國Romer Labs公司；ZM 200超離心粉碎研磨儀 德國Retsch公司；KQ5200E超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用乙腈稀釋并定容，配制成DON、3-ADON、15-ADON、NIV、T-2、HT-2、ZEN、FuX濃度為2 μg/mL，AFB1、AFG1為0.8 μg/mL，AFB2、AFG2為0.2 μg/mL，F(xiàn)B1、FB2、FB3、OTA為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于添加回收實(shí)驗(yàn)和制備標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，?20 ℃避光條件下保存。

混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液配制：分別準(zhǔn)確移取各同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-水（10/90，V/V）溶液稀釋并定容至25.0 mL，配制成13C15-DON、13C15-NIV、13C18-ZEN、13C17-3ADON、13C17-15ADON濃 度 為250 ng/mL，13C17-AFB1、13C17-AFB2、13C17-AFG1、13C17-AFG2為 10.0 ng/mL，13C34-FB1、13C34-FB2、13C34-FB3、13C22-HT-2濃度為100 ng/mL，13C24-T-2為50 ng/mL，13C20-OTA濃度為20 ng/mL的內(nèi)標(biāo)混合溶液，?20 ℃避光條件下保存。

1.2.2 樣品前處理 分別將樣品用超離心粉碎研磨儀粉碎均勻（50目過篩），稱取2.0 g（精確至0.01 g）粉碎后樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈-水（50:50，V/V），渦旋混勻后，浸泡60 min，室溫下超聲提取30 min，10000 r/min室溫下離心5 min，吸取1.0 mL上清液，加入50 μL乙酸，再加100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混合均勻，將混合液倒入MycoSpinTM400多毒素凈化柱中，渦旋2 min，使溶液與凈化材料充分混勻，打開凈化柱底部出液口，置于配套收集管中，收集液于10000 r/min離心1 min，取上清液過0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測。

1.2.3 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm，美國Waters公司）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；ESI-模式：流動相A：0.2%氨水溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫程序：0 min，流動相B：2%；0～4.0 min，流動相B：2%～20%；4.0～5.5 min，流動相B：20%；5.5～5.6 min，流動相B：20%～100%；5.6～6.2 min，流動相B：100%；6.2～6.5 min，流動相B：100%～2%。ESI+模式：流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈+甲醇（50/50，V/V），梯度洗脫程序：0 min，流動相B：10%；0～1.0 min，流動相B：10%～30%；1.0～3.0 min，流動相B：30%～40%；3.0～5.0 min，流動相B：40%～70%；5.0～7.0 min，流動相B：70%；7.0～7.2 min，流動相B：70%～100%；7.2～7.7 min，流動相B：100%；7.7～8.0 min，流動相B：100%～10%。

1.2.4 質(zhì)譜條件 檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；ESI掃描方式為正、負(fù)離子掃描。離子源溫度為150 ℃，去溶劑氣溫度：400 ℃；錐孔反吹氣流速：150 L/h；去溶劑氣流速：800 L/h；ESI+模式下毛細(xì)管電壓為3.5 kV，ESI-模式下毛細(xì)管電壓為2.0 kV；16種真菌毒素及內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 16種真菌毒素及對應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)Table 1 Optimized mass spectrometry parameters of 16 mycotoxins and their corresponding isotopic internal standards

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線性關(guān)系、檢出限與定量限的考察 準(zhǔn)確吸取16種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用乙腈-水（10/90，V/V）溶液配制成系列梯度混合標(biāo)液（AFB1、AFG1為0.32、0.8、2、4、8、20、40、80 ng/mL；AFB2、AFG2為0.08、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 ng/mL；FB1、FB2、FB3、OTA為0.4、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100 ng/mL；其余毒素濃度為0.8、2.0、5.0、10、20、50、100、200 ng/mL），取1.0 mL混合標(biāo)液，加入50 μL乙酸，100 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻后過0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測。以不同濃度的各目標(biāo)物的峰面積與其內(nèi)標(biāo)峰面積比值對應(yīng)相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照三倍信噪比（3 S/N）計(jì)算檢出限，10倍信噪比（10 S/N）為定量限。

1.2.5.2 加標(biāo)回收率、精密度試驗(yàn) 選擇杏仁、山藥、雞內(nèi)金、茯苓4種基質(zhì)空白樣品，分別加入低、中、高三個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6次平行測定，按照1.2.2方法進(jìn)行前處理，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算三個(gè)加標(biāo)水平下的回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，應(yīng)用Waters Masslynx儀器配置工作站系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集處理，并使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將16種真菌毒素以及15種同位素內(nèi)標(biāo)分別用乙腈-水（10/90，V/V）稀釋配制成適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（50～100 ng/mL），用流動注射泵直接注入質(zhì)譜儀，根據(jù)各目標(biāo)化合物分子的化學(xué)電離性質(zhì)，DON、3-ADON、15-ADON、NIV、ZEN、FuX采用負(fù)離子模式，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、FB1、FB2、FB3、HT-2、T-2、OTA采用正離子模式，對各化合物及其內(nèi)標(biāo)的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。由于正負(fù)離子同時(shí)掃描會降低方法的靈敏度，本方法采用正、負(fù)離子檢測模式分別對目標(biāo)化合物進(jìn)行測定。

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

優(yōu)化質(zhì)譜條件后，進(jìn)行液相色譜分離條件的優(yōu)化。流動相的組成和配比會影響目標(biāo)化合物的色譜行為，以及其離子化效率和檢測靈敏度。經(jīng)查閱文獻(xiàn)以及根據(jù)各個(gè)化合物的分子結(jié)構(gòu)特征，本實(shí)驗(yàn)比較了甲酸、氨水等溶劑的加入情況及乙腈、甲醇流動相系統(tǒng)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在負(fù)離子模式下，流動相有機(jī)相采用乙腈，水相中加入0.2%氨水后，有利于化合物的離子化，并可以得到較高的檢測靈敏度和更好的分離度。故最終確定了乙腈-0.2%氨水作為流動相。在正離子模式下，流動相水相中加入0.1%甲酸，有機(jī)相采用甲醇-乙腈（1+1）條件下，各目標(biāo)化合物分離度和靈敏度均更好。并通過優(yōu)化梯度洗脫，各目標(biāo)化合物達(dá)到較好的分離，色譜峰峰形良好。圖1為16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液及其內(nèi)標(biāo)離子流圖。

圖1 16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液及其內(nèi)標(biāo)離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 16 mycotoxins standard solutions and their internal standards

2.3 樣品凈化條件的優(yōu)化

藥食同源中藥材基質(zhì)比較復(fù)雜，為了能夠更好的去除干擾物，降低基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)對樣品的凈化條件進(jìn)行了優(yōu)化，由于多毒素免疫親和柱前處理復(fù)雜，耗時(shí)較長，可測的毒素種類不能覆蓋待測的16種毒素，本實(shí)驗(yàn)以雞內(nèi)金提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液只針對Mycosep226凈化柱、Oasis HLB柱和MycoSpinTM400多毒素凈化柱進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖2所示。Mycosep226凈化柱和Oasis HLB柱凈化效果不理想，對ZEN、伏馬毒素等的回收率較低。因此本實(shí)驗(yàn)采用MycoSpinTM400多毒素凈化柱對樣品進(jìn)行凈化，可以降低藥食同源中藥材復(fù)雜基質(zhì)對毒素檢測的干擾，達(dá)到凈化效果。

圖2 不同凈化方式對回收率的影響Fig.2 Effect of different purification methods on recovery

2.4 定量方法的確定

應(yīng)用UPLC-MS/MS對復(fù)雜基質(zhì)樣品中目標(biāo)化合物進(jìn)行分析時(shí)，為了校正樣品凈化過程和離子化過程的損失以及減少基質(zhì)效應(yīng)，保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，通常采用基質(zhì)匹配溶液加標(biāo)法或空白溶劑內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量測定。由于藥食同源中藥材基質(zhì)多種多樣，而本文擬建立適用性更高的多種毒素同時(shí)測定的方法，因此，選擇應(yīng)用空白溶劑內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量檢測。在內(nèi)標(biāo)化合物的選擇上主要考慮目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)盡可能相似，除FuX外，本研究使用各個(gè)化合物的穩(wěn)定性同位素[13C]作為指示內(nèi)標(biāo)，由于FuX難以找到同位素內(nèi)標(biāo)，因此，使用性質(zhì)接近的13C15-DON作為其內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行檢測。

2.5 工作曲線和檢出限、定量限

本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下，用乙腈-水（10/90，V/V）溶液配制系列濃度的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液并分別進(jìn)行測定，以相應(yīng)真菌毒素的濃度為橫坐標(biāo)（X），目標(biāo)物的峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，各化合物呈良好的線性關(guān)系（R>0.998），線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2，并以3倍信噪比（3 S/N）和10倍信噪比（10 S/N）計(jì)算檢出限和定量限，各真菌毒素的檢出限在0.1～4.0 μg/kg之間，定量限為0.3～10.0 μg/kg。

表2 16種真菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges, detection limits and quantification limits of 16 mycotoxins

2.6 精密度與回收率試驗(yàn)

分別稱取一定質(zhì)量的不同基質(zhì)的空白樣品杏仁（果實(shí)種子類）、山藥（根及根莖類）、雞內(nèi)金（動物類）、茯苓（藻菌類），添加3個(gè)濃度水平真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理測定，每個(gè)添加水平平行測定6份，考察方法的回收率與重現(xiàn)性，結(jié)果見表3。不同基質(zhì)樣品16種真菌毒素的加標(biāo)回收率范圍為83.4%～102.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為2.08%～13.6%。說明方法回收率與精密度良好。

表3 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of test for precision and recovery(n=6)

2.7 實(shí)際樣品的檢測

利用已建立的方法，采集市售藥食同源樣品483份，包括果實(shí)種子類藥材340份，根及根莖類藥材95份，動物類藥材32份，藻菌類藥材16份，其中，陽性樣品中檢出各種真菌毒素的平均值及檢出率見表4，共檢出陽性樣品77份，檢出率15.9%，其中，果實(shí)種子類藥材檢出率為16.8%，動物類藥材檢出率34.4%，根及根莖類檢出率9.47%。檢出毒素種類最多的是薏苡仁，其中，一份薏苡仁樣品檢出6種毒素，兩份檢出5種毒素；其次是雞內(nèi)金，有六份樣品檢出4種毒素。毒素檢出率較高的藥材分別是枳椇子（4/4，檢出批次/總批次）、薏苡仁（10/11）、雞內(nèi)金（11/13）、大麥芽（7/14）和桃仁（4/9），其中，在枳椇子和雞內(nèi)金的陽性樣品中均檢出玉米赤霉烯酮（ZEN）。

表4 真菌毒素平均值及檢出率Table 4 Mean values and detection rates of mycotoxins

3 結(jié)論

本文建立了同位素標(biāo)記-超高效液相色譜/質(zhì)譜法檢測藥食同源中藥材中16種真菌毒素的檢測方法。通過優(yōu)化樣品前處理方法、色譜條件和質(zhì)譜條件，目標(biāo)化合物分離度及線性關(guān)系良好，而且方法操作簡單，準(zhǔn)確、可靠，適用于藥食同源中藥材中多真菌毒素的檢測，并利用此方法對市售483份藥材進(jìn)行了檢測，為藥食同源中藥材中真菌毒素污染狀況調(diào)查提供了數(shù)據(jù)支持。但是，由于具體到每種藥材的樣品數(shù)量較少，覆蓋面欠缺，為了研究具體藥材的污染情況，下一步需要針對具體的藥材加大采樣量，得到更加全面、有代表性的數(shù)據(jù)結(jié)果。