高衛(wèi)華 周學(xué)鋒 宋煒 宋夢

糖尿病腎病作為腎內(nèi)科常見的系統(tǒng)疾病，多發(fā)于糖尿病患者，主要受遺傳、高血糖造成的代謝異常等影響，是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因[1,2]。由于糖尿病腎病的發(fā)病機制較為復(fù)雜，且當前以控制血糖及血壓、飲食等綜合治療為主，因此，有效治療方式是當前醫(yī)學(xué)的重點難點[3]。氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等因素與糖尿病腎病的發(fā)病密切相關(guān)，炎性反與免疫系統(tǒng)激活在糖尿病腎病發(fā)病機制中相互影響，并促進糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展[4]。利拉魯肽在抑制胰高血糖素分泌方面具有重要的作用，廣泛用于治療2型糖尿病[5]，有研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可以抑制糖尿病腎病患者的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，改善胰島素的分泌[6]。楊青平等[7]研究顯示，利拉魯肽可以減緩高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷，起作用機制可能與下調(diào)Grem1 mRNA，上調(diào)Nephrin表達有關(guān)。miRNA在糖尿病腎病研究密切相關(guān)，如miR-15b-5p在高糖誘導(dǎo)的足細胞中表達下調(diào)，過表達miR-15b-5p可以減緩高糖誘導(dǎo)足細胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[8]。本研究通過體外培養(yǎng)足細胞MPC-5，探討利拉魯肽是否可以調(diào)控miR-15b-5p的表達影響高糖誘導(dǎo)足細胞的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和免疫功能。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 小鼠腎足細胞MPC-5購買于武漢華聯(lián)生物公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司；γ干擾素、葡萄糖購買于美國sigma公司；利拉魯肽注射液購買于中國諾和諾德制藥公司，國藥準字：J20160037，規(guī)格：3 ml/18 mg；anti-miR-NC、anti-miR-15b-5p購買于廣州銳博公司；LipofectamineTM2000試劑盒、RNA提取試劑盒購買于美國Invitrogen公司；MTT試劑盒購買于北京索萊寶公司；SOD試劑盒、MDA試劑盒購買于上海碧云天公司；TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-1β試劑盒購買于南京建成生物研究中心；TGF-β1抗體、IL-2抗體、GAPDH抗體購買于英國Abcam公司；HRP標記的IgG購買于武漢博士德公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購買于日本TaKaRa公司，引物購買于上海吉瑪公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 從超低溫冰箱內(nèi)取出MPC-5細胞，復(fù)蘇培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、γ干擾素(150 U/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)，在條件為33℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行增殖培養(yǎng)。觀察細胞的生長狀態(tài)，待細胞融合至85%時，更換培養(yǎng)基且不含γ干擾素，在條件為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育培養(yǎng)14 d。

1.3 細胞分組 實驗開始前24 h更換培養(yǎng)基(不含γ干擾素)，收集生長狀態(tài)良好的MPC-5細胞，調(diào)整密度后接種在96孔板內(nèi)，選擇5 mmol/L和30 mmol/L的葡萄糖處理細胞，記為對照(Con)組和高糖(HG)組；選擇利拉魯肽(Liraglutide)濃度10、50、100 nmol/L后加入30 mmol/L的葡萄糖處理細胞，記為利拉魯肽低、中、高劑量(HG+LIR-L、HG+LIR-M、HG+LIR-H)組。選擇100 nmol/L的利拉魯肽和30 mmol/L的葡萄糖處理細胞，記為高糖+利拉魯肽(HG+LIR)組；將anti-miR-NC、anti-miR-15b-5p按照LipofectamineTM2000試劑盒轉(zhuǎn)染至MPC-5細胞，然后經(jīng)過100 nmol/L的利拉魯肽和30 mmol/L的葡萄糖處理，記為高糖+利拉魯肽+anti-miR-NC、高糖+利拉魯肽+anti-miR-15b-5p(HG+LIR+anti-miR-NC、HG+LIR+anti-miR-15b-5p)組。

1.4 MTT檢測細胞活力 收集1.3各組MPC-5細胞，經(jīng)過胰酶消化培養(yǎng)后，接種至96孔細胞板內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)48 h，在每孔內(nèi)加入5 mg/ml (20 μl)的MTT溶液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心后再細胞的上清液內(nèi)加入150 μl的DMSO溶液，在酶標儀540 nm 波長處檢測各組細胞的OD值，計算細胞活力。

1.5 ELISA檢測SOD、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達 收集1.3各組MPC-5細胞，輕輕消化吹打后，在離心機上800 r/min離心10 min，然后繼續(xù)吹打破碎細胞，離心后收集上清液，通過檢測試劑盒說明書檢測SOD、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達。

1.6 Western blot檢測TGF-β1和IL-2蛋白表達 收集1.3各組MPC-5細胞，加入RIPA裂解液冰上裂解5 min，12 000×g離心15 min收集上清，經(jīng)過SDS-PAGE凝膠處理后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入50 g/L脫脂牛奶封閉培養(yǎng)1.5 h，加入TGF-β1 (1∶800)、IL-2 (1∶800)和GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育，次日加入HRP標記的山羊抗兔IgG (15 000)室溫下培養(yǎng)1.5 h，在暗室內(nèi)滴加電化學(xué)發(fā)光液顯影。經(jīng)過Image J軟件讀取蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白表達。

1.7 qRT-PCR檢測miR-15b-5p的表達 收集1.3各組MPC-5細胞參照RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，取5 μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照熒光定量試劑盒配置反應(yīng)體系，進行PCR擴增。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-15b-5p的表達。miR-15b-5p正向引物為：5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，反向引物為：5’-TGCTTAGCAGCACATCATG-3’；U6正向引物為：5’-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物為：5’-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3’。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽對MPC-5細胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響 與Con組相比，HG組的細胞活力、SOD活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表達顯著增加(P<0.05)；與HG組相比，HG+LIR-L組、HG+LIR-M組、HG+LIR-H組的細胞活力、SOD活性顯著增加(P<0.05)，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表達顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 利拉魯肽對MPC-5細胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響

2.2 利拉魯肽對MPC-5細胞免疫因子的影響 與Con組相比，HG組的TGF-β1、IL-2蛋白表達顯著增加(P<0.05)；與HG組相比，HG+LIR-L組、HG+LIR-M組、HG+LIR-H組的TGF-β1、IL-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 利拉魯肽對MPC-5細胞免疫因子的影響

表2 利拉魯肽對MPC-5細胞免疫因子的影響

2.3 利拉魯肽處理MPC-5細胞后miR-15b-5p表達 與Con組相比，HG組的miR-15b-5p表達顯著降低(P<0.05)；與HG組相比，HG+LIR-L組、HG+LIR-M組、HG+LIR-H組的miR-15b-5p表達顯著增加(P<0.05)。見表3。

表3 利拉魯肽處理MPC-5細胞后miR-15b-5p表達

2.4 利拉魯肽通過miR-15b-5p表達對MPC-5細胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響 與HG組相比，HG+LIR組的miR-15b-5p表達、細胞活力、SOD活性顯著增加(P<0.05)，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表達顯著降低(P<0.05)；與HG+LIR+anti-miR-NC組相比，HG+LIR+anti-miR-15b-5p的miR-15b-5p表達、細胞活力、SOD活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表達顯著增加(P<0.05)。見表4。

表4 利拉魯肽通過miR-15b-5p表達對MPC-5細胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響

2.5 利拉魯肽通過miR-15b-5p表達對MPC-5細胞免疫因子的影響 與HG組相比，HG+LIR組的TGF-β1、IL-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與HG+LIR+anti-miR-NC組相比，HG+LIR+anti-miR-15b-5p組TGF-β1、IL-2蛋白表達增加(P<0.05)。見圖2，表5。

表5 利拉魯肽通過miR-15b-5p表達對MPC-5細胞免疫因子的影響

圖2 利拉魯肽通過miR-15b-5p表達對MPC-5細胞免疫因子的影響

3 討論

在糖尿病患者早期腎體積異常增加，使腎小球濾過率增加，隨著病程時間的增長，出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿、腎小球濾過率降低等情況，進而引發(fā)為糖尿病腎病，也是糖尿病患者死亡率較高的原因之一[9]。足細胞在維持腎小球結(jié)構(gòu)和過濾屏障上具有重要作用，高糖誘導(dǎo)的足細胞炎性損傷是糖尿病腎病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。本研究通過高糖誘導(dǎo)足細胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖條件下細胞活力、SOD活性降低，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表達增加，TGF-β1蛋白表達、IL-2蛋白表達上調(diào)。利拉魯肽是新開發(fā)研究的胰高血糖素GLP-1類似物，具有降血糖和保護胰島素β細胞等作用；在治療2型糖尿病取得了一定的作用效果[11]。李婷等[12]研究顯示，利拉魯肽可以降低高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞的凋亡，促進細胞的活力，濃度越高且作用效果越明顯。王海芳等[13]研究顯示，利拉魯肽通過抑制HSP70-TLR4軸減緩高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠的腎小管炎性損傷。TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-2是一種多效細胞的促炎性因子，在細胞生長和免疫抑制中具有重要的作用，TGF-β1在TGF-β家族中含量最高，在腎小管、腎小球和腎間質(zhì)中廣泛存在，具有細胞免疫逃避的作用，增強機體的炎性反應(yīng)[14]。本研究結(jié)果顯示利拉魯肽各劑量組可以明顯促進細胞活力、SOD活性，抑制MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表達，TGF-β1蛋白表達、IL-2蛋白表達下調(diào)，這說明利拉魯肽可以抑制MPC-5細胞的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和免疫功能。

有研顯示，miRNA與糖尿病腎病足細胞損傷、纖維化等密切相關(guān)，miRNA可以通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達參與細胞的生長、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和細胞免疫等[15]。湯夏蓮等[16]研究顯示，高糖條件下miR-148b表達上調(diào)，抑制miR-148b可以減緩高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細胞的活力，促進細胞凋亡和免疫抑制因子TGF-β1表達。蘇征佳等[17]研究顯示，miRNA-146b-3p在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞中表達下調(diào)，利拉魯肽通過抑制miRNA-146b-3p改善內(nèi)皮細胞的炎性反應(yīng)。Su等[18]研究顯示，miR-218在高糖誘導(dǎo)的腎小管細胞中表達上調(diào)，miR-218通過下調(diào)GPRC5A減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管細胞的凋亡、炎性反應(yīng)。miR-485在高糖誘導(dǎo)腎小球膜細胞中表達下調(diào)，miR-485通過負調(diào)控NOX5促進高糖誘導(dǎo)腎小球膜細胞的增殖，抑制細胞的炎性反應(yīng)[19]。本研究顯示，高糖誘導(dǎo)MPC-5細胞后，miR-148b表達下調(diào)，經(jīng)過利拉魯肽處理后，miR-148b表達上調(diào)；利用敲低干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)抑制miR-148b可以逆轉(zhuǎn)利拉魯肽對高糖誘導(dǎo)足細胞活力、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和免疫因子的作用，說明拉魯肽通過miR-15b-5p表達發(fā)揮在糖尿病腎病中的作用。

綜上所述，利拉魯肽通過下調(diào)miR-15b-5p表達減緩高糖誘導(dǎo)的足細胞氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和免疫功能，旨在為糖尿病腎病的研究提供合理的支撐。