王傳 顧曉靜 史金英 夏靜榮 陳潔

呼吸系統(tǒng)感染性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，呼吸道感染是感染性疾病中最主要的部分[1]。我國耐藥形勢嚴(yán)峻，超級細(xì)菌頻繁現(xiàn)身。近20年來，流行性疫情頻發(fā)，近2年出現(xiàn)的全球新型冠狀病毒流行屬于肺部感染性疾病。肺部感染(pulmonary infection)是指包括終末氣道、肺泡腔及肺間質(zhì)在內(nèi)的肺實(shí)質(zhì)性炎癥，病因以感染最為常見。當(dāng)肺部感染的病原體診斷不夠明確時，尤其是重癥感染患者，如不能夠針對性地藥物治療，可能耽誤病情，導(dǎo)致治療不及時或甚至引起死亡[2,3]?？焖倬珳?zhǔn)診斷感染病原體是當(dāng)今亟待解決的臨床問題，感染性疾病病因診斷開始面臨巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的病原微生物學(xué)診斷手段已經(jīng)不能完全滿足臨床需要。與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)檢測方法相比，高通量測序技術(shù)能夠一次性檢測獲得樣品中可能感染的多種病原物基因組序列，對明確病原體具有獨(dú)特優(yōu)勢[4]。支氣管肺泡灌洗可以獲得氣管鏡所不能探及下呼吸道的細(xì)胞和溶質(zhì)，能更全面地反映肺部的整體情況[5]。肺泡灌洗液的內(nèi)容，細(xì)胞成份：淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，嗜酸等，非細(xì)胞成分：細(xì)胞因子，病毒，生物標(biāo)記物(蛋白、核酸)。本研究收集89例肺部感染患者，通過電子支氣管鏡獲取肺泡灌洗液，送檢高通量測序的結(jié)果及臨床資料，探討不同量的肺泡灌洗液高通量測序在肺部感染的病原學(xué)中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧 2016年7月至2018年10月石家莊市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科送檢北京中日醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行高通量基因測序的 89 例肺部感染患者的臨床資料，年齡18～80歲，平均年齡(62.5±8.9)歲，合并基礎(chǔ)疾病較多，以急性病程為主，影像學(xué)表現(xiàn)為單肺實(shí)變和雙肺多葉多段病變?yōu)橹鳌?/p>

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①18歲≤年齡≤80歲；②符合下呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，A發(fā)熱，體溫>38℃或<35.5℃(腋溫)；B至少符合一項：咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困難；C新的肺部浸潤性陰影(胸片或胸部CT)。符合C+A或C+B或C+B+A，主要包括社區(qū)獲得性肺炎(CAP)[7]、院內(nèi)獲得性肺炎(HAP)[10]、呼吸機(jī)相關(guān)肺炎(VAP)[11,12]、肺部基礎(chǔ)疾病合并感染(如慢阻肺、支氣管擴(kuò)張等)、免疫功能缺陷宿主下呼吸道感染等；③有支氣管肺泡灌洗檢查適應(yīng)癥?！对\斷性可彎曲支氣管鏡應(yīng)用指南(2008年版)》指南中規(guī)定支氣管鏡檢查的適應(yīng)證：免疫受損患者肺部感染的診斷，肺病感染細(xì)菌學(xué)檢測以及肺化膿癥沖洗引流治療?？梢酝ㄟ^支氣管鏡吸引、保護(hù)性標(biāo)本刷或支氣管肺泡灌洗(BAL)獲取標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)等[6]。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①已知的非下呼吸道感染性疾病引起的發(fā)熱和肺部陰影者，如肺部腫瘤，間質(zhì)性肺疾病，肺栓塞和其他非感染性肺浸潤；②支氣管檢查禁忌癥：按照《診斷性可彎曲支氣管鏡應(yīng)用指南(2008年版)》規(guī)定的支氣管檢查的禁忌癥：③已明確診斷結(jié)核感染，或研究者認(rèn)為不能入組的其他情況。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：肺泡灌洗液標(biāo)本采集[6]：灌洗部位，選擇病變?nèi)~段，出現(xiàn)新的進(jìn)展性的浸潤性病變的葉段；雙肺彌漫性感染者，選取右肺中葉或左肺舌段；將支氣管鏡頂端嵌頓在適當(dāng)?shù)闹夤軜浞种Ш?，注?7℃或室溫滅菌0.9%氯化鈉溶液，每次20或30 ml，總量分為60 ml組和120 ml組，回收率>30%，回收的灌洗液分為兩管裝入滅菌容器中，分別行高通量測序檢測和灌洗液培養(yǎng)。

1.3.2 肺泡灌洗液高通量測序：采集患者的肺泡灌洗液標(biāo)本，送檢北京中日友好醫(yī)院。(肺泡灌洗液隨機(jī)分為120 ml和60 ml組，肺泡灌洗液≥10 ml，快速低溫保存，室溫保存4 h；>4 h，應(yīng)4℃冰箱保存，冷鏈運(yùn)輸-20℃以下，對于肺泡灌洗液樣本的高通量測序程序包括核酸提取、文庫構(gòu)建、測序和信息分析)。同時部分肺泡灌洗液送檢我院檢驗(yàn)科病原學(xué)培養(yǎng)，記錄病原體的情況。

2 結(jié)果

2.1 不同量肺泡灌洗液高通量測序病原體檢測結(jié)果 89例肺泡灌洗液行高通量測序標(biāo)本，在運(yùn)輸過程中120 ml組2例側(cè)漏，60 ml組2例側(cè)漏，最終高通量測序檢測成功收集85例肺泡灌洗液標(biāo)本，結(jié)果檢出陽性病原體52例。其中陽性結(jié)果中單一病原學(xué)感染32例(細(xì)菌19例、病毒9例、真菌2例、結(jié)核2例，病毒9)。混合病原學(xué)感染19例(細(xì)菌合并細(xì)菌3例，細(xì)菌合并真菌2例，細(xì)菌合并病毒8例，細(xì)菌合并結(jié)核1例，病毒合并病毒1例，細(xì)菌、細(xì)菌合并病毒1例，細(xì)菌、病毒+病毒3)。見表1。

表1 不同量肺泡灌洗液高通量測序病原體檢測結(jié)果

2.2 支氣管鏡肺泡灌洗液培養(yǎng)結(jié)果 89例標(biāo)本中獲取陽性病原學(xué)為42例，其結(jié)果：單一病原學(xué)感染 36 例(細(xì)菌 14 例、病毒 1例、真菌 11例、結(jié)核3例)?；旌喜≡瓕W(xué)感染 6例細(xì)菌合并細(xì)菌1例，細(xì)菌合并真菌 2 例，細(xì)菌合并病毒 1 例。見表2。

表2 微生物室支氣管鏡肺泡灌洗液送檢病原學(xué)結(jié)果

2.3 不同量肺泡灌洗液高通量測序病原體檢測陽性率比較 不同量肺泡灌洗液分120 ml和60 ml獲取高通量測序結(jié)果(62.0%vs 60.0%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同量肺泡灌洗液高通量測序病原體檢測陽性率比較 例

2.4 肺泡灌洗液高通量病原學(xué)與肺泡灌洗常規(guī)培養(yǎng)病原學(xué)陽性率比較 85例肺泡灌洗檢高通量測序檢出陽性病原體52例，89例常規(guī)細(xì)菌微生物培養(yǎng)，檢出陽性病原體 42 例。肺泡灌洗液標(biāo)本中高通量病原體陽性率高于常規(guī)細(xì)菌微生物培養(yǎng) (61.1% vs 47.2%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 肺泡灌洗液高通量病原學(xué)與肺泡灌洗常規(guī)培養(yǎng)病原學(xué)陽性率比較 例

2.5 肺泡灌洗液高通量測序與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)單一病原學(xué)與混合病原學(xué)比較 肺泡灌洗液高通量測序檢測單一病原體檢出率與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)單一菌的檢出率(61.5%vs 85.7%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義意義(P>0.05)；肺泡灌洗液高通量測序檢測混合菌的陽性率明顯高于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)混合菌的檢出率(36.5%vs 14.2%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 肺泡灌洗液高通量測序與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)單一病原學(xué)與混合病原學(xué)比較 例

2.6 不同量肺泡灌洗液高通量測序單一病原體與混合病原體比較 不同量(120 ml和60 ml)肺泡灌洗液高通量測序單一病原體的檢出率(61.2%vs 61.9%)；差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同量肺泡灌洗液高通量測序混合病原體的檢出率(38.7%vs 38.1%)；差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 不同量肺泡灌洗液高通量測序單一病原體與混合病原體比較 例

3 討論

肺部感染是呼吸科常見的呼吸道感染性疾病，尤其是重癥肺炎患者、特殊菌感染患者，往往病原菌相對復(fù)雜，治療難度大大增加，易引起較為嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至死亡。對于早期獲得病原學(xué)，早期針對性應(yīng)用抗生素起到了至關(guān)重要的作用，目前傳統(tǒng)檢測方法陽性培養(yǎng)率偏低、檢測病原種少、檢測周期漫長，延誤患者的搶救時機(jī)，增加了臨床診療工作的難度。支氣管鏡肺泡灌洗技術(shù)能夠全面、準(zhǔn)確獲取下呼吸道感染的標(biāo)本，聯(lián)合高通量測序技術(shù)，能夠快速、精準(zhǔn)獲取病原學(xué)。

支氣管肺泡灌洗是經(jīng)支氣管鏡向支氣管肺泡注入0.9%氯化鈉溶液并隨即抽吸、收集肺泡表面襯液，檢查其細(xì)胞成分和可溶性物質(zhì)的一種方法。2018 年版《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南》(下稱指南)指出：臨床宏基因組學(xué)能夠顯著提高病原檢測的敏感度，縮短檢測時間，對罕見病原菌感染的診斷具有優(yōu)勢[3]。肺泡灌洗液聯(lián)合臨床宏基因組檢測最能有效檢測出現(xiàn)肺病的病原體，臨床宏基因組測序是一種對臨床樣本中所有核酸進(jìn)行測序，然后從中尋找可能病原體的方法。病原微生物宏基因組學(xué)二代測序(next generation sequencing,NGS)，在盡可能保證樣本中所有核酸都被無差別提取出來前提下，具有快速獲得病原體種類甚至耐藥信息的能力，可覆蓋細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等主要感染病原體，讓感染性疾病的診斷邁向更為廣闊空間，也為疑難危重感染快速精準(zhǔn)診斷提供了新希望。尤其是在呼吸科，電子支氣管鏡肺泡灌洗技術(shù)應(yīng)用臨床多年，可以獲取下呼吸道標(biāo)本，更能準(zhǔn)確的反應(yīng)肺病感染的病原體譜。

本研究表明：在肺泡灌洗液60 ml或120 ml 0.9%氯化鈉溶液時所回吸收標(biāo)本的檢測結(jié)果無差異，對于肺病感染性疾病患者，基于查找病原體為目的，又要防止在灌洗過程中感染的擴(kuò)散，研究認(rèn)為采用60～120 ml的灌洗量，且分次灌洗是比較好的方法。對于快速獲取病原學(xué)，針對性應(yīng)用抗生素，患者受益頗菲，可以降低抗生素的使用率、使用強(qiáng)度，減少患者住院天數(shù)，減少患者死亡率。基于不同量的肺泡灌洗液都獲取病原學(xué)陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異，更說明高通量測序的重要性。雖然高通測序在肺病感染性疾病中獲取病原學(xué)的陽性率明顯提高，但是其本身也有自身的局限性。建議對于在核酸提取過程中破壁困難的微生物，如分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌 (主要包括曲霉菌、毛霉菌、隱球菌屬與雙相真菌) 等，即使在檢測報告中讀長數(shù)較低，也要考慮其為致病微生物的可能，并采用其他方法驗(yàn)證，如特異引物的PCR 或一代測序等分子生物學(xué)檢測，G試驗(yàn)，GM試驗(yàn)，曲霉菌IgG抗體或隱球菌莢膜多糖抗原等血清學(xué)試驗(yàn)。其次對于不同檢測平臺而言，病原體微生物數(shù)據(jù)譜不同，其結(jié)果也不盡相同，也可能會導(dǎo)致一些罕見病原體難以測出。本研究中主要針對肺部感染患者的肺泡灌洗液高通量測序結(jié)果進(jìn)行分析，60 ml 和120 ml的肺泡灌洗液高通量測序均可取得同樣的病原學(xué)陽性結(jié)果。但是對于重癥感染患者要根據(jù)患者SPO2、心率、血壓等情況，盡量縮短支氣管鏡檢查的時間，防止出現(xiàn)呼吸衰竭加重。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高通量測序診斷混合病原體感染的敏感性為 97.2%，特異性為 63.2%，提示高通量測序是檢測混合性肺部感染病原體的有效方法。對于兩種以上混合菌感染，微生物鏡檢和培養(yǎng)技術(shù)要求高，本身缺乏特異性，存在早期診斷率低的特點(diǎn)，而高通量測序檢測針對混合菌感染的陽性率明顯高于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)，根據(jù)病原體調(diào)整治療方案后患者臨床癥狀明顯改善，降低抗生素的使用率、使用強(qiáng)度，降低患者死亡率。而本研究中 1 例肺隱球菌病，1 例奴卡菌，前者高通量測序可快速檢測出，后者傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)結(jié)果為隱球菌、奴卡菌。因此對于罕見菌感染，高通量測序檢測明顯高于細(xì)菌培養(yǎng)的檢出率和檢出時間。

另外，本研究中 89 例患者中有 10 例患者改變了治療策略，肺病感染患者常規(guī)經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療方案能夠覆蓋大部分可能的病原菌，首先為經(jīng)驗(yàn)性治療，其次為精準(zhǔn)治療。支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)，一般都是在應(yīng)用抗生素之后，獲取病原學(xué)，NGS技術(shù)受抗生素影響較小。NGS可指導(dǎo)抗菌藥物的使用，可明顯改善重癥肺炎患者的病死率。對于肺泡灌洗液高通量測序結(jié)果判讀不同：如同等條件下 (相同微生物，相同標(biāo)本)，如某一微生物檢出的讀長數(shù)量多，為致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因組大小不同 (寄生蟲>真菌>細(xì)菌>病毒)，核酸提取效率存在差異 [難易程度:病毒<革蘭陰性菌<革蘭陽性菌 (不包括分枝桿菌、需氧放線菌等) <真菌]，致病力也相去甚遠(yuǎn)，因此不能僅僅依靠讀長多少來判斷是否感染，建議同時考慮病原微生物種類差異與致病特性。由具有一定生物信息學(xué)知識，并從事臨床感染或臨床微生物等專業(yè)人員，結(jié)合患者臨床背景、影像學(xué)資料、及其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，綜合判斷。

總之，不同量肺泡灌洗液進(jìn)行高通量測序?qū)Ψ尾扛腥拘约膊～@取病原體方面較為敏感、診斷準(zhǔn)確，可提高陽性率，尤其是對于耐藥細(xì)菌、混合菌及少見、罕見菌、病毒感染等。采用60～120 ml的灌洗量，且分次灌洗較好，肺泡灌洗時可以考慮患者一般情況、氧合指數(shù)、影像學(xué)及患者耐受情況而決定。對于臨床微生物標(biāo)本培養(yǎng)陰性、經(jīng)過抗感染治療影像學(xué)吸收不良的人群針對性地進(jìn)行肺泡灌洗液的高通量測序更有價值，對指導(dǎo)經(jīng)驗(yàn)性用藥之外的抗生素調(diào)整有重要價值。