楊丹芬 謝圓媛 康睿

支氣管哮喘是危害人類生命健康的慢性呼吸道疾病，具有較高的發(fā)病率[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，氣道重構(gòu)是導(dǎo)致哮喘患者肺功能下降及哮喘癥狀反復(fù)發(fā)作的主要原因之一[2]。探尋氣道重構(gòu)及控制氣道纖維化改變進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制，也是目前臨床研究的重點(diǎn)任務(wù)之一[3]。大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，氣道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能改變是引起氣道重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]，且氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)-轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchyme-transdifferentiation，EMT)進(jìn)程也被認(rèn)為是哮喘患者氣道重構(gòu)及纖維化發(fā)生演變的重要機(jī)制[5]。但氣道上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程的分子生物學(xué)機(jī)制還不甚明確。近來研究發(fā)現(xiàn)，加速纖維肉瘤蛋白(rapidly accelerate fibrosarcoma protein，Raf)/絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen activated extracellular signal regulated kinase，MEK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及分化過程[6]，且能調(diào)控多種通路與大腸、腎小管、甲狀腺等多種組織上皮細(xì)胞及癌細(xì)胞EMT進(jìn)程[7]。但Raf/MEK/ERK通路在支氣管哮喘氣道上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制，研究較少。另外，又有研究報(bào)道，血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)在支氣管哮喘患者血清中分泌較高，且與患者氣道炎癥及氣道重構(gòu)關(guān)系密切[8]，但Ang Ⅱ調(diào)控氣道重構(gòu)的具體機(jī)制還不甚明確。研究證實(shí)，Ang Ⅱ能通過Raf/ERK通路影響并促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[9]，且能介導(dǎo)肝癌上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程[10]。Ang Ⅱ能否通過Raf/MEK/ERK途徑介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程，參與支氣管哮喘氣道重構(gòu)過程，筆者還未見報(bào)道。本研究體外培養(yǎng)并以血小板源生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞，給予Ang Ⅱ處理，探究其轉(zhuǎn)分化過程的分子機(jī)制，以期闡明Ang Ⅱ在支氣管哮喘氣道重構(gòu)過程的調(diào)節(jié)機(jī)制，為支氣管哮喘的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑與儀器 人氣道上皮細(xì)胞株16 HBE(購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰?，貨號(hào)：KLH1041)；血管緊張素Ⅱ(購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)：JKLN002722，規(guī)格：10 mg)；重組人血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)(購(gòu)自美國(guó)sigma公司，凍干粉，臨用前用無菌去離子水溶解，貨號(hào)：BRP145，規(guī)格：50 μg)；Raf/MEK/ERK通路抑制劑(索拉菲尼，sorafenib)(購(gòu)自美國(guó)selleck公司，貨號(hào)：S1040，規(guī)格：10 mg)；兔抗人E-粘鈣素(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)、纖維連接蛋白(FN)、膠原蛋白Ⅳ(ColⅣ)、Raf、MEK1及磷酸化MEK(p-MEK1)、ERK1及磷酸化ERK1(p-ERK1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)等抗體(均購(gòu)自美國(guó)abcam公司，貨號(hào)：ab407720、ab108424、ab92547、ab174833、ab34710、ab200653、ab32091、ab96379、ab32537、ab131438、ab215715)；倒置顯微鏡(購(gòu)自日本奧林巴斯，型號(hào)：CKX53)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):16-HBE人氣道上皮細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于恒溫培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～80%時(shí)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代計(jì)數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞分組處理:取生長(zhǎng)到70%～80%的細(xì)胞，消化傳代后，按1×105個(gè)/孔密度接種于六孔板中，進(jìn)行以下分組處理：(1)分為對(duì)照組、PDGF[11]不同濃度刺激組(5、25、50、100、200 ng/L)，24 h后，用免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞中vimentin陽(yáng)性表達(dá)水平，篩選出PDGF合適濃度。(2)分為正常對(duì)照組、PDGF誘導(dǎo)組(100 ng/L)、Ang Ⅱ[12]不同濃度組(10-7、10-6、10-5mol/L)組，各組均培養(yǎng)24 h后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞EMT形態(tài)，并用WB法檢測(cè)EMT間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及Raf/MEK/ERK通路蛋白表達(dá)。(3)分為正常對(duì)照組、PDGF誘導(dǎo)組、Ang Ⅱ組(10-6mol/L)、Raf/MEK/ERK通路抑制劑(sorafenib)[9]組(10 μmol/L)、Ang Ⅱ+sorafenib(10-6mol/L+10 μmol/L)組，各組均培養(yǎng)24 h后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞EMT形態(tài)，并用WB法檢測(cè)Raf/MEK/ERK通路蛋白表達(dá)。

1.2.3 免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞vimentin陽(yáng)性表達(dá)水平:取細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[13]加入丙酮固定、 0.5% 曲拉通(Triton X-100)室溫透化、5% 牛蛋白血清封閉后，加入vimentin一抗抗體(1∶50)孵育過夜，再用Alexa Fluor594紅色熒光標(biāo)記的羊抗兔 IgG二抗孵育，用DAPI避光染核，防猝滅液封片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照，隨機(jī)選6個(gè)，對(duì)vimentin陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài):取各組細(xì)胞，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、vimentin、FN、ColⅣ、Raf、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)水平:取各組細(xì)胞，吸干培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液反復(fù)清洗后，用蛋白裂解液裂解于冰上裂解20 min后，在4℃、1 000 r/min、10 min條件下離心并取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取50 μg蛋白樣品行上樣及電泳分離后，加入一抗(E-cadherin、α-SMA、vimentin、FN、ColⅣ、Raf、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、TGF-β1抗體，稀釋倍數(shù)均為1∶1 000，抗體GAPDH(內(nèi)參)1∶2 000]，于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，加入二抗HRP(1∶3 000)孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯影后成像并用分析系統(tǒng)下拍照、分析灰度值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PDGF對(duì)人氣道上皮細(xì)胞vimentin表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，隨著PDGF濃度升高，vimentin紅色熒光在胞漿著色逐漸增加，細(xì)胞vimentin陽(yáng)性表達(dá)升高，并在100～200 ng/L時(shí)上升至穩(wěn)定水平，其中PDGF濃度25、50、100、200 ng/L時(shí)vimentin陽(yáng)性表達(dá)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PDGF濃度100 ng/L與200 ng/L比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，選用PDGF濃度為100 ng/L為誘導(dǎo)濃度。見表1。

表1 PDGF處理后6組vimentin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比較

2.2 Ang Ⅱ不同濃度處理后對(duì)細(xì)胞EMT形態(tài)變化的影響 倒置顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組細(xì)胞呈鋪路石樣狀態(tài)，細(xì)胞間緊密連接且稍凸起。PDGF誘導(dǎo)組細(xì)胞間連接減少，排列不規(guī)則，細(xì)胞肥大、呈長(zhǎng)梭形、星形或多角形樣類似成纖維細(xì)胞樣形態(tài)改變。隨著Ang Ⅱ濃度升高，細(xì)胞肥大、呈長(zhǎng)梭形、星形或多角形樣改變進(jìn)一步加重，且Ang Ⅱ濃度10-6mol/L與10-5mol/L濃度細(xì)胞形態(tài)向接近。見圖1。

2.3 Ang Ⅱ不同濃度處理后對(duì)細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、vimentin、FN、ColⅣ蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，PDGF誘導(dǎo)組E-cadherin表達(dá)降低，α-SMA、vimentin、FN、ColⅣ蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與PDGF誘導(dǎo)組比較，Ang Ⅱ不同濃度處理組E-cadherin表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)，α-SMA、vimentin、FN、ColⅣ蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)，且Ang Ⅱ濃度10-6mol/L組及10-5mol/L濃度組上述指標(biāo)變化優(yōu)于10-7mol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ang Ⅱ濃度10-6mol/L組與10-5mol/L濃度組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖2。

表2 5組細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、vimentin、FN、ColⅣ蛋白表達(dá)水平比較

圖2 5組細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、vimentin、FN、ColⅣ蛋白表達(dá)免疫印跡；A 正常對(duì)照組；B PDGF誘導(dǎo)組；C Ang Ⅱ濃度10-7mol/L組；D Ang Ⅱ濃度10-6mol/L組；E Ang Ⅱ濃度10-5mol/L組

2.4 Ang Ⅱ不同濃度處理后對(duì)細(xì)胞Raf/MEK/ERK通路蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，PDGF誘導(dǎo)組Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、TGF-β1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與PDGF誘導(dǎo)組比較，Ang Ⅱ不同濃度處理組Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、TGF-β1蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)，且Ang Ⅱ濃度10-6mol/L組及10-5mol/L濃度組上述指標(biāo)變化優(yōu)于10-7mol/L組，Ang Ⅱ濃度10-6mol/L組與10-5mol/L濃度組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3，表3。

圖3 5組細(xì)胞Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、TGF-β1蛋白表達(dá)免疫印跡；A 正常對(duì)照組；B PDGF誘導(dǎo)組；C Ang Ⅱ濃度10-7mol/L組；D Ang Ⅱ濃度10-6mol/L組；E Ang Ⅱ濃度10-5mol/L組

表3 5組細(xì)胞Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較

2.5 Ang Ⅱ與sorafenib聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞EMT形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組細(xì)胞呈鋪路石樣狀態(tài)且細(xì)胞間緊密連接較好。PDGF誘導(dǎo)組細(xì)胞間連接減少，細(xì)胞肥大、呈長(zhǎng)梭形、星形或多角形樣改變較多。與PDGF誘導(dǎo)組比較，Ang Ⅱ組細(xì)胞肥大、呈長(zhǎng)梭形、星形或多角形樣改變進(jìn)一步加重，sorafenib組細(xì)胞長(zhǎng)梭形、星形或多角形樣改變減少，鋪路石樣改變較多，細(xì)胞間緊密連接較好。Ang Ⅱ+Sorafenib組細(xì)胞肥大、呈長(zhǎng)梭形、星形或多角形樣改變與PDGF誘導(dǎo)組接近，較Ang Ⅱ組加重。見圖4。

2.6 Ang Ⅱ與sorafenib聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞Raf/MEK/ERK通路蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，PDGF誘導(dǎo)組Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、TGF-β1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與PDGF誘導(dǎo)組比較，Ang Ⅱ組Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、TGF-β1蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)，sorafenib組Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、TGF-β1蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ang Ⅱ+Sorafenib組上述指標(biāo)變化與Ang Ⅱ組相反，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖5。

表4 5組細(xì)胞Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較

圖5 5組細(xì)胞Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、TGF-β1蛋白表達(dá)免疫印跡；A 正常對(duì)照組；B PDGF誘導(dǎo)組；C Ang Ⅱ濃度10-7mol/L組；D Ang Ⅱ濃度10-6mol/L組；E Ang Ⅱ濃度10-5mol/L組

3 討論

據(jù)世界流行病學(xué)分析，預(yù)計(jì)到2025年全世界支氣管哮喘患者將達(dá)3億[1]。支氣管哮喘病因及發(fā)病機(jī)制一直是醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)，而氣道重構(gòu)被認(rèn)為是引起支氣管哮喘患者通氣功能障礙、氣道反應(yīng)性增高及哮喘癥狀控制不佳的重要原因[2]。探索支氣管哮喘的病理改變機(jī)制，是目前哮喘防治的重要方向。

研究證實(shí)，哮喘患者氣道損傷修復(fù)過程中，氣道上皮細(xì)胞EMT過程與氣道重構(gòu)關(guān)系密切。魏盼等[14]結(jié)合前人研究發(fā)現(xiàn)作為氣道第一屏障的上皮細(xì)胞，可分泌多種因子如TGF-β1，并通過多種信號(hào)通路誘發(fā)EMT，引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積、上皮纖維化、平滑肌增生與遷移等導(dǎo)致氣道壁結(jié)構(gòu)增厚，參與哮喘氣道重構(gòu)過程。Zou等[15,16]發(fā)現(xiàn)氣道上皮、平滑肌等多種細(xì)胞均可分泌PDGF等細(xì)胞因子，并引起氣道上皮細(xì)胞EMT及遷移、氣道膠原合成、氣道壁增厚，加重哮喘的發(fā)作，并認(rèn)為PDGF是介導(dǎo)哮喘氣道重構(gòu)的免疫調(diào)節(jié)因子。本研究用不同濃度PDGF誘導(dǎo)培養(yǎng)人正常氣道上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨著PDGF濃度升高，EMT標(biāo)志物vimentin陽(yáng)性表達(dá)顯著升高，并在100～200 ng/L時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，且與正常氣道上皮細(xì)胞比較，100 ng/L濃度的PDGF誘導(dǎo)組細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則、肥大、梭形等成纖維細(xì)胞樣改變，提示PDGF可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程。另外研究證實(shí)，細(xì)胞EMT過程中會(huì)由上皮表型細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維間質(zhì)細(xì)胞樣(特征為E-cadherin表達(dá)降低，α-SMA、vimentin表達(dá)升高，F(xiàn)N及ColⅣ沉積增加)[17]。本研究也檢測(cè)到PDGF誘導(dǎo)組出現(xiàn)E-cadherin表達(dá)降低，α-SMA及vimentin表達(dá)升高、FN及ColⅣ沉積增加，進(jìn)一步證實(shí)PDGF誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞EMT模型造模成功。

近來研究報(bào)道，Ang Ⅱ在支氣管哮喘氣道重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。Magalhaes等[8,18]發(fā)現(xiàn)在支氣管哮喘患者血清中Ang Ⅱ呈異常高表達(dá)水平，并認(rèn)為Ang Ⅱ高表達(dá)與哮喘氣道高反應(yīng)狀態(tài)及氣道重構(gòu)有一定的相關(guān)性。另外，Ang Ⅱ也與腎、肝、肺等組織上皮細(xì)胞EMT關(guān)系密切。陳毅華等[10,19]證實(shí)Ang Ⅱ可誘導(dǎo)肝及腎上皮細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)分化進(jìn)程。本研究用不同濃度的Ang Ⅱ干預(yù)培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)，隨著Ang Ⅱ濃度升高，細(xì)胞不規(guī)則、肥大、梭形等成纖維細(xì)胞樣改變進(jìn)一步加重，E-cadherin表達(dá)進(jìn)一步降低，α-SMA及vimentin表達(dá)、FN及ColⅣ沉積進(jìn)一步增加，提示Ang Ⅱ升高也可促進(jìn)人氣道上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程，這可能為Ang Ⅱ參與支氣管哮喘患者氣道重構(gòu)的可能機(jī)制之一。

TGF-β1被認(rèn)為是誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)分化的經(jīng)典通路之一[14]。Itoigawa等[20]證實(shí)TGF-β1可通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(Smad)等信號(hào)通路激活EMT相關(guān)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin、α-SMA等轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，促進(jìn)哮喘患者氣道重構(gòu)過程。Rudzka等[21,22]證實(shí)MAPK可通過Raf即MAPK激酶的激酶(MAPKKK)、MEK、ERK完成三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞增殖凋亡，且TGF-β1刺激胞膜并與胞膜受體結(jié)合后，能夠引起Ras/MEK/ERK相繼激活介導(dǎo)Smad3/α-SMA通路的纖維化進(jìn)程，預(yù)示TGF-β1介導(dǎo)EMT及氣道重構(gòu)的過程可能離不開Ras/MEK/ERK通路參與。本研究在PDGF誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞EMT過程中，發(fā)現(xiàn)TGF-β1升高的同時(shí)，伴隨著Ras、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK表達(dá)的升高，而用sorafenib抑制Raf/MEK/ERK通路活化后，隨著Ras、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK表達(dá)的降低，TGF-β1表達(dá)也隨之降低，且EMT相關(guān)標(biāo)志物α-SMA及vimentin表達(dá)、FN及ColⅣ沉積表達(dá)也顯著降低，細(xì)胞不規(guī)則、肥大、梭形等成纖維細(xì)胞樣形態(tài)改變也隨之減輕，證實(shí)Raf/MEK/ERK通路活化可能是TGF-β1介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞EMT及氣道重構(gòu)過程中的關(guān)鍵通路，阻斷Raf/MEK/ERK通路活化可抑制氣道上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程。本研究還觀察到Ang Ⅱ可進(jìn)一步促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程及Raf/MEK/ERK通路進(jìn)一步活化，這一作用可被Raf/MEK/ERK通路抑制劑sorafenib逆轉(zhuǎn)，提示Ang Ⅱ可能通過促進(jìn)Raf/MEK/ERK通路活化，促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞EMT。

綜上所述，Ang Ⅱ可通過激活Raf/MEK/ERK通路表達(dá)，促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞EMT，可能為闡明哮喘患者氣道重構(gòu)的分子生物學(xué)機(jī)制提供一定理論依據(jù)，但氣道上皮細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)分化及氣道重構(gòu)的分子機(jī)制復(fù)雜且途徑較多，有待進(jìn)一步探究。