宋洪濤，武忠，賽音朝克圖，羅彤，趙俊

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010065；3. 北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，北京 100029）

抑郁癥作為一種情緒障礙疾病，多表現(xiàn)為情緒改變、興趣低下、自卑感、不愿與他人交流及自殺傾向。研究證實，大腦各個區(qū)域的5-羥色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）水平的降低與抑郁癥的發(fā)生具有相關性[1-2]。臨床上多種抗抑郁藥的作用機制多基于抑郁癥的單胺假說，但是三分之一的患者對常規(guī)藥物療法沒有明顯效果[3]，因此有必要進一步闡明抑郁癥的生物學機制。近年來，學者發(fā)現(xiàn)犬尿氨酸途徑代謝異常在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著作用[4-5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，犬尿氨酸代謝分為兩個主要途徑，一方面，犬尿氨酸被犬尿氨酸轉(zhuǎn)氧酶（kynurenine aminotransferase, KAT）催化生成犬尿喹啉酸（kynurenic acid, KYNA），KYNA具有神經(jīng)保護作用；另一方面，犬尿氨酸在犬尿氨酸-3- 單加氧酶（kynurenine-3-monooxygenase,KMO）、3-羥基鄰氨基苯甲酸3，4-雙加氧酶（3-hydroxyanthranilate 3,4-dioxygenase, 3-HAO）的作用下轉(zhuǎn)換為喹啉酸（quinolinic acid, QUIN），QUIN 可引起神經(jīng)元的損害。具有神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護作用的代謝物含量之間的不平衡可能是抑郁癥的主要驅(qū)動因素。本次研究采用普遍認可的慢性溫和不可預知性應激刺激結(jié)合孤養(yǎng)方法復制大鼠抑郁模型，基于犬尿氨酸途徑探討抑郁癥的發(fā)病機制，以明確電針在治療抑郁癥中的生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級雄性SD 大鼠，體重（200±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006]。購進大鼠后實驗室飼養(yǎng)1 周，使其適應實驗室環(huán)境，通過敞箱試驗進行行為學評分，剔除不符合實驗要求的大鼠（行為靜止或過于活躍）。選取24 只大鼠，按照隨機數(shù)字表法分成空白組、模型組、氟西汀組、電針組，每組6 只。

1.2 儀器與試劑

7500 Real-Time PCR 儀、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國Bio-Rad 公司），數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（中國BINTA公司），Image-Pro Plus Analysis Soft ware 計算機圖像分析儀（美國Bio-Rad 公司），低溫高速離心機（美國Thermo Scientific 公司），電子天平BS224S（德國Sartouris 公司），核酸紫外分光光度計（德國Biophotometer 公司），LH202 型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)有限公司）。QUIN ELISA 試劑盒（貨號：L190408618）購自北京奇景融生物技術(shù)有限公司，KYNA ELISA 試劑盒（貨號：L190408621）購自北京奇景融生物技術(shù)有限公司。

1.3 慢性應激抑郁模型的復制

采用慢性溫和不可預知性應激結(jié)合孤養(yǎng)的方式進行抑郁模型復制[6-7]。應激刺激方法：24 h 禁食、禁水，5 min 4℃冰水游泳，24 h 潮濕環(huán)境、晝夜顛倒，3 min 夾尾（距離尾尖2 cm），3 h 束縛。模型復制共進行21 d，按照隨機抽簽順序，保證每種應激平均應用3 次，每天應用1 種應激方式。

1.4 各組大鼠干預方法

空白組：正常群養(yǎng)，不采取任何干預措施；模型組：單籠孤養(yǎng)結(jié)合模型復制應激；氟西汀組：單籠孤養(yǎng)結(jié)合模型復制應激，應激前1 h 予灌胃給藥（鹽酸氟西汀以生理鹽水配制成1 mg/mL 濃度，2 mg/kg 給藥）；電針組：單籠孤養(yǎng)結(jié)合模型復制應激，應激前1 h予電針百會穴和印堂穴（頻率為2 Hz，電流強度為1 mA，20 min/次，1 次/d）。

1.5 開野試驗

對各組大鼠進行行為學檢測，箱體規(guī)格為80 cm×80 cm×40 cm，箱體內(nèi)部均涂成黑色，箱底用白線劃分成25 個等邊方格。檢測時，捏提大鼠尾端，待大鼠情緒穩(wěn)定后，輕置于中心方格內(nèi)，統(tǒng)計5 min 內(nèi)大鼠穿過等邊方格的次數(shù)（水平運動次數(shù)）和大鼠后肢直立次數(shù)（垂直運動次數(shù)），開野試驗[8]分別在實驗前1 天以及實驗第22 天各進行1 次。

1.6 標本制備及檢測方法

1.6.1 大鼠海馬KYNA、QUIN 含量檢測各組大鼠腹腔注射麻醉（10%水合氯醛，380 mg/kg），迅速斷頭，在超凈臺冰上剝離取海馬組織，放入滅菌離心管中，置入-80℃保存。嚴格按照試ELISA 劑盒說明書對大鼠海馬區(qū)KYNA、QUIN 進行檢測。

1.6.2 qRT-PCR 檢測大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA 相對表達量取20 mg海馬組織，置于加入液氮的研缽中快速研磨，將粉末裝入EP 管；加入1 mL Trizol 液，用槍頭吹打混勻，室溫放置5 min；以1∶1 Trizol 液的比例加入氯仿，搖蕩離心管15 s，室溫放置2～3 min；4℃12 000 r/min離心15 min，取上層水，按1∶2 Trizol 液的比例加入異丙醇，室溫放置20 min；4℃12 000 r/min 離心10 min，棄上清，按1∶1 Trizol 液的比例加入75%乙醇（DEPC配制）；4℃7 500 r/min 離心5 min，棄上清，室溫干燥3 min；DEPC 水溶解沉淀得總RNA；通過核酸紫外光譜法測定RNA 濃度，在20 μL 系統(tǒng)中將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。配制逆轉(zhuǎn)錄體系：RNA 5 μL、Oligo（dT）2 μL、ddH2O（DEPC 處理） 4.5 μL，首先70℃孵育5 min，然后迅速放在冰上。5×Buffer 5 μL、dNTP（10 mmol）2 μL、Ribonuclease inhibitor 0.5 μL、MMLV RT 1 μL。42℃孵育60 min，然后70℃10 min；用所得的cDNA 構(gòu)建qRT-PCR 體系：cDNA 2 μL、引物1（10 pmol/μL）0.5 μL、引物2 （10 pmol/μL）0.5 μL、SYBR mix 10 μL、dd H2O 7 μL。擴增反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸10 min，共40 個循環(huán)。繪制熔解曲線，采用相對定量2-ΔΔCt法分析結(jié)果。KMO 引物：正向5'-TCCCTTCCACCTGAAGTCAC-3'，反向5'-AGTCTTCA AAGCCCGCATTC-3'；3-HAO 引物：正向5'-AGGTGA CAATGGGAGGACAG-3'，反向5'-TTACAGGCAGGGT CTTGTGT-3'。KAT 引物：正向5'-GCCTTGTTCACAG CCTTTCA-3'，反向5'-ACCTCCAGCCATCATTGTCA-3'；GAPDH 引物：正向5′-CAACTCCCTCAAGATTGT CAGCAA-3′,反向5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。采用2-ΔΔCt法計算KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠抑郁行為學變化

模型組大鼠應激前的水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)與應激后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組、氟西汀組、電針組大鼠應激前的水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)與應激后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；應激前4 組大鼠水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；應激刺激21 d 后4 組大鼠水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組大鼠的水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)較空白組減少（P＜0.05），氟西汀組、電針組大鼠的水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)較模型組升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠開野試驗水平運動及垂直運動次數(shù)比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠開野試驗水平運動及垂直運動次數(shù)比較 （n=6，±s）

注：①應激后與空白組比較，P＜0.05；②應激后與模型組比較，P ＜0.05。

組別水平運動垂直運動應激前71.66±7.31 75.66±11.11 72.16±16.63 72.00±13.41 0.133 0.939應激后61.33±19.36 41.83±5.56①58.33±6.71②67.67±15.02②4.182 0.019空白組模型組氟西汀組電針組F 值P 值t 值0.000 0.000 0.000 0.000 P 值0.239 0.002 0.181 0.567應激前11.5±4.59 13.67±6.53 12.83±4.70 14.5±4.41 0.652 0.774應激后17.33±2.50 6.50±2.66①12.33±2.06②12.66±2.94②17.970 0.000 t 值0.000 0.000 0.000 0.000 P 值0.058 0.030 0.822 0.493

2.2 各組大鼠KYNA、QUIN比較

4 組大鼠KYNA 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組大鼠海馬KYNA 含量較空白組降低（P＜0.05），電針組大鼠海馬KYNA含量較模型組升高（P＜0.05）；4 組大鼠QUIN 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠海馬QUIN 含量較空白組升高（P＜0.05），氟西汀組和電針組大鼠海馬QUIN 含量較模型組降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠KYNA、QUIN比較（n=6，ng/mL，±s）

表2 各組大鼠KYNA、QUIN比較（n=6，ng/mL，±s）

組別空白組模型組氟西汀組電針組F 值P 值KYNA 51.91±5.34 43.79±3.94 46.09±4.86 50.23±4.21 3.902 0.024 QUIN 4.82±0.43 5.98±0.86 5.01±0.44 5.27±0.44 4.702 0.012

2.3 各組大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA相對表達量的比較

4 組大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA 相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組大鼠較空白組升高（P＜0.05），氟西丁組和電針組較模型組降低（P＜0.05）；4 組大鼠海馬KAT mRNA 相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組較空白組降低（P＜0.05），氟西汀組和電針組較模型組升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA相對表達量比較 （n=6，±s）

表3 各組大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA相對表達量比較 （n=6，±s）

組別空白組模型組氟西汀組電針組F 值P 值KMO mRNA 1.01±0.15 2.04±0.38 1.55±0.46 0.98±0.28 13.210 0.000 3-HAO mRNA 1.01±0.18 2.32±0.16 1.73±0.34 1.62±0.18 32.907 0.000 KAT mRNA 2.00±0.34 1.58±0.46 2.55±0.23 2.38±0.24 10.437 0.000

3 討論

色氨酸是一種用于蛋白質(zhì)生物合成的必需氨基酸，也是5-HT 和犬尿氨酸的前體。5-HT 的減少和抑郁癥關系密切；同時犬尿氨酸代謝途徑是色氨酸分解代謝的主要途徑。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，犬尿氨酸代謝途徑是由吲哚氨-2,3-雙加氧酶（Indoleamine-2,3-dioxygenases, IDO）降解色氨酸引發(fā)的。當IDO 被激活后，犬尿氨酸代謝途徑分為兩個主要途徑，一個涉及神經(jīng)保護作用的Trp-KYNA 途徑，即犬尿氨酸被KAT 催化生成KYNA；另一個涉及神經(jīng)毒性的Trp-NAD+途徑，即犬尿氨酸在KMO、3-HAO 的作用下轉(zhuǎn)換為QUIN[9-10]。在生理條件下，色氨酸分別在5-羥色胺能神經(jīng)元中代謝為5-HT，在星形膠質(zhì)細胞中代謝為KYNA，作為NMDA 和a7nACh 受體拮抗劑，KYNA 可以發(fā)揮抗興奮和抗驚厥作用，從而提供神經(jīng)保護作用[11-12]。而在心理壓力和LPS 誘導的炎癥反應下，小膠質(zhì)細胞中犬尿氨酸途徑中神經(jīng)毒性分支的KMO、3-HAO 過度激活，生成3-HK 和QUIN，其中QUIN 具有神經(jīng)毒性的作用[13-16]。

慢性不可預知性應激結(jié)合孤養(yǎng)的方法是目前被國內(nèi)外研究人員廣泛認可的抑郁癥模型復制方法。本次實驗中，大鼠在經(jīng)過21 d 的應激后，水平活動和垂直活動次數(shù)較空白組減少，提示抑郁模型大鼠復制成功。氟西汀及電針治療可增加慢性應激大鼠的水平活動和垂直活動次數(shù)，證明了氟西汀及電針具有抗抑郁作用。

實驗表明，慢性應激可以導致大鼠海馬區(qū)KYNA的含量降低，QUIN的含量升高，KMO mRNA、3-HAOmRNA 的相對表達量升高，而KATmRNA的相對表達量降低，提示慢性應激可以過度激活犬尿氨酸代謝途徑中的具有神經(jīng)毒性的Trp-NAD+途徑，而具有神經(jīng)保護作用的Trp-KYNA 途徑則被抑制，說明慢性應激誘導大鼠的抑郁行為與大鼠機體的犬尿氨酸代謝途徑出現(xiàn)紊亂導致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷密切相關。氟西汀組和電針組大鼠KYNA含量較模型組升高，QUIN 的含量降低，KMO mRNA、3-HAO mRNA相對表達量降低，KAT mRNA相對表達量升高，說明兩種干預措施均可改變抑郁大鼠的犬尿氨酸代謝異常。

“百會”“印堂”兩穴，均為督脈要穴。中醫(yī)學認為：“病變在腦，首取督脈”，“百會”“印堂”的抗抑郁作用也被多數(shù)學者驗證[17]。本次研究結(jié)果表明，電針“印堂”“百會”在緩解抑郁的同時也對抑郁模型大鼠的犬尿氨酸代謝紊亂產(chǎn)生一定的作用，這可能也是其發(fā)揮抗抑郁作用的一個機制。可以說，抑郁與犬尿氨酸通路異常存在著密切關聯(lián)。電針可以緩解抑郁，改變?nèi)虬彼嵬樊惓?，且對機體無明顯不良作用，安全有效，值得在臨床進一步推廣。

本研究顯示抑郁模型大鼠海馬區(qū)犬尿氨酸相關代謝產(chǎn)物KYNA、QUIN、KMO、3-HAO、KAT 的變化，說明抑郁狀態(tài)下大鼠的犬尿氨酸途徑異常，進而可能導致海馬神經(jīng)損害，電針及氟西汀通過改善犬尿氨酸代謝異常以緩解海馬區(qū)神經(jīng)損害。但本次研究中未直接檢測大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及相關指標變化，不能強有力地證明犬尿氨酸代謝異常對抑郁模型大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的影響。在下一步的實驗中，仍需完善相關數(shù)據(jù)，以深入明確電針抗抑郁的機制。