王倩倩，田盼盼，徐陸周

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）以腹痛、腹瀉為主要臨床癥狀，是最常見的腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）亞型［1］。大量研究顯示，IBS-D是由多種病因和發(fā)病機制共同作用的結果［2-3］，其中腦-腸-微生物軸功能異常和內臟高敏感性是IBS-D的主要發(fā)病機制。腸道微生物和腦腸軸雙向交流，稱為“腦-腸-微生物軸”（brain-gut-microbiome axis，BGMA）［4-7］。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）作為神經遞質，在腦-腸-微生物軸的信號通路中可引起腸道運動性改變和內臟高敏感性，導致IBS-D的發(fā)生。5-羥色胺轉運體（serotonin transporter，SERT）通過將5-HT從固有層的間隙空間清除到負責分解代謝的腸黏膜細胞和突觸前神經元中，在5-HT 失活中發(fā)揮著不可替代的作用［8］。研究顯示，IBS-D 患者和健康對照組之間SERT 的表達差異提示SERT 在IBS-D 的發(fā)病中起重要作用［9］。腸道菌群通過神經-內分泌-免疫網絡（neuro-endocrine-immune，NEI）調控方式整合到腦-腸-微生物軸互動框架中，而且腸道菌群失調是IBS發(fā)病機制之一，因此，腸道菌群改變誘發(fā)IBS-D的作用機制受到了廣泛關注。

前期臨床研究和動物實驗表明，白石湯對于IBS-D 有明顯的治療作用［10-11］，本研究基于BGMA，從SERT 和腸道菌群變化的角度探討白石湯治療IBS-D的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠40只，體質量（180±20）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，合格證號：SCXK（遼）2020-0001。大鼠飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院藥理實驗室，清潔級環(huán)境動物籠具中，每2 d 清洗、消毒籠具1 次并更換墊料，室溫20～25 ℃。本實驗已通過南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗動物研究倫理審查，倫理編號：2021DW-30-02。

1.2 實驗藥品

白石湯處方：麩炒白術20 g，石菖蒲10 g，肉豆蔻10 g，地榆15 g，仙鶴草15 g 和烏梅6 g，均購自江蘇省中醫(yī)院中藥房；匹維溴銨片（50 mg × 15 片，國藥準字H20133036）購自雅培制藥有限公司；番瀉葉購自江蘇省中醫(yī)院中藥房。

1.3 實驗器材及試劑

脫水機（JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；顯微鏡（E100，Nikon）；5-羥色胺轉運體抗體（DF8616，艾菲生物公司）；5-羥色胺轉運體ELISA 試劑盒（貨號：20210831-J40482，湖南艾方生物科技有限公司）；4%多聚甲醛（貨號：BL539A，濟南海納實驗耗材公司）；導尿管（含球囊，8F，蘇械注準20182660688，可孚醫(yī)療器械公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥品制備

根據人鼠轉換系數W = 6.25 結合白石湯臨床用量，計算大鼠的用藥量為7.91 g/（kg·d）。將白石湯處方全部中藥放入10 倍蒸餾水中浸泡0.5 h 后煎煮，第1次熬藥1 h，第2次熬藥30 min，將2次濾液合并，濃縮為0.79 g/mL溶液，4 ℃保存待用。

取番瀉葉500 g，加水5 000 mL，浸泡30 min，煮沸30 min，過濾，濃縮為0.6 g/mL 的藥液，密封，4 ℃保存待用。

匹維溴銨片，參考60 kg 成人劑量，將匹維溴銨片碾碎，加蒸餾水配成濃度為1.58 mg/mL混懸液。

1.4.2 造模方法

將40 只SD 大鼠適應性飼養(yǎng)3 d 后，全部大鼠隨機分為空白組、模型組、白石湯組（給予白石湯藥液灌胃）、陽性對照組（給予匹維溴銨混懸液灌胃），每組10 只。空白組采用生理鹽水灌胃，其余各組采用番瀉葉灌胃+ 束縛方法建立IBS-D 大鼠模型［12］。造模的第1～4周采用番瀉葉煎劑灌胃，灌胃濃度為0.6 g/mL，灌胃劑量為10 mL/kg，每日1 次。從第3 周開始，番瀉葉灌胃后將大鼠放入大小約550 mL 的塑料瓶中，使大鼠在瓶中只能沿直線前后稍運動，每次3 h，每天1 次，每次束縛開始時間不固定，連續(xù)2 周。連續(xù)造模4 周后，觀察大鼠一般情況、大鼠體質量增長指數和AWR實驗結果，判斷造模是否成功。

造模成功后，每組大鼠灌胃給藥的劑量為10 mL/kg，每日1次。其中空白組和模型組采用生理鹽水灌胃，白石湯組采用白石湯0.79 g/mL 灌胃，陽性對照組采用匹維溴銨混懸液1.58 mg/mL 灌胃，持續(xù)2 周后，檢測大鼠血清、腦組織和結腸組織SERT 表達和腸道菌群變化情況。

1.4.3 檢測指標及方法

1.4.3.1 一般情況

定期觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、活動、糞便性狀并記錄大鼠體質量。

1.4.3.2 腹壁撤退反射（AWR）實驗

檢查前各組大鼠禁食16 h、自由飲水，方法如下：8F帶氣囊導尿管外涂抹凡士林，在大鼠清醒、不限制活動的狀態(tài)下經肛門插入，使氣囊末端距離肛緣1 cm 并固定。待大鼠適應環(huán)境呈安靜狀態(tài)時，擴張球囊，觀察AWR等級評分為3分（大鼠腹部抬離桌面）時的氣囊壓力。共進行3 次實驗，每次持續(xù)30 s，間隔3 min，取均值。大鼠AWR 評分標準［13］：對結直腸擴張刺激無行為學反應，計0分；身體靜止不動，頭部運動減少，計1分；腹肌收縮，但腹部未抬離桌面，計2分；腹肌收縮并抬離桌面，計3分；骨盆抬起，身體呈弓形，計4分。

1.4.3.3 大鼠結腸組織病理學改變

實驗動物禁食12 h，采用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，取出結腸組織，用4%甲醛溶液固定，分別進行常規(guī)浸泡、脫水、包埋、均勻連續(xù)切片。HE 染色后，高倍顯微鏡下觀測結腸組織病理變化。

1.4.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清SERT含量

剖腹取腹主動脈血2 mL，靜置0.5 h，以3 000 r/min速度離心15 min，離心半徑10 cm，取上清液置-80 ℃保存，操作嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑說明進行檢測。

1.4.3.5 免疫組化法檢測大鼠結腸組織、海馬區(qū)腦組織SERT蛋白水平

麻醉大鼠，采血后頸椎脫臼處死大鼠，剖腹取結腸段2 cm，共取3 段，取大鼠全腦，石蠟包埋后切片，經抗原修復和封閉后，孵育一抗、二抗，復染顯色后置于高倍顯微鏡下，隨機選擇3 個視野觀察。用Image J軟件對SERT 免疫陽性率（OD 值）的比值進行半定量分析。

1.4.3.6 大鼠腸道菌群檢測

給藥結束后，采集大鼠糞便，置于無菌的離心管中，放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?6S rDNA 高通量測序運用Miseq測序平臺對糞便樣本進行腸道菌群多樣性、厚壁菌門/擬桿菌門的比率等分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件數據分析，計量資料數據采用均數± 標準差（±s）表示。多組間數據比較采用ANOVA 分析，組內比較采用配對t檢驗。以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態(tài)及體質量增長情況

2.1.1 大鼠一般情況比較

造模前大鼠精力充沛，皮毛光澤，喜動，大便呈顆粒狀。造模開始后，番瀉葉灌胃第3 天時大鼠出現腹瀉癥狀，精神逐漸萎靡。塑料瓶束縛時，大鼠撞擊瓶口，煩躁不安并出現撕咬現象。造模結束后，模型大鼠精神萎靡，毛發(fā)污穢雜亂，喜蜷縮，飲食減少，體質量下降，形體增胖緩慢，溏瀉程度增加?？瞻捉M大鼠精神抖擻、皮毛光澤、好動、糞便正常。白石湯組和陽性對照組精神較前好轉，皮毛光澤無雜亂，溏瀉程度減輕，體質量增長幅高。

可以看到，顯示面板頂端有1/2/3的三排LED顯示燈帶，代表當前每個濾芯的使用狀態(tài)，滿格為最佳，降至1格甚至更低則提示用戶應及早更換濾芯。

2.1.2 各組大鼠體質量情況比較

與空白組比較，造模結束后模型組、白石湯組、陽性對照組大鼠體質量增長緩慢（P＜0.05）；給藥結束后，與模型組大鼠比較，白石湯組、陽性對照組大鼠體質量顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質量情況比較（±s，g）

表1 各組大鼠體質量情況比較（±s，g）

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。

組別空白組模型組白石湯組陽性對照組n 10 10 10 10造模前205.70±5.12 208.00±7.41 209.22±5.09 205.17±7.47造模結束后428.50±16.00 375.00±38.73*363.89±21.32*368.33±12.52*給藥結束后478.00±22.26 399.29±23.88*436.11±20.88*△430.00±10.00*△

2.2 各組大鼠AWR實驗情況比較

給藥結束后，與空白組大鼠比較，模型組大鼠AWR 等級評分為3 分時所需注水量顯著降低（P＜0.001），提示大鼠內臟敏感性顯著增高；與模型組大鼠比較，陽性對照組、白石湯組所需注水量明顯增高（P＜0.05）。各組大鼠AWR 等級評分為3分時注水量測定結果提示，白石湯能夠降低IBS-D 大鼠內臟高敏感性。見表2。

表2 各組大鼠AWR等級評分為3分時注水量比較（±s，mL）

表2 各組大鼠AWR等級評分為3分時注水量比較（±s，mL）

注：與空白組比較，*P ＜0.001；與模型組比較，▲P ＜0.05。

組別空白組模型組白石湯組陽性對照組n 10 10 10 10造模結束后1.01±0.08 0.63±0.05*0.64±0.06*0.63±0.05*給藥結束后0.97±0.06▲0.65±0.06 0.93±0.05▲0.93±0.05▲

2.3 各組大鼠結腸組織病理學改變情況比較

空白組、模型組、白石湯組、陽性對照組大鼠結腸組織黏膜結構完整，未見明顯黏膜炎癥以及淋巴細胞浸潤和間質水腫。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學改變情況（HE，×200）

2.4 各組大鼠血清SERT水平比較

與模型組大鼠比較，白石湯組、陽性對照組血清SERT 水平均明顯降低（P＜0.05）。白石湯組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白組比較，模型組血清SERT 水平明顯提高（P＜0.001）。見表3。

表3 各組大鼠血清SERT水平比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠血清SERT水平比較（±s，pg/mL）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，▲P ＜0.001。

組別空白組模型組白石湯組陽性對照組n6 6 6 6血清SERT 1 213.58±77.68▲732.40±216.34 1 000.29±145.49*964.01±183.52*

2.5 各組大鼠結腸和海馬區(qū)腦組織SERT表達比較

與模型組大鼠比較，白石湯組和陽性對照組大鼠結腸組織和海馬區(qū)腦組織SERT 表達均明顯升高（P＜0.05），表明白石湯可以提高大鼠結腸組織SERT和海馬區(qū)腦組織SERT表達。見表4、圖2和圖3。

圖2 各組大鼠結腸組織SERT表達情況（×200）

圖3 各組大鼠海馬區(qū)腦組織SERT表達情況（×200）

表4 各組大鼠結腸組織、海馬區(qū)腦組織SERT表達比較（±s）

表4 各組大鼠結腸組織、海馬區(qū)腦組織SERT表達比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05。

組別空白組模型組白石湯組陽性對照組n 3 3 3 3結腸組織SERT 0.257±0.048*0.189±0.040 0.243±0.033*0.226±0.023*海馬區(qū)腦組織SERT 0.040±0.011*0.028±0.003 0.038±0.004*0.037±0.008*

2.6 各組大鼠腸道微生物多樣性指數比較

PD-whole-tree多樣性指數是微生物α多樣性指數的一種，兼顧考慮了腸道微生物豐度以及進化距離的多樣性指數。數值越大，群落多樣性越高。與模型組大鼠比較，白石湯組和陽性對照組大鼠PDwhole-tree 多樣性指數顯著升高（P＜0.05）。表明白石湯可顯著提高大鼠腸道微生物多樣性和豐度。見表5。

表5 大鼠腸道菌群PD-whole-tree的多樣性指數比較（±s）

表5 大鼠腸道菌群PD-whole-tree的多樣性指數比較（±s）

注：與模型組比較，■P ＜0.05。

組別空白組模型組白石湯組陽性對照組n3 3 3 3 PD-whole-tree 72.97±5.46■48.11±2.67 63.78±8.40■62.77±11.53■

2.7 各組大鼠腸道菌群成分分析

圖4 在門水平不同大鼠腸道菌群組成

表6 大鼠腸道微生物的F/B的比率（±s）

表6 大鼠腸道微生物的F/B的比率（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05。

組別空白組模型組白石湯組陽性對照組n3 3 3 3 F/B 3.95±2.14*11.77±5.82 5.34±2.15*3.95±0.06*

2.8 偏最小二乘法判別分析

偏最小二乘法判別分析（partial leastsquares discrimination analysis，PLS-DA）是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法，屬于Beta 多樣性分析的一種。該方法運用PLS-DA 建立微生物含量與樣品類別之間的關系模型，展示樣品間物種多樣性差異，兩點之間距離越大表明兩者的群落構成差異越大。模型組大鼠與空白組大鼠相對處于不同區(qū)域，表明其之間腸道菌群結構及多樣性存在差異。與模型組比較，白石湯組均距離空白組區(qū)域更近，說明白石湯組給藥后可減少模型組與空白組大鼠腸道菌群的差異。以上結果提示，IBS-D 大鼠腸道菌群結構及多樣性發(fā)生紊亂，給予白石湯后，可一定程度調控并改善紊亂的腸道菌群，使其向正常方向改變。見圖5。

圖5 基于OTU的偏最小二乘法判別分析

3 討論

IBS-D 屬于功能性胃腸疾病，其發(fā)病率逐年上升，發(fā)病機制未完全闡明。腸黏膜上皮細胞的SERT通過快速再攝取5-HT 入胞，再經過單胺氧化酶作用降解失活，這表明SERT 在影響腸內5-HT 的可利用性和生物功能的局部調節(jié)中占有主導地位［15］。腸易激綜合征患者腸道局部SERT 表達水平降低，導致腸上皮細胞對5-HT 的攝取減弱，引起腸道5-HT 含量升高。研究認為，SERT表達的改變是5-HT信號紊亂的原因，當SERT 表達的失調增加腸道黏膜對5-HT 的利用率時，高水平的腸道分泌和運動可能會加速腸易激綜合征的發(fā)展。耿琴等經臨床試驗發(fā)現，SERT可通過影響內臟敏感性在一定程度上介導IBS-D 的疾病發(fā)展［16］。SERT 基因的表達和蛋白功能的降低可導致5-HT的過量堆積，腦-腸-微生物軸功能失調，進而引起腸道運動性改變［17］和內臟高敏感性［18］，導致腹瀉和腹痛的產生，與腸易激綜合征的發(fā)病機制有關。

健康的常駐微生物可以防止病原體的侵入，維護腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，這對宿主的腸道健康非常重要。正常的常駐菌群中也存在病原菌［19］，當腸道環(huán)境發(fā)生變化時，如使用抗生素、飲食或生活方式改變以及腸道感染時，病原菌會增加并被激活其生物活性［20］。腸道微生物群的失調可通過增加腸道通透性，激活黏膜免疫反應，增加內臟敏感性和改變腸道運動性從而引發(fā)腸易激綜合征［21］。

腸道微生物作用于傳入迷走神經和脊髓神經末梢的腸道源性分子，間接或直接通過微生物產生的信號與大腦溝通。微生物本身也可以被腸神經系統(tǒng)中的免疫受體識別，通過免疫信號影響腦腸軸，而且作為IBS病理的一部分，能直接影響內臟疼痛和腸道運動［22］。病原微生物釋放的脂多糖可以增加腸道通透性，改變腸神經系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)的活性［23］。因此，腦-腸-微生物軸SERT 低表達和腸道菌群失調導致了IBS-D的發(fā)生和發(fā)展。

IBS-D 屬于“泄瀉”的范疇?！端貑枴り庩枒蟠笳摗吩疲骸皾駝賱t濡瀉”?！督饏T鉤玄·附錄六》言：“泄瀉者……皆能動乎脾濕”?！毒霸廊珪ば篂a》曰：“怒氣作泄瀉，怒時夾食，致傷脾胃，肝木克土，脾氣受傷”?！夺t(yī)方考》云：“瀉責之脾，痛責之肝；肝責之實，脾責之虛，脾虛肝實”?？梢姎v代醫(yī)家多認為脾胃虛弱是根本，脾氣不運則易生濕，土虛木乘，升降失職，清濁不分則導致泄瀉，脾虛肝郁濕盛是關鍵病機。治療上徐景藩教授認為，治療脾胃病時要善用芳香化濕藥，使?jié)裥暗没?，氣機得暢，脾胃得運，從而達到健脾燥濕、化濕和胃的功效［24］。單兆偉教授依據張景岳“情志三郁”理論，和肝郁脾虛型泄瀉結合，主張“身心相和，治神為先”，用藥與疏導憂思怒、調攝并舉而達“止瀉”之效［25］。徐陸周教授總結IBS-D 具有“脾虛為本、肝脾不調、寒熱夾雜”的病機特點，提出強化“以治脾為先，肝脾同調，寒溫并用”的法則要點，創(chuàng)制中藥方劑白石湯。

白石湯由麩炒白術、石菖蒲、肉豆蔻、地榆、仙鶴草、烏梅6 味藥組成。本方具有疏肝健脾、清利濕熱、澀腸止瀉的作用。俞蕾敏等研究發(fā)現炒白術可以影響IBS 小鼠的腸道菌群代謝，從而改善IBS 小鼠內臟敏感性及糞便性狀［26］。石菖蒲芳香開竅，研究發(fā)現其水提物和石油醚提取物可以雙向調節(jié)腦組織中SERT 活性［27］。李麗等研究發(fā)現地榆可以修復結腸黏膜損傷，降低血清及結腸組織促炎因子含量，并改善大鼠腸道菌群多樣性［28］。張衣國研究發(fā)現，仙鶴草具有消炎止瀉的作用［29］。本方中麩炒白術為君藥，健脾益氣、燥濕止瀉；石菖蒲化濕和胃，可以加強溫中化濕的功效，具有“醒脾”的作用；肉豆蔻溫中行氣，善治脾虛寒濕滯留，與炒白術合用治療脾虛泄瀉；地榆清熱涼血，其清化作用可使白術、豆蔻補澀而不滯，清除肝經郁熱；仙鶴草補虛健脾而止瀉，選用烏梅酸柔養(yǎng)津而使肝氣升達，調暢情志。

綜上所述，白石湯可能通過作用于腦-腸-微生物軸，提高了IBS-D 大鼠血清、海馬區(qū)腦組織和結腸組織中SERT 的表達，改善了IBS-D 大鼠腸道菌群的結構組成，恢復腸道菌群多樣性，進而治療IBS-D。