唐星冉，周惠芳，劉心媛，楊曉田

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210046）

女性未避孕，性生活正常，與配偶同居1年而未孕者，稱為不孕癥［1］。隨著社會(huì)的發(fā)展，女性不孕癥的發(fā)病率逐年上升，被列為醫(yī)學(xué)界三大難治性疾病之一，黃體功能不全（luteal phase deficiency，LPD）是導(dǎo)致不孕癥的重要原因之一［2-4］。中醫(yī)并無(wú)“黃體功能不全”的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸為“月經(jīng)先期”“不孕癥”“胎漏”“胎動(dòng)不安”等［1］。

補(bǔ)腎助孕方由淮山藥15 g，醋柴胡6 g，丹參10 g，菟絲子15 g，炒白芍10 g，山茱萸10 g等8味中藥組成，為周惠芳教授在國(guó)醫(yī)大師夏桂成的學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下，由經(jīng)驗(yàn)方進(jìn)一步凝練而成，治療腎虛肝郁所致的黃體功能不全性不孕癥、流產(chǎn)療效顯著，臨床總有效率達(dá)94.51%［5-6］。腎虛肝郁所致黃體功能不全臨床表現(xiàn)多具有“月經(jīng)先期”“痛經(jīng)”“腰膝酸軟”“心煩易怒”等癥。

課題組前期研究表明，補(bǔ)腎助孕方能夠通過(guò)調(diào)節(jié)垂體GnRH 受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)垂體促性腺激素的分泌水平；提高LPD 模型大鼠卵巢抗氧化能力，緩解卵巢氧化應(yīng)激壓力；促進(jìn)黃體毛細(xì)血管生成；顯著提高卵巢黃體細(xì)胞分泌E2、P 水平；改善子宮內(nèi)膜容受性等從而達(dá)到改善LPD 的目的［7-13］?；诖?，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)補(bǔ)腎助孕方治療LPD 的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，并采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分靶點(diǎn)及信號(hào)通路，進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

BN（Brown Norway）大鼠是國(guó)際上公認(rèn)研究妊娠失敗和低生育力病因的獨(dú)特動(dòng)物模型，其生殖功能障礙與黃體功能不全和循環(huán)孕酮水平低有關(guān)［14-16］，因此本研究采用BN大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性BN 大鼠50 只，12 周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（蘇2019-0005）。動(dòng)物入室后飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境，使用許可證號(hào)為SYXK（蘇）2018-0049，動(dòng)物自由飲水?dāng)z食，12 h/12 h晝夜循環(huán)，室溫（23±3）℃，相對(duì)濕度40%～70%。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已通過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理審核，批準(zhǔn)號(hào)為202005A040。

1.2 藥物

地屈孕酮（荷蘭蘇威制藥有限公司，規(guī)格10 mg/片，批號(hào)：362941）制成劑量為0.002 g/kg 的混懸液；補(bǔ)腎助孕方所用藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定為正品，均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》的相關(guān)項(xiàng)要求，煎煮后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水提液分別濃縮至含生藥量為4.5、9.0、18.0 g/kg的補(bǔ)腎助孕方溶液，等效劑量為9.0 g/kg。

1.3 試劑

大鼠含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）內(nèi)參引物、大鼠含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-7（cysteinyl aspartate specific proteinase-7，Caspase-7）內(nèi)參引物、大鼠含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）內(nèi)參引物（批號(hào)：250109459）；兔Bax 抗體、兔Bcl-2 抗體（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)分別為ab32503、ab196495）；Total RNA Isolation Kit 組織總RNA 提取試劑盒、Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)分別為L(zhǎng)/N 7E530C1、Q712-02/03）；DEPC 水（上海翊圣生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.4 儀器

Infinite M200 PRO 型微孔板檢測(cè)儀（瑞士Tecan 公司）；MM400 型混合球磨儀（德國(guó)Retsch 公司）；Quant Studio 7Flex 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Realtime PCR）儀（美國(guó)Thermo 公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；96 孔PCR 反應(yīng)板（美國(guó)Bio-Rad公司）；超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 補(bǔ)腎助孕方靶點(diǎn)、LPD 靶點(diǎn)、藥物與疾病潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)檢索，收集補(bǔ)腎助孕方各個(gè)藥物活性成分。根據(jù)ADME 原則，篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18。數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄藥物，文獻(xiàn)檢索后獲取其有效成分。運(yùn)用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，限定物種為人源，作為補(bǔ)腎助孕方活性成分靶點(diǎn)。以“dysmenorrhea”“advanced menstruation”“sore and pain in loin and legs”“restlessness and irritability”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards、OMIM、DrugBank 3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，重復(fù)靶點(diǎn)保留1個(gè)，建立LPD 靶點(diǎn)庫(kù)。借助Venny網(wǎng)站將補(bǔ)腎助孕方活性成分靶點(diǎn)與LPD 靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“補(bǔ)腎助孕方-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定物種為人源，設(shè)置最小交互值為“high confidence ＞0.9”，其余保持默認(rèn)，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）信息。保存TSV 文件，使用Cytoscape軟件中cytoHubba插件篩選治療的核心靶點(diǎn)。

2.1.3 GO、KEGG通路富集分析

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇為人源，其余保持默認(rèn)，進(jìn)行富集分析。結(jié)合課題組前期研究結(jié)果，選取Apoptosis信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。

2.1.4 分子對(duì)接

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)得到補(bǔ)腎助孕方成分的3D結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)，使用Autodock 軟件對(duì)小分子和靶蛋白進(jìn)行加氫、去電荷，借助PyMOL軟件插件找到對(duì)接活性位點(diǎn)，即可在Autodock Vina 軟件將處理后的成分與靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，最后通過(guò)PyMOL 軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 分組

將BN 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后，于每日上午9 時(shí)進(jìn)行大鼠陰道涂片，連續(xù)觀察2～3 個(gè)動(dòng)情周期，了解大鼠動(dòng)情周期變化情況，使用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為模型組、地屈孕酮組和補(bǔ)腎助孕方低、中、高劑量組等5組，每組10只。

2.2.2 給藥

每日上午9 時(shí)對(duì)各組大鼠進(jìn)行陰道涂片，確認(rèn)大鼠進(jìn)入動(dòng)情后期后，分別灌服地屈孕酮、中藥直至大鼠進(jìn)入下一個(gè)動(dòng)情前期，持續(xù)給藥3 個(gè)動(dòng)情周期。參考徐叔云主編《實(shí)驗(yàn)藥理方法學(xué)》，60 kg 成人與200 g 大鼠按體表面積折算的等效劑量比值為6.25，補(bǔ)腎助孕方臨床用量為86 g，補(bǔ)腎助孕方低、中、高劑量分別給予補(bǔ)腎助孕方溶液4.5、9.0、18.0 g/kg 灌胃，中劑量組為成人的等效劑量，低、高劑量組分別為成人等效劑量的0.5 倍和2 倍。地屈孕酮組給予地屈孕酮溶液0.002 g/kg灌胃，模型組給予等體積雙蒸水灌胃。

2.2.3 取材

各組大鼠末次給藥后禁食不禁水，予10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血后斷頸處死，迅速取出卵巢，液氮速凍后置-80 ℃冰箱備測(cè)。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠卵巢Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平

使用諾唯贊試劑盒提取BN 大鼠卵巢組織總RNA，測(cè)定RNA 樣品濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄為c-DNA，置于-20 ℃冰箱。PubMed 基因數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索大鼠Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 mRNA 引 物序列，由上海生工公司設(shè)計(jì)、合成引物，序列見(jiàn)表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，相同基因設(shè)3 個(gè)復(fù)孔、4 次平行實(shí)驗(yàn)，得到各擴(kuò)增反應(yīng)的CT 值，使用QuantStudio 6&7 PCR System 及GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 PCR引物序列

2.3.2 免疫組化檢測(cè)大鼠卵巢Bcl-2、Bax表達(dá)

大鼠卵巢組織切片，脫蠟、水化、抗原修復(fù)，滴加3% H2O2室溫孵育10 min，山羊血清封閉，37 ℃孵育10 min，滴加一抗（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，5 min PBS 沖洗3 次，二抗孵育30 min，滴加適量辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃孵育20 min，顯色劑顯色，封片后在顯微鏡下觀察。應(yīng)用Image pro-Plus圖像分析軟件測(cè)定積分光密度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析。定量資料以±s表示，多組間比較如符合正態(tài)分布且方差齊采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，若不符合正態(tài)分布或方差不齊使用非參數(shù)檢驗(yàn)（Nonparametric tests），P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎助孕方活性成分及靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果及文獻(xiàn)檢索，篩選后得到996個(gè)活性成分，去重后得到補(bǔ)腎助孕方146個(gè)成分，見(jiàn)表2。運(yùn)用Uniprot 標(biāo)準(zhǔn)化得到232 個(gè)潛在靶點(diǎn)，從OMIM，DrugBank 及GeneCards3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共得到3 195 個(gè)疾病靶點(diǎn)，將疾病與藥物交集靶點(diǎn)數(shù)為158個(gè)，見(jiàn)圖1。利用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分與靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。

圖1 補(bǔ)腎助孕方和黃體功能不全交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 “補(bǔ)腎助孕方-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

表2 補(bǔ)腎助孕方活性成分信息

藥物靶點(diǎn)居前5 位的活性成分為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木樨草素、丹參酮Ⅱa，推測(cè)可能是治療LPD的核心活性成分。見(jiàn)表3。

表3 補(bǔ)腎助孕方活性成分及靶點(diǎn)數(shù)

3.2 富集分析

以“P ≤0.01”和“bejamini ≤0.001”作為篩選條件，得到GO 條目136 條，選取生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cell composition，CC）、分子功能（molecular fuction，MF）的前10 條通路進(jìn)行展示，見(jiàn)圖3。BP 主要包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、基因表達(dá)的正向調(diào)控、缺乏配體時(shí)的外部凋亡信號(hào)通路和對(duì)雌二醇反應(yīng)等。CC 主要包括細(xì)胞外空隙、膜筏、核漿、胞液和質(zhì)膜等。MF 主要包括酶結(jié)合位點(diǎn)、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、配體門(mén)控離子通道活性和RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性等。說(shuō)明補(bǔ)腎助孕方可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)控配體對(duì)雌二醇的反應(yīng)等治療LPD［13］。

圖3 GO功能富集分析

在KEGG通路富集分析結(jié)果經(jīng)篩選后共得到70條通路，對(duì)前20條信號(hào)通路進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖4。其中縱坐標(biāo)代表富集的通路名稱，橫坐標(biāo)為每條通路上的基因數(shù)占共有靶點(diǎn)的比例。包括癌癥相關(guān)信號(hào)通路（pathways in cancer、Endometrial cancer）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K/Akt信號(hào)通路（PI3K/Akt signaling pathway）、FoxO 信號(hào)通路（FoxO signaling pathway）、MAPK 信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、凋亡相關(guān)信號(hào)通路（apoptosis）、p53 信號(hào)通路（p53 signaling pathway）、NF-κb 信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）及細(xì)胞周期（cell cycle）等。表明補(bǔ)腎助孕方化學(xué)成分主要分布于多條代謝通路，通過(guò)它們之間的相互協(xié)調(diào)作用，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期等作用來(lái)治療LPD。KEGG凋亡信號(hào)通路見(jiàn)圖5。

圖4 KEGG通路富集分析

圖5 KEGG凋亡通路

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)補(bǔ)腎助孕方治療黃體功能不全（LPD）相關(guān)的158 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 分析，見(jiàn)圖6。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 中進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算出度值（degree），介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC），接近中心性（closeness cebtrality，CC），其中degree 中位數(shù)為9，BC 的中位數(shù)為0.01，CC 的中位數(shù)為0.38，篩選degree ＞9、且BC ＞0.01、且CC ＞0.38的靶點(diǎn)有36個(gè)，可能是補(bǔ)腎助孕方治療LPD 的關(guān)鍵蛋白，挑選前10位導(dǎo)入Cytoscape，繪制核心靶點(diǎn)圖，見(jiàn)圖7。其中多個(gè)蛋白，如JUN、STAT3、TP53、AKT1、MAPK1、TNF、FOS、MAPK14等與凋亡密切相關(guān)。

圖7 補(bǔ)腎助孕方治療黃體功能不全的核心靶點(diǎn)

3.4 分子對(duì)接

將5 個(gè)關(guān)鍵活性成分與凋亡相關(guān)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。一般以結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)［17-20］，各化合物與蛋白均能較好地結(jié)合。利用PyMOL 軟件選取關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)合最強(qiáng)的化合物進(jìn)行3D圖展示，見(jiàn)圖8。

圖8 分子對(duì)接模式圖

3.5 對(duì)BN大鼠卵巢 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平的影響

PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，與模型組相比，地屈孕酮組Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；補(bǔ)腎助孕方低劑量組Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）；補(bǔ)腎助孕方中劑量組Caspase-3、Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；補(bǔ)腎助孕方高劑量組Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.01，P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 補(bǔ)腎助孕方對(duì)各組大鼠卵巢Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平的影響（±s，n=3）

表5 補(bǔ)腎助孕方對(duì)各組大鼠卵巢Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平的影響（±s，n=3）

注：與模型組比較，1）P ＜0.05，2）P ＜0.01。

組別模型組地屈孕酮組低劑量組中劑量組高劑量組劑量/g/kg—0.002 4.5 9.0 18.0 Caspase-3 1 0.30±0.192）0.38±0.351）0.24±0.142）0.21±0.172）Caspase-7 1 0.45±0.192）0.87±0.17 0.78±0.03 0.46±0.112）Caspase-9 1 0.47±0.232）0.83±0.01 0.56±0.102）0.70±0.011）

3.6 對(duì)BN大鼠卵巢Bcl-2、Bax表達(dá)水平的影響

免疫組化結(jié)果表明，與模型組相比，地屈孕酮組和補(bǔ)腎助孕方低、中、高劑量組Bcl-2 表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01）；地屈孕酮組、補(bǔ)腎助孕方中劑量組Bax表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。見(jiàn)表6和圖9。

圖9 各組大鼠卵巢Bax/Bcl-2免疫組化圖（比例尺：50 μm）

表6 補(bǔ)腎助孕方對(duì)各組大鼠卵巢Bax、Bcl-2表達(dá)水平的影響（±s，n=3）

表6 補(bǔ)腎助孕方對(duì)各組大鼠卵巢Bax、Bcl-2表達(dá)水平的影響（±s，n=3）

注：與模型組比較，2）P ＜0.01。

組別模型組地屈孕酮組低劑量組中劑量組高劑量組劑量/g/kg—0.002 4.5 9.0 18.0 Bcl-2 0.002 0±0.000 7 0.011 0±0.004 12）0.002 6±0.000 32）0.010 3±0.002 92）0.007 2±0.001 62）Bax 0.013 3±0.0005 0.001 1±0.000 22）0.002 6±0.000 6 0.002 3±0.000 32）0.001 5±0.000 3

4 討論

黃體（corpus luteum，CL）是雌性哺乳動(dòng)物卵巢中的暫時(shí)性分泌組織，由卵泡排卵后的泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞分化而成，其主要功能是分泌孕酮以維持妊娠及調(diào)節(jié)發(fā)情周期。研究顯示，黃體的結(jié)構(gòu)以自噬和凋亡兩種方式退化，凋亡是人類溶黃體的重要特征之一，形態(tài)學(xué)研究提示自噬促進(jìn)了黃體的溶解［21-23］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)的未折疊反應(yīng)參與山羊黃體維持和退化過(guò)程，山羊晚期黃體中存在黃體細(xì)胞的凋亡［24］。部分學(xué)者認(rèn)為Fas 配體和Fas 系統(tǒng)是黃體細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制［25］。黃體細(xì)胞凋亡是黃體退化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞凋亡的調(diào)控伴隨著黃體的維持和退化進(jìn)程［26］。因此，黃體功能不全的發(fā)生可能與黃體細(xì)胞過(guò)早凋亡相關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木樨草素、丹參酮Ⅱa 等可能是治療LPD 的核心成分，分子對(duì)接結(jié)果也證明核心成分與凋亡相關(guān)靶點(diǎn)有良好的結(jié)合能力。槲皮素可抑制各種腫瘤細(xì)胞的增殖，與凋亡調(diào)節(jié)因子Bax 和Bcl-2 有關(guān)，能調(diào)節(jié)Caspase［27-28］；山柰酚呈現(xiàn)雌激素樣活性，其介導(dǎo)凋亡的主要途徑為改變細(xì)胞周期，同時(shí)山柰酚是最有效的活性氧自由基清除劑［29-31］；β-谷甾醇可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，抑制凋亡，通過(guò)影響雌激素受體信號(hào)通路使GnRH分泌減少的狀況得到緩解，發(fā)揮抗衰老作用［32-33］；木樨草素能夠顯著增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，具有明顯的抗氧化作用，同時(shí)具有抗脂代謝紊亂及抗細(xì)胞凋亡作用［34］；丹參酮具有抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡作用［35-37］。

同時(shí)，KEGG 通路富集結(jié)果提示，補(bǔ)腎助孕方治療LPD 的潛在治療靶點(diǎn)主要集中在PI3K/Akt、MAPK、凋亡、p53 等信號(hào)通路。其中PI3K/Akt、MAPK、p53 等均與凋亡信號(hào)通路相關(guān)。核心靶點(diǎn)中，JUN、STAT3、TP53、AKT1、MAPK1、MAPK14等多個(gè)蛋白靶點(diǎn)與凋亡密切相關(guān)。故本研究選取凋亡信號(hào)通路作為研究對(duì)象。

免疫組化結(jié)果表明，補(bǔ)腎助孕方各劑量組Bcl-2表達(dá)水平上調(diào)；補(bǔ)腎助孕方中劑量組Bax 表達(dá)水平顯著下調(diào)。PCR 結(jié)果表明，補(bǔ)腎助孕方各劑量組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平不同程度下調(diào)；補(bǔ)腎助孕方高劑量組Caspase-7 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)；補(bǔ)腎助孕方中、高劑量組Caspase-9 mRNA表達(dá)水平不同程度下調(diào)。表明補(bǔ)腎助孕方可能可以降低卵巢凋亡水平。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎助孕方可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上靶蛋白表達(dá)，從而達(dá)到治療LPD的作用。

但本研究仍存在不足之處，篩選得到的成分僅考慮其活性，并未考慮到煎煮過(guò)程中可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生新物質(zhì)及活性成分入血情況。同時(shí)，分子對(duì)接及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)僅驗(yàn)證部分關(guān)鍵靶點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其他靶點(diǎn)作用情況，從而更全面、深入、科學(xué)闡釋補(bǔ)腎助孕方作用機(jī)制。