李梓泳，陳龍，馬文丹，周紅軍，周新華，2

（1 植物健康創(chuàng)新研究院，仲愷農(nóng)業(yè)工程學院化學化工學院，廣東省普通高校農(nóng)用綠色精細化學品重點實驗室，廣東 廣州 510225；2 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東 茂名 525000）

農(nóng)藥是一類重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，可用于防治病蟲害、調(diào)節(jié)作物生長、提高農(nóng)產(chǎn)品收成。傳統(tǒng)的農(nóng)藥制劑存在粉塵漂移、有機溶劑和表面活性劑使用量大、利用率低等問題。據(jù)統(tǒng)計，在農(nóng)藥噴施的過程中，農(nóng)藥的分解率高于50%，最終在作物中起效的不到10%。使用載體將易分解的農(nóng)藥包封起來可降低農(nóng)藥的分解率并優(yōu)化其性能，達到提高利用率的目的。納米農(nóng)藥是一種新興的農(nóng)藥傳遞系統(tǒng)，具有小粒徑、高比表面積的特點，易被靶標生物吸收。納米農(nóng)藥可減輕紫外光、氧氣、微生物等分解作用，從而提高制劑穩(wěn)定性，延長藥效。Hao 等報道了一種功能化的二維氮化硼納米片作為高水分散性的農(nóng)藥納米載體，具有明顯的pH 響應和抗紫外線照射等性能。Chen等利用改性修飾后的納米介孔硅制備了使用壽命長的環(huán)保型緩釋生物農(nóng)藥，以減少農(nóng)藥對環(huán)境造成的破壞。Zhao等設計了殼聚糖為基材的納米農(nóng)藥顆粒，能在黃瓜葉片上較好地鋪展并具有較高的黏附性。

因為蛋白質(zhì)（大豆蛋白、玉米醇溶蛋白、羽毛蛋白等）、多糖（木質(zhì)素、纖維素、殼聚糖）等天然聚合物來源豐富、無毒和可生物降解，被廣泛應用于納米農(nóng)藥。玉米醇溶蛋白是玉米胚乳中的主要蛋白質(zhì)，具有獨特的溶解特性使其可通過簡單的方法得到納米粒子，是一種有前景的新型納米載體材料。玉米醇溶蛋白具有疏水性、生物相容性、生物可降解性和能自組裝成納米顆粒的特性，用于各種疏水化合物、藥物、維生素和膳食補充劑的包埋和傳遞。玉米醇溶蛋白納米顆粒易在溶液狀態(tài)下聚集，對其進行陽離子改性可提高分散性，且有利于與植物葉面形成靜電作用，提高其潤濕性能。Hao 等使用羧甲基纖維素鈉（CMC）接枝甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸羥乙酯的共聚物，最后通過開環(huán)作用與乙二醇二縮水甘油醚改性過的Zein 反應，制得的農(nóng)藥納米顆粒有較高載藥率，但該方法改性步驟相對復雜。二甲基二烯丙基氯化銨（DMDAAC）是一種具有較高實用價值的陽離子單體，具有分子量易于控制、殺菌性能好、價格低廉、無毒、正電荷密度高等優(yōu)點。Liu 等使用帶正電荷的DMDAAC 接枝CMC 作為陰離子農(nóng)藥的載體，具有多種環(huán)境響應功能，提高了農(nóng)藥的利用效率。邱松發(fā)等利用乳液聚合把DMDAAC 和甲基丙烯酸甲酯的共聚物改性CMC，賦予農(nóng)藥較強的緩釋性能，減少了農(nóng)藥用量。

本文利用PDMDAAC對Zein進行改性，制備一種納米農(nóng)藥載體，并負載了阿維菌素。利用FTIR、SEM、DLS 動態(tài)光散射激光粒度儀、zeta 電位儀和接觸角儀對納米顆粒進行了表征，分析了不同接枝量下AVM 的釋放情況，比較了原藥和納米農(nóng)藥顆粒葉面上的滯留量，證明該納米農(nóng)藥載體可以增強AVM的抗紫外性能。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

玉米醇溶蛋白（Zein）、氫氧化鈉（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；二甲基二烯丙基氯化銨（DMDAAC），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿維菌素（AVM），工業(yè)級，純度為95%，河北威遠生物化工有限公司提供；溴化鉀，分析純，廣州化學試劑廠；濃鹽酸、過硫酸鉀（KPS）、無水乙醇，均為分析純，天津大茂化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

紫外可見分光光度計，T6 型，北京新世紀有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀，Spectrum100型，美國賽默飛世爾科技公司；激光粒度儀，90 Puls型，英國馬爾文儀器有限公司；分析天平，SQP型，上海精科天美科學儀器有限公司；接觸角儀，Theat 型，瑞士百歐林儀器公司；旋轉蒸發(fā)儀，RV10型，德國艾卡公司。

1.3 聚二甲基二烯丙基氯化銨-玉米醇溶蛋白（Zein-g-PDMDAAC）的制備

2g玉米醇溶蛋白溶解在50mL 70%乙醇水溶液中。0.5g KPS溶于10mL去離子水，得到KPS溶液，取2mL 加入玉米醇溶蛋白溶液中攪拌5min；10mL 12%二甲基二烯丙基氯化銨溶液與剩余KPS溶液分別用恒壓滴定漏斗滴加至引發(fā)的玉米醇溶蛋白溶液中，在回流條件下繼續(xù)反應4h，反應全程通入氮氣保護。反應結束后旋轉蒸發(fā)除去乙醇，調(diào)節(jié)pH至13，離心取上清液，冷凍干燥得到Zein--PDMDAAC 產(chǎn)品，稱重。調(diào)整DMDAAC 的質(zhì)量分數(shù)為12%、24%、36%，得到具有不同接枝率的產(chǎn)品 Zein--PDMDAAC-1、 Zein--PDMDAAC-2、Zein--PDMDAAC-3，具體見表1。合成機理如圖1所示。

表1 不同單體配比及接枝率

圖1 Zein-g-PDMDAAC合成示意圖

1.4 Zein-g-PDMDAAC@AVM的制備

AVM原藥溶解在無水乙醇中，制備10mg/mL的AVM乙醇溶液。分別取0.1g的Zein--PDMDAAC-1、Zein--PDMDAAC-2、Zein--PDMDAAC-3 溶 于3mL 70%乙醇水中，加入2mL AVM 乙醇溶液，將上述溶液加入95mL 去離子水的棕色錐形瓶中，攪拌30min得到Zein--PDMDAAC@AVM。

1.5 結構表征及性能測試

1.5.1 傅里葉紅外光譜（FTIR）

采用KBr壓片法，在450～4000cm光譜范圍內(nèi)掃描，分辨率為2cm。

1.5.2 掃描電鏡（SEM）

將Zein--PDMDAAC 樣品置于樣品臺上，吹干，在固體樣品的表面噴金。在氮氣保護下，加速電壓為5kV時觀察其微觀結構。

1.5.3 粒徑和zeta電位

取去離子水釋至低濃度的Zein--PDMDAAC溶液于比色皿中，用動態(tài)光散射技術測定樣品的平均粒徑和zeta電位。

1.5.4 包封率測試

取4mL 新鮮制備的Zein--PDMDAAC@AVM于離心管中，12000r/min 離心10min。用移液槍移取1mL 上清液置于25mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇定容。在波長為245nm 的紫外分光光度計下測定游離AVM 的吸光度。根據(jù)標準曲線公式=0.03037+0.00207（2=0.9997）計算AVM 的濃度，按式(1)計算對AVM的包封效率（，%）。

式中，為體系AVM 總質(zhì)量，g；為體系中未包封的阿維菌素質(zhì)量，g。

1.5.5 接觸角和葉面滯留量測試

配制2mg/mL的樣品溶液和AVM溶液，采用光學接觸角儀測量在黃瓜葉片上的接觸角。黃瓜葉片采摘后用去離子水沖洗干凈，放置干凈的玻片上晾干。用微量進樣器將不同樣品的溶液滴到葉子表面，記錄30s后的接觸角，每種樣品在葉片部位進行4次重復操作。

將沖洗后晾干的葉片裁成2cm×2cm，浸泡在樣品溶液15s后，用鑷子垂直提起至無液滴落下，放置分析天平稱重。滯留量（LHC）的計算如式(2)。

式中，和分別表示浸泡前后葉片的質(zhì)量，mg；表示葉片的表面積，cm。

1.5.6 抗紫外性能測試

將 Zein--PDMDAAC@AVM 和 10mg/mL 的AVM乙醇溶液分別用去離子水稀釋至100mg/L。將50mL不同的樣品溶液（100mg/L）同時放置在距離紫外光光源15cm 的光化學反應器中，用300W 汞燈照射（=365nm）。在一定的時間內(nèi)，移取1mL 樣品到棕色容量瓶中，用去離子水稀釋至10mL，并用紫外分光光度計測量245nm 處的吸光度。根據(jù)標準曲線公式=0.0317-0.00456（=0.998）算出AVM 的濃度，按式(3)計算對AVM 的殘留率（，%）。

式中，為AVM在溶液中的初始濃度；為不同光照時間后樣品中的AVM濃度。

1.5.7 緩釋性能測試

取Zein--PDMDAAC@AVM（5mL）于透析袋內(nèi)并置于100mL 棕色錐形瓶。加入50mL40%乙醇水溶液作為釋放介質(zhì)，錐形瓶置于26℃的搖床上。在一定的時間間隔內(nèi)取1mL 緩釋液于棕色容量瓶中，用40%乙醇水溶液稀釋至10mL。同時，將等體積的釋放介質(zhì)重新加入錐形瓶中，用紫外分光光度法在245nm處測定稀釋后的溶液的吸光度。按照標準曲線計算樣品在錐形瓶中的濃度，計算公式為=0.027348+0.00242（=0.9996）。然后根據(jù)式(4)計算AVM的累積釋放率（R，%）。

式中，C為每個樣品在不同時間間隔時AVM的濃度，mL；為錐形瓶中AVM的總質(zhì)量，g。

2 結果與討論

2.1 傅里葉紅外光譜

如圖2 所示，Zein 的曲線在1660cm出現(xiàn)酰胺Ⅰ帶的吸收峰和1540cm處出現(xiàn)酰胺鍵Ⅱ帶的吸收峰，N—H 彎曲振動峰吸收和C—N 吸收拉伸振動峰都出現(xiàn)在1450cm處；在DMDAAC 的曲線中，1647cm和1008cm處分別為C==C 和C—N 的伸縮振動峰，960cm為C—H 的吸收峰，1476cm處為與N鍵合的兩個甲基的特征峰；在Zein--PDMDAAC的曲線中，與N鍵合的兩個甲基的特征峰出現(xiàn)在1480cm處，1540cm酰胺Ⅱ帶的吸收峰消失，說明PDMDAAC接枝成功。

圖2 Zein、DMDAAC和Zein-g-PDMDAAC的紅外光譜圖

2.2 掃描電鏡分析

疏水的Zein在親水的PDMDAAC改性后，在水中可通過自組裝方式形成球狀顆粒，如圖3(a)所示，Zein--PDMDAAC 呈圓形或橢圓形；使用Image-Pro Plus 軟件對顆粒粒徑進行計算，結果如圖3(b)所示，平均粒徑在85nm 左右。與DLS 粒徑有差異，可能是由于兩種技術所涉及的原理不同，納米顆粒在DLS 測量時分散在水中，而SEM 測試則處于一個干燥的狀態(tài)。

圖3 Zein-g-PDMDAAC的掃描電鏡圖及其粒徑分布圖

2.3 粒徑、zeta電位、包封率分析

如表2 所示，因為DMDAAC 帶正電荷，所以隨DMDAAC加入量增加，電荷值由(18.01±0.86)mV增大到(27.71±1.30)mV；Zein 是一種親水基團較少的蛋白，當加入的DMDAAC 量較少時，顆粒容易團聚，故Zein--PDMDAAC-1@AVM 的粒徑較大；顆粒所帶正電荷越多，顆粒間的靜電排斥力越強，穩(wěn)定性越好，不易發(fā)生團聚，降低了顆粒大??；DMDAAC 具有交聯(lián)作用，隨著DMDAAC 加入量增加，其接枝率上升，顆粒的緊密程度也隨之增加，在水中的溶脹程度會較小，不利于捕獲AVM，故Zein--PDMDAAC-3@AVM的包封率也相對較低。

表2 不同DMDAAC添加量的Zein-g-PDMDAAC@AVM的粒徑、電位、包封率

2.4 接觸角分析

圖4 為水、 AVM 乙醇水溶液、 Zein--PDMDAAC@AVM 樣品在黃瓜葉片上的接觸角圖，水的接觸角大于90°，AVM乙醇水溶液的接觸角也接近90°，說明黃瓜葉片不能被兩者潤濕。Zein--PDMDAAC-1的接觸角比水的小，說明其能改變水的表面張力。隨著DMDAAC 添加量的增大，Zein-PDMDAAC 的接觸角由77.38°減小到64.60°，因為黃瓜葉面含有帶負電的脂肪醇和脂肪酸，Zein--PDMDAAC 電位的增大，與葉片的靜電作用力增強，故接觸角減小。

圖4 水(Ⅰ)、AVM乙醇水溶液(Ⅱ)、Zein-g-PDMDAAC-1@AVM(Ⅲ)、Zein-g-PDMDAAC-2@AVM(Ⅳ)、Zein-g-PDMDAAC-3@AVM(Ⅴ)在黃瓜葉片上的接觸角圖

2.5 葉面滯留

農(nóng)藥在噴施的過程中，因作物表面的脂質(zhì)層或蠟質(zhì)層，農(nóng)藥液滴易滾落會導致滯留量小。如圖5所示，黃瓜葉片上的滯留量結果和表面張力測試一致，Zein--PDMDAAC@AVM 比水的葉面滯留量明顯增大，其中Zein--PDMDAAC-3@AVM 的滯留 量 為33.69mg/cm。 一 方 面， 帶 正 電 荷 的PDMDAAC 與葉片存在靜電作用；另一方面，Zein--PDMDAAC-3 的粒徑小，比表面積大，進一步增強了與葉面的相互作用。因AVM 乙醇水溶液中含有乙醇，在葉片上的潤濕性較好，其葉面滯留量也會提高。

圖5 水(Ⅰ)、AVM乙醇水溶液(Ⅱ)、Zein-g-PDMDAAC-1@AVM(Ⅲ)、Zein-g-PDMDAAC-2@AVM(Ⅳ)、Zein-g-PDMDAAC-3@AVM(Ⅴ)在黃瓜葉片上的滯留量

2.6 抗紫外性能

殺蟲劑在應用于農(nóng)作物時可能會受到強烈太陽光照射，所以開發(fā)抗紫外線的農(nóng)藥制劑是必要的。如圖6 所示，在紫外燈照射下，未包封的AVM 降解率較高，在15min 左右已經(jīng)降解一半，在70min 時最終剩余13.9%，而被Zein--PDMDAAC包封的AVM 的半衰期則從15min 延長到40min，Zein--PDMDAAC-1、 Zein--PDMDAAC-2 和Zein--PDMDAAC-3 的半衰期分別為40min、46min 和47min，在70min 時的剩余率都高于26.9%，明顯提高了AVM的抗紫外性能。這是因為Zein--PDMDAAC 為AVM 提供了一個物理屏障外殼，隔絕了紫外線的照射，Zein含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，這些氨基酸的單元中的芳香基團和雙鍵可以吸收紫外線，阻礙了AVM的降解。

圖6 未包封阿維菌素及不同配比的Zein-g-PDMDAAC@AVM的抗紫外圖

2.7 緩釋性能

圖7 為加入不同量的DMDAAC 的緩釋曲線。曲線的走勢可分為3個階段，從開始到第9h的釋放速率較快，因為部分黏附在Zein--PDMDAAC 顆粒表面的AVM 釋放到緩釋體系中；在第24h 時，Zein--PDMDAAC-1 的累積緩釋率為54%，Zein--PDMDAAC-2 和Zein--PDMDAAC-3 的 累積緩釋率相差不大，分別為67%和69%，因為單體的接枝量較大，親水組分比例上升，降低了顆粒內(nèi)部的疏水作用，故其釋放速率較快；最后進入平臺期，累積緩釋率變化不大，Zein--PDMDAAC-1、Zein--PDMDAAC-2和Zein--PDMDAAC-3的最終緩釋率為57%、79%和75%。

圖7 不同配比的Zein-g-PDMDAAC@AVM的緩釋圖

2.8 緩釋動力學分析

為進一步研究樣品的釋放模式，采用Zeroorder、Higuchi、First-order 等動力學模型進行藥物緩釋數(shù)據(jù)擬合。結果如表3和圖8所示，用相關系數(shù)來確定各擬合曲線的適用性，其中First-order模型的相關程度最高，說明納米顆粒釋放AVM 是因為顆粒內(nèi)部和外部的濃度差，F(xiàn)irst-order 公式的和分別表示藥物的最大釋放能力和持續(xù)釋放速率。

表3 模型擬合參數(shù)

圖8 不同pH下的緩釋擬合模型

3 結論

將PDMDAAC接枝玉米醇溶蛋白，制備了不同接枝量的阿維菌素納米顆粒。接枝量最高的Zein-PDMDAAC-3@AVM 的包封率為34.75%，zeta 電位值大，具有較好的穩(wěn)定性；其接觸角為64.60°，滯留量為33.69mg/cm，提高了阿維菌素葉面沉積率；經(jīng)Zein--PDMDAAC 納米顆粒包封后，AVM的半衰期從15min 延長到40min。納米顆粒的緩釋數(shù)據(jù)與First-order 相關性較高，受PDMDAAC 的接枝量調(diào)控。該阿維菌素納米顆粒具有良好的緩釋性能和環(huán)境友好性。