常娜娜,張 政,阿木提喀日·馬木提,杜 菲,地麗胡瑪.阿吉,馬正海

新疆大學(xué)生命與科學(xué)技術(shù)學(xué)院,新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830046

天山北麓為冰雪消融及降雨匯集的山溪河流在天山北坡形成的淤積平原,具獨(dú)特的山地-綠洲-荒漠生態(tài)系統(tǒng)。解放后人們利用該區(qū)域內(nèi)天然形成的湖泊或洼地為庫址修建了大量的平原水庫和渠道,形成了規(guī)模巨大的水庫濕地群,促使農(nóng)墾事業(yè)迅速發(fā)展,該區(qū)域已成為新疆最大的綠洲農(nóng)耕區(qū),是國家糧、棉、糖、輕紡工業(yè)、能源等產(chǎn)業(yè)的重要基地和新疆重點(diǎn)發(fā)展地區(qū)。其中天山北麓中段位于準(zhǔn)噶爾盆地南緣,東起烏魯木齊市,西至烏蘇市,南起前山帶,北至庫爾班通古特沙漠邊緣,地形總體由南東向北西傾斜,冰雪消融和降水補(bǔ)給形成烏魯木齊河、瑪納斯河等河流,橫越其間的蘭新鐵路和連霍高速公路西段是亞歐大陸橋的重要區(qū)段和新疆“東聯(lián)西出”的重要通道,天山北麓中段也是新疆工農(nóng)業(yè)最發(fā)達(dá)和人口最集中的地區(qū)[1—3]。

天山北麓是干旱區(qū)山地生態(tài)系統(tǒng)和荒漠生態(tài)系統(tǒng)的交界地帶,是自然環(huán)境的敏感區(qū)域,其中尤以平原生態(tài)系統(tǒng)中水庫等濕地最為明顯,其穩(wěn)定性和抗干擾性極差[4],生物多樣性受自然條件和人類活動雙重影響而變的極為復(fù)雜。本研究選取天山北麓中段東端位于烏魯木齊市和五家渠市附近的八一水庫(BYW)、西端位于奎屯市附近的奎屯/車排子水庫(KCW)以及中部位于石河子市附近的蘑菇湖水庫(MGW)和位于新安鎮(zhèn)附近的安集海水庫(AJW)為典型樣點(diǎn)(圖1),以宏基因組學(xué)方法分析水庫細(xì)菌群落的組成特征及其功能,探討環(huán)境因素和人類活動對水庫細(xì)菌多樣性的影響,以期為該區(qū)域水庫濕地的生態(tài)保護(hù)和合理化利用提供參考依據(jù)。

圖1 采樣水庫的地理分布

1 材料與方法

1.1 研究樣點(diǎn)概述

MGW(44°29′N、85°57′E)位于石河子市西北18km處,是瑪納斯河流域庫容最大的水庫,承擔(dān)灌溉、養(yǎng)殖、調(diào)洪蓄水和納污等功能,水庫正常蓄水位為392m,庫容1.8億m3[3]。

KCW(44°49′N、85°15′E)由相鄰的兩個水庫組成,奎屯水庫位于奎屯市以北約60km,古爾班通古特沙漠西面的一座攔河水庫,以灌溉為主,兼有防洪和漁業(yè)養(yǎng)殖等功能,水庫正常蓄水位為3l6.9m,庫容5000萬m3；車排子水庫在奎屯水庫北側(cè)5km處,由奎屯水庫西泄水閘的引水渠進(jìn)水,庫容4000萬m3[5]。

AJW(44°35′N、85°48′E)位于塔城地區(qū)沙灣縣安集海鎮(zhèn)和新安鎮(zhèn)附近,主要引蓄巴音溝河和金溝河冬季閑水,以灌溉為主,兼有防洪功能,水庫正常蓄水位為462.8m,庫容4800萬m3[3]。

BYW (44°17′N、87°53′E)屬于烏魯木齊河流域,南側(cè)及西側(cè)緊靠烏魯木齊市米東區(qū)羊毛工鎮(zhèn),東側(cè)為甘莫公路,北靠新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)102團(tuán)團(tuán)部,距五家渠市24km,主要承擔(dān)農(nóng)業(yè)灌溉任務(wù),正常蓄水位為462 m,庫容3000萬m3[6]。

1.2 樣品采集

于2017年10月秋季枯水期末期采集BYW、MGW、AJW和KCW表層水樣,采水器和容器均經(jīng)消毒滅菌,每個水庫根據(jù)水域結(jié)構(gòu)選6個采樣點(diǎn),采樣點(diǎn)間隔500m以上,每點(diǎn)采樣500mL,之后混合為3L水樣,其中奎屯水庫和車排子水庫各選3個采樣點(diǎn),采樣后合并為一份水樣。樣品于-20℃便攜式冰箱保存,于當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,儲存于-80℃冰箱備用。

1.3 水庫水樣中細(xì)菌的收集

凍存水樣于冰水浴中融化后,三層滅菌紗布過濾除去顆粒雜質(zhì),300rpm離心10min除去細(xì)小顆粒雜質(zhì),最后10000×g離心30min,收集的細(xì)菌沉淀于-80℃保存。樣品送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行細(xì)菌宏基因組高通量測序。

1.4 細(xì)菌DNA的提取及PCR擴(kuò)增

細(xì)菌沉淀經(jīng)CTAB法提取總DNA,瓊脂糖凝膠電泳和Qubit2.0熒光定量儀檢測DNA的純度和濃度,DNA稀釋至1ng/μL。以此DNA為模板,使用帶Barcode的16SrDNA V3—V4區(qū)引物341F(CTAYGGGRBGCASCAG)和805R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收PCR產(chǎn)物。

1.5 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 2.0熒光定量儀定量和文庫檢測合格后,使用Illumina MiSeq測序平臺測序。

1.6 宏基因組數(shù)據(jù)分析

使用Uparser軟件(Uparse v7.0.1001,http://drive5.com/uparse/)進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)聚類,按照97%的序列相似性得到 OTUs 代表序列,篩選每個OTU的代表序列進(jìn)行不同分類水平上的物種注釋。利用 Muthur軟件進(jìn)行α多樣性指數(shù)(Shannon,Simpson,Chao1,Ace)計算及聚類分析,繪制稀釋曲線以評價測序所獲水樣菌群種類的覆蓋度以及細(xì)菌的多樣性。使用 Unweighted Unifrac算法計算樣本間距離,獲得的距離矩陣用于β多樣性分析,以探討4個水庫水樣菌群組成的相關(guān)性。為了探究天山北麓中段4個水庫菌群的代謝功能,利用PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)軟件和KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測宏基因組測序數(shù)據(jù)的功能基因組成。用R語言工具和Excel軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 水庫細(xì)菌OTU及α多樣性分析

測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制后,共計得到316686條有效序列,以97%的序列一致性將序列共聚類成431個OTUs。由稀釋性曲線可知,隨測序數(shù)量增加OTU數(shù)量趨于平緩(圖2),表明測序深度能夠覆蓋水樣中所有菌群并滿足分析要求,且AJW的細(xì)菌種類較為豐富。4個水庫比較而言,AJW獲得的OTUs數(shù)量(337個)以及Shannon和Chao1指數(shù)(5.23和325.7)均明顯高于另3個水庫,且KCW、BYW和MGW的OTU數(shù)量和α多樣性指數(shù)均接近。以上結(jié)果表明,AJW細(xì)菌群落的豐度和多樣性均高于另3個水庫(表1)。

圖2 稀釋曲線

表1 水庫水樣菌群α多樣性指數(shù)

2.2 水庫細(xì)菌β多樣性分析

以Unweighted Unifrac距離矩陣分析樣品間的相異系數(shù),結(jié)果表明,AJW與BYW、MGW以及KCW的相異系數(shù)分別為0.520、0.589和0.502,而另3個水庫之間的相異系數(shù)在0.363—0.386之間,說明在菌群組成方面,KCW、BYW和MGW間相似,而AJW和其他水庫間的差異較大(圖3)。

圖3 水庫水樣菌群距離矩陣熱圖

2.3 水庫菌群組成分析

4個水庫在細(xì)菌門分類水平上共鑒定出18個菌門(圖4),其相對豐度在不同水庫間存在差異。變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在4個水庫中的豐度均為最高,變形桿菌的相對豐度在21.29%—43.79%之間,擬桿菌門的相對豐度在28.28%—77.63%之間。另外,厚壁菌門在AJW和MGW的相對豐度分別達(dá)到24.46%和27.61%,放線菌門(Actinobacteria)在AJW中的相對豐度為11.36%。鑒定出的菌門還包括藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)等。

在細(xì)菌綱分類水平上,4個水庫共鑒定出38個菌綱,相對豐度前10的菌綱如圖4所示,大多隸屬擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門,其中擬桿菌門中的黃桿菌綱(Flavobacteriia)在4個水庫均為優(yōu)勢菌,相對豐度在32.16%—77.34%之間。變形菌門下屬菌綱在不同水庫中的相對豐度差異較大,γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)的相對豐度在MGW和BYW中較高,分別達(dá)到41.68%和25.94%,α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)分別于AJW和KCW中具有較高豐度,分別為15.32%和15.24%。芽孢桿菌綱(Bacilli)在AJW和MGW中具有較高豐度,分別達(dá)到24.46%和27.61%。相對豐度前10的菌綱還包括酸微桿菌綱(Acidimicrobiia)、纖維粘網(wǎng)菌(Cytophagia)、葉綠體綱(Chloroplast)以及未鑒定的放線菌(Actinobacteria)和藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria),其主要存在于AJW。

在細(xì)菌屬分類水平上,4個水庫共鑒定出181個菌屬,其中AJW的細(xì)菌種類(146個菌屬)明顯多于另3個水庫。圖4顯示了相對豐度前10的菌屬,黃桿菌屬(Flavobacterium)在4個水庫均為優(yōu)勢菌,相對豐度在27.66%—77.32%之間。除黃桿菌屬外,各水庫的菌群組成存在較大差異,相對豐度較高的包括AJW的動性桿菌屬(Planomicrobium)、KCW的馬賽菌屬(Massilia)、MGW的不動桿菌屬(Acinetobacter)和動性桿菌屬以及BYW的假單胞菌屬(Pseudomonas)和嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)。相對豐度前10的菌屬還包括主要存在于AJW的CL500- 29_marine_group、根瘤菌屬(Rhizobium)和微小桿菌屬(Exiguobacterium)以及主要存在于BYW的類芽孢八疊球菌屬(Paenisporosarcina)。

圖4 水庫水樣菌群組成

2.4 預(yù)測功能的多樣性

利用PICRUSt軟件和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋水庫菌群的功能。功能基因通路分析表明(圖5),4個水庫菌群代謝功能相關(guān)基因的相對豐富最高,均達(dá)到50%左右,另外遺傳信息處理、信號傳遞和細(xì)胞生長相關(guān)的功能基因亦較豐富,說明水庫菌群生長旺盛。次生代謝功能基因分析表明(圖5),4個水庫菌群氨基酸代謝(21.28%—22.47%)、碳水化合物代謝(17.82%—19.92%)和能量代謝(10.75%—11.66%)相關(guān)基因的相對豐富較高,其次為輔酶因子與維生素代謝(8.16%—8.65%)、脂質(zhì)代謝(7.42%—8.46%)和核苷酸代謝(6.61%—7.05%)相關(guān)基因,同樣說明水庫菌群生長旺盛。另外,4個水庫菌群中環(huán)境異生物降解代謝(xenobiotic biodegradation and metabolism)相關(guān)基因的相對豐度在6.09%—7.86%之間,環(huán)境異生物降解功能基因的細(xì)分注釋和分析表明(圖5),4個水庫菌群苯甲酸(15.6%—18.12%)、氨基苯甲酸酯(10.98%—12.54%)、氯烷烴和氯烯烴(8.29%—9.36%)、萘(7.78%—8.18%)降解相關(guān)基因的相對豐度均較高,此外,還含有硝基甲苯、二惡英、乙苯、二甲苯、莠去津、苯乙烯、多環(huán)芳烴、對氟苯甲酸乙酯等降解相關(guān)的基因(圖5)。

圖5 基于KEGG分析的功能基因分類及豐度

3 討論

水體中微生物群落結(jié)構(gòu)特征會隨著富營養(yǎng)程度和污染水平等多種環(huán)境因素的變化而變化,同時,水環(huán)境中微生物群落組成和多樣性亦能反映水質(zhì)狀況,可作為水環(huán)境生態(tài)質(zhì)量的評價指標(biāo)[7—8].本文基于宏基因組學(xué)方法分析天山北麓4個水庫細(xì)菌的多樣性,選取的4個水庫均受到農(nóng)牧漁業(yè)以及工業(yè)等人類活動干擾,且干擾因素和干擾程度存在一定差異,其中AJW位于安集海鎮(zhèn)附近,主要功能是灌溉和調(diào)洪蓄水；BYW臨近烏魯木齊市城郊,周邊交通網(wǎng)密集,零散有工業(yè)區(qū),并接納了部分污水；MGW位于石河子市附近,承擔(dān)灌溉、養(yǎng)殖和調(diào)洪蓄水功能之外還接納了石河子地區(qū)的工業(yè)和生活污水；KCW位于奎屯市附近,灌溉和調(diào)洪蓄水的同時還大力發(fā)展?jié)O業(yè),且緊鄰大面積的棉田。研究結(jié)果表明4個水庫菌群結(jié)構(gòu)存在差異,其中AJW菌群的多樣性和豐度高于另3個水庫,以上差異主要是由于水庫周邊環(huán)境和人類活動干擾等因素的差異所致。

在門分類階元上,變形桿菌和擬桿菌門在4個水庫的豐度最高,這兩個菌門均廣泛棲息于土壤和水環(huán)境中,前期亦有報道其在多種水環(huán)境中含量較高,具有富集酸性氨基酸、水解纖維素和有機(jī)化合物礦化等功能[9—10]。同時,研究也發(fā)現(xiàn)各菌門在4個水庫中的相對豐度存在差異,擬桿菌門在KCW和BYW中的相對豐度較高,變形桿菌在MGW的相對豐度較高,厚壁菌門在AJW和MGW中的相對豐度較高,放線菌門在AJW的豐度較高,以上差異可能與各水庫水質(zhì)、纖維素等碳水化合物含量以及受周邊農(nóng)牧業(yè)、工業(yè)和居住人群影響等因素有關(guān),如高豐度的變形桿菌和擬桿菌與水環(huán)境中蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān),漁業(yè)和排污均可導(dǎo)致水庫中有機(jī)質(zhì)含量的增加,同時,變形桿菌和擬桿菌亦可降解和轉(zhuǎn)化水環(huán)境中的有機(jī)質(zhì),從而維持和改善水質(zhì)。

從綱分類階元,擬桿菌門中的黃桿菌綱在4個水庫均為優(yōu)勢菌,據(jù)報道該菌是多種水環(huán)境中的優(yōu)勢菌群[11—13]。變形菌門中的β-變形菌綱類群是河流、湖泊和水庫等淡水環(huán)境的重要組成部分[14]。本研究中變形菌門下屬菌綱在不同水庫中的相對豐度差異較大,β-變形菌綱在KCW中的相對豐度較高,為15.24%,而在其余3個水庫中的相對豐度很低,僅為0.69%—4.13%；α-變形桿菌綱在AJW中的相對豐度較高,為15.32%；γ-變形菌綱的相對豐度在MGW和BYW分別達(dá)到41.68%和25.94%,遠(yuǎn)高于另兩個水庫。γ-變形菌在污染的水和土壤中相對含量較高[16—18],并包括一些重要的病原菌屬,根據(jù)Zwart等人的研究,γ-變形菌綱是水環(huán)境浮游細(xì)菌的短暫成員,由周圍環(huán)境帶來,常常是最適應(yīng)污染環(huán)境的菌株[19]。以上變形菌綱的含量差異說明各水庫水質(zhì)和受污染程度的不同,其中MGW和BYW水質(zhì)較差。另外,變形菌綱菌群數(shù)量與水環(huán)境的溫度相關(guān)[20—21],本研究于10月中下旬秋末采樣,水溫較低也會導(dǎo)致α和β變形菌綱菌群豐度下降。另外,酸微桿菌綱、葉綠體綱、放線菌綱和藍(lán)細(xì)菌在安集海水庫中的相對豐度都明顯高于另3個水庫,說明AJW細(xì)菌多樣性更為豐富,同時,放線菌綱、酸微桿菌綱和葉綠體綱細(xì)菌還具有重要的生態(tài)功能[22—23],在維持水體的水質(zhì)狀況中發(fā)揮重要作用。

在屬分類階元上,黃桿菌屬在4個水庫均為優(yōu)勢菌,該菌屬在自然界各類環(huán)境中的分布極為廣泛,在水環(huán)境中具有重要的功能[13,15,24]。從圖4C所示的菌屬豐度來看,高豐度菌屬在4個水庫中的含量同樣差異較大,不動桿菌和假單胞菌同屬γ-變形菌綱,其在富營養(yǎng)水體中的含量較高[19],本研究中兩者分別于MGW和BYW中具有較高的豐度；而屬于β變形菌綱的馬賽菌屬在KCW的豐度較高,據(jù)報道馬賽菌的含量在氮、磷濃度較高的環(huán)境中會增加[25],KCW發(fā)展?jié)O業(yè)以及緊鄰大面積棉田都可能增加水體中的氮、磷濃度,并導(dǎo)致馬賽菌屬含量增加。動性桿菌屬在AJW和MGW中的相對豐度較高,據(jù)報道該菌具嗜鹽性,在稀土-重金屬復(fù)合污染土壤中的豐度明顯增高。嗜冷桿菌在BYW、MGW和AJW的相對豐度分別為11.59%、6.24%和4.76%,該菌多于低溫環(huán)境中生長,曾從南極和北極海冰等寒冷環(huán)境中分離到[26—28],推測水庫中較高豐度的嗜冷桿菌可能源于天山冰雪中的細(xì)菌,并隨冰雪融化注入水庫,另外,本研究于秋末采樣,低水溫也將促使該菌相對豐度的增加。CL500- 29_marine_group和微小桿菌屬在AJW的相對豐度較高,據(jù)報道CL500- 29_marine_group與溶解氧等水質(zhì)指標(biāo)呈正相關(guān)[29—30],微小桿菌屬存在于多種極端環(huán)境,并參與環(huán)境污染的生物修復(fù)[31—32],兩者均有利于水質(zhì)和菌群多樣性的維持。

功能基因通路分析和次生代謝功能基因分析的結(jié)果顯示,與細(xì)菌生長相關(guān)的各類代謝以及遺傳信息處理、信號傳遞和細(xì)胞生長等功能基因豐度均較高,說明水庫中細(xì)菌生長旺盛。環(huán)境異生物降解功能基因分析的結(jié)果顯示,苯甲酸、氨基苯甲酸酯、氯烷烴和氯烯烴、萘降解代謝相關(guān)功能基因在4個水庫菌群中的相對豐度均較高,另外還含有多種芳香族化合物降解代謝的相關(guān)功能基因,各水庫菌群降解環(huán)境異生物的種類亦有差異,芳香族化合物(包括苯甲酸、萘、乙苯、對氟苯甲酸乙酯)降解相關(guān)功能基因在MGW的相對豐度較高,有機(jī)氯化合物(包括氯代烷烴和氯代烯烴、環(huán)氯己烷及氯苯)降解相關(guān)功能基因在KCW的相對豐度較高。由于細(xì)菌對環(huán)境異生物具有趨化性,即細(xì)菌感應(yīng)、趨向(或趨離)并降解環(huán)境污染物的特性[33—34],故環(huán)境污染物含量和菌群降解污染物功能基因的含量呈正相關(guān),就本研究而言,水庫菌群含有芳香族和有機(jī)氯等化合物降解相關(guān)基因,說明水庫可能存在相應(yīng)污染。據(jù)文獻(xiàn)報道,假單胞菌屬、放線菌、分枝桿菌屬、微球菌屬、棒狀桿菌屬、弧菌屬、黃桿菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬等細(xì)菌均能降解污染有機(jī)物[35—37],本研究顯示假單胞菌屬、黃桿菌屬和不動桿菌屬以及芽孢桿菌綱為水庫的優(yōu)勢菌或豐度較高的菌群,這些菌群具有趨向和降解污染物的功能,可能在水庫污染物的生物修復(fù)中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

天山北麓中段4個水庫菌群組成有一定的共性,在門分類階元上優(yōu)勢菌為變形菌門和擬桿菌門,在綱分類階元上優(yōu)勢菌為黃桿菌綱,在屬分類階元上優(yōu)勢菌為黃桿菌屬。同時,各水庫菌群組成存在較大差異,在變形菌門中,γ-變形菌綱的相對豐度在MGW和BYW較高,α-變形菌綱和β-變形菌綱分別于AJW和KCW具有較高豐度；芽孢桿菌綱在AJW和MGW具有較高豐度,AJW含有利于維持水質(zhì)和菌群多樣性的放線菌綱、酸微桿菌綱和葉綠體綱以及微小桿菌屬和CL500- 29_marine_group。以上菌群的結(jié)構(gòu)特征與水庫水源、周邊環(huán)境和人類活動等因素相關(guān)。菌群功能基因分析顯示水庫菌群含有芳香族和有機(jī)氯等化合物降解相關(guān)基因,其可能在污染物的降解和生物修復(fù)中發(fā)揮作用。