馮發(fā)運,王 亞,岳遠浩,李俊霞,孫 星,程金金,葛靜,余向陽,*

1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院,農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,南京 210014

2 省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室,南京 210014

3 青島科技大學,青島 266042

4 福建農(nóng)林大學,福州 350002

植物根系是聯(lián)系植物與土壤微生態(tài)環(huán)境的紐帶,保持根際微生態(tài)系統(tǒng)活力對植物主動適應(yīng)和抵御污染物脅迫意義重大[1]。在水稻等作物栽培管理過程中,大量農(nóng)藥未能起到防治靶標的作用,而是直接散落到環(huán)境[2]；據(jù)研究統(tǒng)計,施入農(nóng)田的農(nóng)藥有70%進入作物所在土壤[3],隨著土壤農(nóng)藥殘留累積含量的增加,作物的根際微生態(tài)也可能遭受污染物脅迫。多菌靈(Carbendazim,化學名稱為N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯)是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量使用的一種重要的殺菌劑,近年來在農(nóng)產(chǎn)品中檢出率較高[4—5],其在農(nóng)田環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的殘留風險問題也逐漸受到關(guān)注。多菌靈在稻田土壤中很難遷移及降解,在水稻收獲期前14 d依然能夠檢出[2]。殘留累積于農(nóng)田環(huán)境中的多菌靈污染長期威脅土壤健康,不僅對稻區(qū)生態(tài)環(huán)境中的蚯蚓等有益生物帶來毒害[6—7],同時降低了土壤微生物群落的生物量及功能多樣性[8],還會通過植物根部、葉部和籽粒累積進入食物鏈[9],最終污染如糙米、米糠及精白米等農(nóng)副產(chǎn)品[10—11],對人類和畜禽健康造成危害。因此,探索有效的環(huán)境污染修復(fù)和農(nóng)作物中殘留消減途徑有重要意義。

利用內(nèi)生降解菌協(xié)同提升環(huán)境污染物的植物修復(fù)效率,降低農(nóng)作物中農(nóng)藥等有機污染物的殘留累積,是農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境治理和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制領(lǐng)域的一項有益探索工作。利用植物內(nèi)生菌定殖在植物根表及組織內(nèi)形成互利共生體系,不僅可降低外界環(huán)境及微生物競爭對其污染物降解功能的影響[12],內(nèi)生菌分泌的植物促生因子還能提高宿主對不利環(huán)境脅迫的耐受能力[13],而宿主植物的表型特性又會通過根際互作影響土壤微生態(tài)的健康,進一步促進殘留有機污染物的降解、維持土壤微生物多樣性及穩(wěn)定性[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),具有農(nóng)藥降解功能的內(nèi)生菌定殖水稻后,不僅可促進污染脅迫條件下水稻植株的生長,還可加速植株殘留農(nóng)藥的消解,降低稻田土壤、水稻植株以及稻谷中的農(nóng)藥殘留量[15—16]。然而,關(guān)于接種降解性內(nèi)生菌對原位土壤微生態(tài)影響的研究卻鮮有報道。根際微生態(tài)尤其是土壤動物及微生物成員對植物接種內(nèi)生降解菌的響應(yīng),是評價內(nèi)生菌-植物互作模式用作農(nóng)藥污染修復(fù)手段安全性與合理性的重要依據(jù)。本文以盆栽土培方式模擬水稻大田生長環(huán)境,研究內(nèi)生降解菌StenotrophomonaspavaniiDJL-M3定殖對多菌靈暴露下水稻根際微生態(tài)中原生動物(蚯蚓)的脅迫耐受性,根際微生物群落代謝功能多樣性和土壤酶活性的影響,結(jié)果為全面揭示內(nèi)生降解菌在農(nóng)田生態(tài)修復(fù)中的作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻內(nèi)生菌：分離自水稻植株根部,對多菌靈具有較高耐藥性及降解能力,同時具備良好的植物促生長特性,經(jīng)生理生化試驗及16S rRNA 同源化比對分析,鑒定其為寡養(yǎng)單胞菌屬(StenotrophomonaspavaniiDJL-M3),該菌株已送中國普通微生物菌種保藏管理中心保存(保藏號：CGMCC No.21198)。

水稻：品種為南粳5055,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提供。

蚯蚓：赤子愛勝蚯蚓(Eiseniafoetida)購自江蘇省句容市王軍蚯蚓養(yǎng)殖場,每條體重約300 mg,體長約60 mm,經(jīng)實驗室預(yù)培養(yǎng)后挑選帶環(huán)明顯,大小基本一致的健康成蚯,試驗前清腸24 h。

土壤：采集自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院水稻田,其基本理化性質(zhì)為：pH 5.97,總有機質(zhì)含量66.8 g/kg 干土,氮含量 0.36%,碳含量49.61%,氫含量5.72%,硫含量0.01%,氧含量44.37%。土樣自然風干后過50目網(wǎng)篩去除大顆粒石子備用。水稻栽培過程中噴灑無菌水以保持約60%含水量。

多菌靈：多菌靈可濕性粉劑購自江陰福達農(nóng)化股份有限公司,其有效成分含量為50%。

1.2 試驗設(shè)計

水稻苗在育秧盤上生長至三葉一心(約15 cm)后選取10株移栽至直徑15 cm,高25 cm 的塑料盆缽,每盆含500 g稻田土并均勻放養(yǎng)10只蚯蚓。按表1 的方式設(shè)置空白處理組(Control),內(nèi)生菌接種的多菌靈處理組(CBZ-M3)與未接菌的多菌靈處理組(CBZ)。其中水稻內(nèi)生多菌靈降解菌DJL-M3預(yù)經(jīng)胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)富集過夜培養(yǎng)后,用無菌磷酸緩沖液PBS(pH 7.0)清洗并重懸成OD600 nm值為1.0的菌懸液,取30 mL 菌液澆灌水稻根部進行接種處理。按照推薦劑量(120 g/hm2)對盆栽水稻噴施多菌靈藥劑,于施藥后2 h、1 d、3 d、7 d 及14 d采集水稻根際土壤并用液相色譜儀分析不同處理下水稻根際土壤多菌靈的降解規(guī)律,獲得最終殘留含量(14 d)并計算降解半衰期,稻田土壤多菌靈的提取及檢測參照劉雙雙等[10]建立的方法。藥劑處理后為了防止蚯蚓逃離,用保鮮膜封住每個盆缽頂部,僅留水稻地上部分于外界,并用移液槍頭在保鮮膜上隨機扎上氣孔。每個處理6個重復(fù)。整個試驗在溫室條件(光照16 h/黑暗8 h,30℃/25℃)下進行,在多菌靈噴施后定期收集根際土壤,進行土壤酶活檢測與微生物群落多樣性分析,施藥兩周后結(jié)束試驗,同時將盆缽?fù)恋怪没厥赵囼烌球?統(tǒng)計存活率、測定其解毒酶活性。

表1 試驗水稻處理方式

1.3 水稻根際土壤收集和酶活測定

根際土壤樣品的采集參照李依韋等[17]的方法并做適當調(diào)整,分別在多菌靈藥劑噴施1 d,3 d,7 d和14 d 后在盆缽中隨機挑選一株水稻苗整體挖出,首先抖掉與根系結(jié)合松散的土壤,然后用毛刷將與根系緊密結(jié)合的土壤刷下來裝入無菌袋,每個處理中的6盆水稻進行兩兩隨機混合形成3個平行待測樣品,并立即進行土壤酶活性的測定。土壤過氧化氫酶(S-CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測定；土壤脲酶(URE)活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定；土壤蔗糖酶(SAC)活性則采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定[18]。

1.4 蚯蚓脅迫耐受能力分析

在多菌靈藥劑噴施2周后,將盆缽倒置收集蚯蚓,統(tǒng)計每個盆缽中蚯蚓的存活率,并通過檢測存活蚯蚓體內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)與乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)活性來分析多菌靈殘留對蚯蚓的過氧化損害程度。其中蚯蚓SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶-羥胺法,MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測定,用蚯蚓體內(nèi)對三硝基苯(TNB)顏色深淺進行比色定量分析AChE活性。具體酶活測定方法參照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒[19]。

1.5 根際土壤微生物群落代謝功能多樣性分析

同1.3 方法采集多菌靈暴露14 d后的新鮮水稻根際土壤,并使用BIOLOG公司的ECO生態(tài)板分析不同處理下水稻根際土壤中微生物對31種碳源的代謝指紋圖譜,接菌液的制備參照趙倩等[20]的方法。接種好的生態(tài)板在28℃恒溫培養(yǎng)箱(黑暗環(huán)境)中連續(xù)培養(yǎng)10 d,每隔24 h用酶標儀測定OD590nm下吸光度變化來表征土壤中微生物對各種碳源的代謝活性。土壤微生物群落利用碳源的整體能力用平均顏色變化率(Average Well Color Development, AWCD)表示,微生物群落功能多樣性采用香農(nóng)指數(shù)Shannon-wiener Index,優(yōu)勢度指數(shù)Simpson Index,均勻度指數(shù)Pielou Index和McIntosh Index進行分析[21]。具體計算公式如下：

(1)

H=-∑Pi(lnPi)

(2)

D=1-∑Pi2

(3)

J=H/lnS

(4)

(5)

式中,H為Shannon指數(shù)；D為Simpson指數(shù)；J為Pielou指數(shù)；U為McIntosh指數(shù)；Ci為第i個非對照孔的吸光值,R為對照孔的吸光值；Pi表示第i個非對照孔的相對吸光值與所有非對照孔的相對吸光值總和的比值,即Pi=(Ci-R)/∑ (Ci-R)；S為被利用的碳源總數(shù)；ni表示第i個孔的相對吸光值,即ni= (Ci-R)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Windows Microsoft Excel 2003對本試驗生物學數(shù)據(jù)進行初步整理,求和與標準差計算。繪圖、顯著差異性分析及主成分分析由Origin 2018軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根際土壤酶活性變化

如圖1所示,多菌靈施用顯著激活水稻根際土壤中過氧化氫酶的活性,其在藥劑噴施后的第1天便達到最高水平,在CBZ組中的酶活力是Control組的2.28倍,DJL-M3接種能夠?qū)⒍嗑`暴露下水稻根際土壤中被激活的過氧化氫酶活力降低41.06%。水稻根際土壤中過氧化氫酶活性隨著施藥時間推移而降低,但在整個檢測周期內(nèi)CBZ組中過氧化氫酶活性一直顯著高于Control組與CBZ-M3組。

圖1 不同處理下水稻根際土壤過氧化氫酶活性

多菌靈在施藥后第1天就顯示出對土壤脲酶的抑制作用,如圖2所示,相比較于Control組,多菌靈脅迫(未接菌)導(dǎo)致水稻根際土壤脲酶活性降低27.56%,而DJL-M3接菌能夠緩解多菌靈對根際土壤脲酶的抑制效應(yīng),將被抑制的酶活性提升10.76%。CBZ-M3組土壤脲酶活性在第3天便恢復(fù)到與Control組差異不顯著水平,而此時CBZ組土壤脲酶活性依舊顯著低于Control組69.51%,雖然其在第3天后有所提高,但在整個檢測周期中一直顯著低于其他兩個處理組。

圖2 不同處理下水稻根際土壤脲酶活性

如圖3所示,多菌靈暴露對水稻根際土壤蔗糖酶的影響與脲酶類似,在多菌靈噴施1 d 后CBZ組中土壤蔗糖酶活性分別較Control組和CBZ-M3組降低82.57%與63.14%,DJL-M3水稻接種能夠促進根際土壤蔗糖酶活性的恢復(fù),而CBZ組與Control組的酶活差異在第3天達到最大(89.53%),在14 d 的試驗周期中多菌靈脅迫處理組水稻根際土壤蔗糖酶活性一直顯著低于Control組水平。

圖3 不同處理下水稻根際土壤蔗糖酶活性

2.2 水稻根際土壤中蚯蚓對多菌靈脅迫的耐受性

水稻在噴施多菌靈藥劑1 d 后便對根際環(huán)境中的蚯蚓造成了脅迫壓力,致使蚯蚓出現(xiàn)逃逸現(xiàn)象,而CBZ-M3組則無此現(xiàn)象。在多菌靈噴施兩周后將水稻土壤全部傾倒收集蚯蚓,首先觀察其形態(tài)特征及活性。相比較于Control組,CBZ組中的蚯蚓體色發(fā)暗,活動遲緩,體型明顯偏瘦偏短,部分蚯蚓個體出現(xiàn)生殖帶腫脹、出血及尾部斷節(jié)現(xiàn)象。而CBZ-M3組的蚯蚓除了體型偏瘦,其他特征與Control組沒有顯著差異(圖4)。進一步統(tǒng)計不同處理組中蚯蚓的存活率及所受氧化脅迫程度 (表2),發(fā)現(xiàn)經(jīng)過14 d 的自然稻田土暴露,多菌靈能夠誘導(dǎo)蚯蚓機體積累MDA,而DJL-M3接菌能夠顯著減少水稻根際蚯蚓體內(nèi)MDA含量。同樣地多菌靈暴露能夠顯著刺激蚯蚓體內(nèi)AchE活性,接種內(nèi)生菌DJL-M3可一定程度上緩解該刺激作用。CBZ組中蚯蚓的T-SOD顯著高于Control組,而CBZ-M3組與Control組差異不顯著。與蚯蚓氧化脅迫指標相對應(yīng)的是,CBZ組的蚯蚓存活率顯著低于Control組,CBZ-M3組蚯蚓的存活率雖然也低于Control組,但差異并不顯著。這些結(jié)果表明,多菌靈土壤殘留能對水稻根際周遭的蚯蚓造成一定的毒害,誘導(dǎo)氧化損傷而降低其生存能力,在水稻根部接種具多菌靈降解特性的水稻內(nèi)生菌能夠顯著緩解根際多菌靈暴露對蚯蚓的脅迫傷害。

圖4 不同處理下水稻根際蚯蚓的表觀形態(tài)

表2 不同處理方式對蚯蚓存活率及氧化脅迫程度影響

2.3 水稻根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性

如圖5所示,在10 d 的培養(yǎng)周期中,AWCD的最大值及變化速率均呈現(xiàn)Control>CBZ-M3>CBZ 的趨勢,多菌靈藥劑噴施2 d后,污染土壤微生物AWCD值顯著低于未噴施多菌靈的Control組(P<0.05)。說明多菌靈暴露能夠顯著降低土壤微生物的活性。培養(yǎng)7 d后,各處理組的AWCD值變化率趨于穩(wěn)定,同一處理組中的AWCD增長已不顯著,雖然此時Control組的AWCD值依然高于其他兩個多菌靈脅迫處理組,但與CBZ-M3組不具有顯著差異性(P>0.05),這表明降解菌DJL-M3接種水稻能在一定程度上提高土壤微生物活性,緩解多菌靈脅迫對水稻根際微生態(tài)的負面影響。

圖5 不同處理組中水稻根際土壤微生物的AWCD值變化

我們假設(shè)多菌靈暴露7 d后水稻根際微生物群落結(jié)構(gòu)已經(jīng)穩(wěn)定,以該時間點所測量的吸光值(OD590 nm)計算各處理組的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Pielou指數(shù)和McIntosh指數(shù)分析土壤微生物群落功能多樣性,結(jié)果如表3所示,多菌靈脅迫對水稻根際土壤Pielou指數(shù)沒有顯著影響,但能顯著降低Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)(P<0.05),而接種DJL-M3能夠在一定程度上提高Shannon指數(shù)和McIntosh指數(shù)。

表3 不同處理方式下水稻根際土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

2.4 水稻根際土壤微生物碳源代謝特征

圖6 不同處理組中水稻根際土壤微生物碳源代謝主成分分析

為了分析根際微生物群落多樣性差異背后特定的碳源代謝情況,同樣選取3個處理組土壤在培養(yǎng)7 d后微生物對31種碳源的AWCD值進行主成分(PCA)分析,提取2個主成分,其中第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的方差貢獻率分別為93%和7%,累計貢獻率達100%,可以全面反映根際微生物碳源代謝能力的分異特征。結(jié)果如圖6所示,Control組在PC1上得分最高,而CBZ-M3組在PC2上得分則明顯高于其他兩組,這說明無論是多菌靈暴露還是外源降解內(nèi)生菌的引入都會極顯著地改變水稻根際微生物組對土壤碳源的代謝能力；Control組和CBZ-M3組都位于PC1軸正方向,它們之間的距離也要比同處于PC1軸與PC2軸負方向的CBZ組要近,這表明Control組和CBZ-M3組的根際微生物對碳源的利用能力更為相似。

為了進一步分析不同處理水稻根際微生物的代謝功能類群,我們將Biolog-ECO 板上31種碳源在7 d測定的AWCD值進行熱圖繪制,以此表征不同處理水稻根際微生物碳代謝指紋圖譜,結(jié)果如圖7所示?？傮w上,Control組中根際土壤微生物對碳源的整體利用能力最強,CBZ-M3組次之,CBZ組最弱。在6大類碳源中,多菌靈暴露能夠顯著降低根際土壤微生物對糖類、氨基酸類、酯類、醇類及酸類中2-羥基苯甲酸的利用能力,對胺類碳源的影響則不顯著(P>0.05)。有趣的是,內(nèi)生菌DJL-M3的引入也會改變水稻根際土壤微生物的碳源代謝特性,其顯著提高了糖類中α-D-乳糖、葡萄糖- 1-磷酸鹽、α-環(huán)狀糊精和肝糖,酯類中的吐溫80、丙酮酸甲酯以及酸類中D-氨基葡萄糖酸的利用能力,但卻顯著降低了根際土壤微生物組對L-蘇氨酸、D,L-α-磷酸甘油、N-乙酰基-D-葡萄胺及酸類中D-蘋果酸的利用能力。

圖7 不同處理下水稻根際土壤微生物對31種碳源代謝的指紋圖譜

3 討論

3.1 DJL-M3對多菌靈暴露下水稻根際土壤酶活性的影響

土壤酶是土壤重要組成部分之一,其參與土壤中絕大多數(shù)生化過程,包括營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量代謝和污染物凈化等[3]。其中,過氧化氫酶主要分解土壤中過度累積的過氧化氫,降低其對植物根系及生物體的毒害作用；脲酶是土壤中唯一一種能將尿素轉(zhuǎn)化為有效氮的酰胺酶,酶促尿素水解成氨,為植物生長提供氮源；蔗糖酶作為評價土壤熟化程度和肥力水平的常規(guī)指標之一,其可以把土壤中高分子量的蔗糖轉(zhuǎn)化成能被植物和土壤微生物吸收利用的易溶性營養(yǎng)物質(zhì),從而為土壤生物體提供能源及提高土壤生物學活性[22]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)多菌靈噴施刺激了水稻根際土壤中過氧化氫酶的活性,而抑制土壤脲酶和蔗糖酶的活性,該現(xiàn)象與孫佳為等[23]的研究結(jié)果基本一致。其原因可能是多菌靈殘留對水稻植株及根際微生物群落造成了一定的氧化脅迫,作為應(yīng)激反應(yīng),植株及微生物會表達更高水平的過氧化氫酶以緩解氧化損傷。因為土壤酶主要來自土壤微生物、植物根系分泌以及動植物殘體的釋放等途徑[24],多菌靈污染抑制了根際微生物及土壤動物的活力[8],從而降低土壤脲酶與蔗糖酶的產(chǎn)生。水稻內(nèi)生菌DJL-M3定殖能夠顯著緩解多菌靈的脅迫效應(yīng),提高土壤脲酶和蔗糖酶活力。這可能是因為DJL-M3直接降解殘留于土壤中的多菌靈(表1),從而減少其對水稻根際微生物群落的脅迫壓力。與此同時,人工接種降解性內(nèi)生菌能夠緩解高濃度農(nóng)藥對宿主作物的植物毒性,并在脅迫條件下促進植物生長[25]。DJL-M3的優(yōu)良促生長特性也極有可能提高了水稻對多菌靈污染的應(yīng)激耐受性,并促進脅迫條件下植株根系的發(fā)育,進而提高土壤酶活性。事實上,付風云等[26]的研究已經(jīng)表明,添加對作物具有促生長功能的微生物有機肥能夠顯著提高多菌靈脅迫條件下土壤脲酶和蔗糖酶的活性。綜上所述,內(nèi)生菌DJL-M3可能通過直接降低多菌靈殘留對水稻植株及根際微生物的脅迫壓力,以及提高接種水稻的生理活性來緩解多菌靈暴露對根際土壤酶活力的抑制作用。

3.2 DJL-M3對水稻根際中蚯蚓多菌靈脅迫耐受性的影響

蚯蚓是土壤健康的關(guān)鍵指示生物,其對維持土壤肥力具有重要作用,而農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中農(nóng)藥殘留污染對蚯蚓在個體、細胞和分子等不同生命層面都會產(chǎn)生毒理學作用[19]。郇志博等[27]的研究表明,多菌靈對赤子愛勝蚯蚓具有中等毒性,其能夠誘導(dǎo)蚯蚓血細胞產(chǎn)生微核畸變,因此,殘留于水稻根際的多菌靈不可避免會對周遭的蚯蚓造成脅迫危害。本研究發(fā)現(xiàn),多菌靈施藥后水稻根際土壤中蚯蚓的存活率顯著降低,在所有存活蚯蚓體內(nèi)SOD活性及MDA含量顯著高于未施藥組,該現(xiàn)象與大多數(shù)殺菌劑農(nóng)藥對蚯蚓的生物毒理學研究結(jié)果相一致[28—29]。SOD主要參與生物體內(nèi)氧化與抗氧化平衡,其能夠清除因外源脅迫而產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(ROS),保護機體細胞免受損傷[30]；MDA則是ROS攻擊生物膜中不飽和脂肪酸而引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物,其含量高低反應(yīng)機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[31]。多菌靈殘留對蚯蚓造成了氧化脅迫,導(dǎo)致其體內(nèi)MDA水平升高,作為應(yīng)激反應(yīng)蚯蚓也會提高其自身SOD活性以期清除機體內(nèi)過多的自由基,進而緩解氧化脅迫損傷。AchE廣泛存在于動物組織中,能夠特異性催化乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸,維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能[32]。區(qū)別于有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對蚯蚓AchE的抑制作用[19],我們發(fā)現(xiàn)多菌靈殘留會刺激水稻根際中蚯蚓的AchE,該現(xiàn)象與殺菌劑丙環(huán)唑污染誘導(dǎo)蚯蚓AchE表達相一致[33],雖然鮮有研究能夠完全解釋該現(xiàn)象,但蚯蚓體內(nèi)AchE活性與機體受到氧化脅迫而改變的細胞內(nèi)離子平衡有關(guān)[34]；除此之外,AchE作為生物靶標在機體經(jīng)歷細胞凋亡或炎癥的時候同樣會被激活[35]。根據(jù)CBZ組中試驗蚯蚓的存活率及腫脹的形態(tài),說明多菌靈殘留水平已經(jīng)達到促發(fā)蚯蚓產(chǎn)生炎癥并誘發(fā)個體死亡,從而導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)AchE出現(xiàn)過度補償現(xiàn)象[36]。在CBZ-M3處理組中,雖然蚯蚓體內(nèi)MDA含量依然顯著高于Control組,但可能已低于蚯蚓的耐受極限,所以對應(yīng)的是較低水平的SOD和AchE活性及顯著提高的整體存活率。綜上所述,內(nèi)生降解菌DJL-M3能顯著緩解多菌靈殘留對水稻根際中蚯蚓的氧化脅迫,提高蚯蚓在污染暴露條件下的適應(yīng)性。

3.3 DJL-M3對多菌靈暴露下水稻根際土壤微生物的影響

土壤微生物同樣是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,是土壤質(zhì)量和健康狀況的重要表征,在推動有機質(zhì)分解,養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)、促進植物營養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)土壤肥力及污染物降解過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[37]。研究表明,多菌靈污染會造成土壤微生物數(shù)量及呼吸量降低,微生物群落的豐富度、均勻度和優(yōu)勢度受到抑制[38]。這與我們研究結(jié)果相一致,雖然施藥靶標是水稻植株,多菌靈在噴施過程及施藥后依舊進入了水稻根際微環(huán)境,對其中的微生物群落造成脅迫,降低其整體活性(圖5)。Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Pielou指數(shù)和Mclntosh指數(shù)可以綜合表征土壤微生物群落中物種的豐富度、分布的均勻度以及不同微生物對碳源的利用程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn),多菌靈暴露顯著降低了根際土壤微生物Shannon、Simpson和Mclntosh指數(shù),這是因為作為廣譜性殺菌劑,多菌靈可能會無差別地毒殺水稻根際土壤中的病原菌與有益微生物,從而造成群落多樣性的降低[8]。AWCD值是從微生物群落對碳源的相對利用能力來反映土壤微生物的種群數(shù)量及結(jié)構(gòu)特征,其值大小與微生物代謝活性水平呈正相關(guān)關(guān)系[20—21]。肖麗等[39]的研究發(fā)現(xiàn)多菌靈污染能夠?qū)ν寥郎锪刻荚斐梢种谱饔?這表明其減弱了土壤微生物對碳源的整體代謝活力。在本實驗中,接種內(nèi)生菌DJL-M3能夠提高多菌靈暴露下水稻根際土壤微生物的AWCD值及多樣性指數(shù),這可能是接種DJL-M3提高了根際殘留多菌靈的代謝速率(表1),同時減少的外源污染脅迫維護了原有微生物群落的多樣性,而被DJL-M3促生的水稻植株同樣可以通過有益的根際互作提高微生物的活力。土壤微生物對不同類型碳源的利用強度可以反映土壤肥力與質(zhì)量的變化,體現(xiàn)其群落結(jié)構(gòu)在碳素物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流動中的協(xié)同與競爭作用[40]。因為土壤微生物群落對碳源的利用主要集中在碳水化合物(糖類)、氨基酸和羧酸[20],而多菌靈污染能夠降低土壤微生物群落的活力及多樣性,進而抑制它們對這類碳源的利用。我們發(fā)現(xiàn)接種降解性內(nèi)生菌DJL-M3同樣改變了根際土壤微生物群落對碳源的代謝模式,這可能是由DJL-M3對特殊碳源的偏好性造成；除此之外,內(nèi)生菌定殖宿主后能夠改變宿主植株所在土壤微生物的數(shù)量及組成,比如土壤細菌與真菌的比值[41],這同樣會影響根際微生物群落對碳源的整體利用方式。在土壤微生物對碳源代謝的主成分分析中,CBZ組的PC值與其他兩組的距離要遠大于它們之間的距離,這表明多菌靈殘留對水稻根際微生態(tài)的影響要強于S.pavaniiDJL-M3的引入,這是因為相對于單個菌株的接種,土壤微生物群落具有足夠的緩沖能力進行適應(yīng)和再平衡,多菌靈等農(nóng)藥污染會改變土壤的理化性質(zhì)與植物生理狀況,進而在短期內(nèi)重塑根際土壤微生物組成及代謝特性[42]。綜上所述,多菌靈暴露顯著抑制水稻根際土壤微生物對碳源的代謝活性,降低其物種組成多樣性與均勻度。接種降解性內(nèi)生菌DJL-M3能夠促進脅迫條件下水稻根際微生物對碳源的整體利用能力,提高微生物群落的多樣性并在一定程度上緩解多菌靈對水稻根際微生物群體的脅迫效應(yīng),最終將多菌靈脅迫條件下水稻根際微生物碳源代謝特征修復(fù)到接近無污染水平。

4 結(jié)論

本研究揭示了接種內(nèi)生降解菌StenotrophomonaspavaniiDJL-M3能在促進水稻根際多菌靈殘留降解代謝的同時,緩解多菌靈暴露對土壤微生物群落和蚯蚓的脅迫損害,提高多菌靈污染條件下根際土壤酶活性及微生物群落代謝功能多樣性。因此,降解性內(nèi)生菌在修復(fù)多菌靈等農(nóng)藥污染暴露下的水稻根際微生態(tài)環(huán)境中具有較大的應(yīng)用潛力。