張繼賢，繆鳳，劉國(guó)艷，梁麗，楊雪，吉濤，徐鑫

（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

枸杞（Lycium barbarum L.）系茄科枸杞屬落葉灌木植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，富含多種活性成分如多糖、黃酮類化合物、生物堿、枸杞色素、氨基酸類等。大量研究表明，枸杞多糖具有抗氧化[1-2]、保護(hù)肝功能[3-4]、降低血糖[5]、修復(fù)心肌損傷[6]、抗病毒[7]、抗腫瘤[8]、抗衰老[9]和增強(qiáng)免疫力[10-11]等功效。目前，多糖提取大多采用的是酶法提取、超聲提取、酶提取、酸堿提取、熱水提取等技術(shù)手段[12]。酶法提取技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、不影響產(chǎn)物的生物活性、產(chǎn)率高、成本低以及綠色環(huán)保等多種提取優(yōu)勢(shì)[13]。而在酶法提取過(guò)程中，多使用纖維素酶、中性蛋白酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解[14]。并且，使用以上酶的復(fù)合酶比使用單酶的酶解效果更佳。此外，為了進(jìn)一步提升多糖純度和提取率，很多研究將其他方法與酶法提取聯(lián)用，以彌補(bǔ)各種提取技術(shù)的缺陷。例如，將超濾分離技術(shù)與酶法提取聯(lián)合使用可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同分子量多糖的分離和純化，可以得到分子量相對(duì)均一的多糖[15]。其中，超濾是一種經(jīng)典的物理膜分離技術(shù)[16]，具有設(shè)備易操作[17]、過(guò)程無(wú)相變、無(wú)化學(xué)反應(yīng)發(fā)生等優(yōu)點(diǎn)，此過(guò)程可以最大限度保持多糖的生物活性。迄今為止，關(guān)于利用酶法和超濾技術(shù)聯(lián)合提取枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）的研究還未有報(bào)道?；诖?，本文在單因素試驗(yàn)（加酶量、提取溫度、料液比和pH）的基礎(chǔ)之上，采用正交試驗(yàn)對(duì)枸杞多糖的酶法提取進(jìn)行優(yōu)化；其次，通過(guò)考察超濾時(shí)間、質(zhì)量濃度以及超濾壓力對(duì)超濾過(guò)程的影響，得到對(duì)枸杞多糖分級(jí)的最佳超濾工藝；最后通過(guò)測(cè)定枸杞多糖的DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基的清除能力，探究不同級(jí)分枸杞多糖的抗氧化活性。本研究最終可以為枸杞多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：市售；纖維素酶（7 000 U/g）、中性蛋白酶（120 000 U/g）、木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；3.5 kDa和10 kDa的中空纖維素超濾膜：國(guó)初科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitro-blue tetrazolium chloride，NBT）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、2，2′-聯(lián)氮-雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2′-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、過(guò)硫酸鉀、維生素 C：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；所有使用的試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

UV1000紫外分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；GCM-S-02卷式膜小試設(shè)備：國(guó)初科技有限公司；H1850R高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SIL-20AT液相色譜儀：日本島津儀器有限公司；DF-15超高速粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖提取率測(cè)定

利用苯酚-硫酸法[18]測(cè)定枸杞多糖提取率。繪制所得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=6.6043X+0.0086（R2=0.9993）；其中，Y代表吸光值；X代表多糖的濃度，mg/mL。

1.3.2 復(fù)合酶輔助提取枸杞多糖工藝優(yōu)化

參考Giacobbo等[19]方法提取枸杞多糖，將枸杞置于70℃烘箱烘干至恒重，利用超高速粉碎機(jī)少量多次粉碎，過(guò)150目篩，枸杞粉末置于干燥器內(nèi)保存。稱取5 g枸杞粉于燒杯中，按照料液比加入離子水和一定比例的復(fù)合酶，水浴提取，結(jié)束后于95℃下滅酶15 min，離心，測(cè)定上清液多糖含量。以枸杞多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，首先對(duì)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、半纖維素酶和纖維素酶進(jìn)行復(fù)合酶種類和質(zhì)量比的篩選；然后利用單因素和正交試驗(yàn)考察總加酶量、料液比、pH值和提取溫度對(duì)提取率的影響，確定復(fù)合酶提取枸杞多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 酶法提取枸杞多糖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design of enzymatic extraction on Lycium barbarum polysaccharides

1.3.3 超濾法分離枸杞多糖工藝優(yōu)化

選用截留分子量為10 kDa和3.5 kDa的兩種聚砜中空纖維超濾膜材料，進(jìn)行超濾，以膜通量為考察指標(biāo)，考察枸杞多糖質(zhì)量濃度（2 g/L～6 g/L）、超濾時(shí)間（10 min～80 min）和超濾壓力（0.1 MPa～0.6 MPa）對(duì)膜通量的影響，以此對(duì)超濾條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)Mw＜3.5 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa和 Mw＞10 kDa的多糖組分截留收集。通過(guò)如下公式計(jì)算膜通量。

式中：J為膜通量，L/（m2/h）；V為滲透液體積，L；S為超濾膜面積，m2；t為超濾時(shí)間，h。

1.3.4 相對(duì)分子量的測(cè)定

利用凝膠排阻色譜測(cè)定多糖分子量[20]。色譜柱：TSK gel G2000 SWXL（300 mm×7.8mm，5 μm）；流動(dòng)相：蒸餾水；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；樣品濃度：1 mg/mL。

1.3.5 體外抗氧化能力測(cè)定

1.3.5.1 O2-·清除能力測(cè)定

采用Li等[21]的方法測(cè)定多糖的超氧陰離子自由基的清除能力。

1.3.5.2 DPPH·清除能力測(cè)定

采用Kan等[22]的方法測(cè)定多糖的DPPH自由基的清除能力。

1.3.5.3 ABTS+·清除能力測(cè)定

根據(jù)Yang等[23]的測(cè)定方法，對(duì)ABTS+自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用Origin 2019b數(shù)據(jù)處理及繪圖，顯著性分析采用的是SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，p＜0.05代表差異顯著，p＜0.01代表差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖的復(fù)合酶法提取工藝優(yōu)化

2.1.1 酶的篩選

酶的種類及質(zhì)量比對(duì)枸杞多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 酶的種類及質(zhì)量比對(duì)枸杞多糖提取率的影響Fig.1 Effects of enzyme types and ratio on extraction rate of LBP

如圖1所示，復(fù)合酶法對(duì)枸杞多糖的提取率比單酶的提取率要高，其中通過(guò)纖維素酶和木瓜蛋白酶復(fù)配時(shí)，對(duì)枸杞多糖的提取率達(dá)到最大值（6.73%），并與其他組之間具有顯著差異（p＜0.05）。此外，當(dāng)纖維素酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1∶1.5（g/g）時(shí)，提取率最高（6.81%），與其它質(zhì)量比的提取率之間具有顯著差異（p＜0.05），其原因可能在于纖維素酶和木瓜蛋白酶之間的相互作用，并且木瓜蛋白酶占主導(dǎo)地位，通過(guò)將蛋白聚糖中的游離蛋白進(jìn)行水解，促進(jìn)了多糖的溶出。因此，確定纖維素酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1∶1.5進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)研究。

2.1.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 總加酶量、料液比、pH值和提取溫度對(duì)枸杞多糖提取率的影響Fig.2 Effects of total enzyme dosage，solid-liquid ratio，pH value and extraction temperature on the yield of LBP

如圖2A所示，隨著總加酶量的提高，枸杞多糖的提取率相應(yīng)提高。當(dāng)總加酶量為2%時(shí)，枸杞多糖的提取率最高，為6.81%，且與其他組之間具有顯著差異（p<0.05）。繼續(xù)提高酶用量時(shí)，提取率緩慢降低，可能是復(fù)合酶的添加量在該底物濃度下趨于飽和狀態(tài)，因此選擇復(fù)合酶最佳添加量為2%。如圖2B所示，提取率隨溶液體積的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，料液比1∶30（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大值（6.92%），與其他組之間有顯著性差異（p<0.05）。當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增大，對(duì)底物形成稀釋作用，降低了碰撞概率，導(dǎo)致提取率降低，所以最優(yōu)的料液比確定為1∶30（g/mL）。如圖2C所示，pH值為5時(shí)，提取率達(dá)到最高值（6.85%），與其他組相比有顯著性差異（p<0.05）。繼續(xù)增大pH值時(shí)，提取率明顯下降。不處于最適pH值范圍時(shí)，酶分子的解離狀態(tài)發(fā)生改變，酶的反應(yīng)速率降低，多糖提取率降低[24]，因此選擇最佳pH值為5。如圖2D所示，多糖提取率隨提取溫度的升高逐步上升，提取溫度為50℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高值（6.73%），與其他組有顯著性差異（p<0.05）。而提取溫度超過(guò)50℃時(shí)，枸杞多糖的提取率明顯降低。原因在于提取溫度會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生重要影響，不同的酶具有各自最適的溫度范圍。當(dāng)溫度低于溫度范圍，酶的活性不能充分發(fā)揮；而高于溫度范圍，則易引起酶失活。因此選擇最佳溫度為50℃。

2.1.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

枸杞多糖酶法提取正交直觀分析見(jiàn)表2，枸杞多糖酶法提取正交方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交直觀分析Table 2 Orthogonal visual analysis

表3 方差分析Table 3 Orthogonal variance analysis

由表2和表3可知，不同因素對(duì)枸杞多糖提取率影響的主次順序?yàn)榭偧用噶浚緋H值＞料液比＞提取溫度，且總加酶量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，其他3種因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響。由K值所得最佳工藝為A2B2C1D2，即總加酶量2%，提取溫度50℃，pH4，料液比 1∶30（g/mL），測(cè)得多糖提取率為（7.28±0.12）%。驗(yàn)證試驗(yàn)所得的枸杞多糖提取率為（7.54±0.08）%，高于9組正交試驗(yàn)結(jié)果，并且與預(yù)測(cè)結(jié)果比較接近，說(shuō)明本工藝的穩(wěn)定性較好、可行性強(qiáng)。

2.2 超濾對(duì)枸杞多糖的分級(jí)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

超濾時(shí)間、超聲壓力、枸杞多糖質(zhì)量濃度對(duì)膜通量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超濾時(shí)間、超聲壓力、枸杞多糖質(zhì)量濃度對(duì)膜通量的影響Fig.3 Effect of ultrafiltration time，ultrafiltration pressure and LBP mass concentration on membrane flux

如圖3所示，膜通量隨超濾時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，而當(dāng)超濾時(shí)間達(dá)到60 min之后，膜通量的增幅降低，原因在于過(guò)長(zhǎng)的超濾時(shí)間會(huì)使膜表面的濃度差出現(xiàn)極化，造成膜組件受損，因此確定超濾時(shí)間為60 min。隨著超濾壓力的增加膜通量隨之增大，當(dāng)達(dá)到0.25 MPa的壓力時(shí)，膜通量達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，若此時(shí)繼續(xù)增壓，則可能會(huì)對(duì)膜造成污染，甚至?xí)?duì)膜的結(jié)構(gòu)造成破壞，因此確定超濾壓力為0.25 MPa。膜通量隨多糖質(zhì)量濃度先增大后減小，多糖質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，膜通量達(dá)到最大值。此外，隨多糖質(zhì)量濃度增加，膜的表面會(huì)對(duì)料液中的大分子多糖進(jìn)行吸附而聚集，增大傳質(zhì)阻力，進(jìn)一步造成膜的污染[25]，因此選擇多糖質(zhì)量濃度3 g/L。綜合超濾分級(jí)單因素結(jié)果，超濾分級(jí)最佳工藝條件為超濾時(shí)間60 min，枸杞多糖質(zhì)量濃度3 g/L，超濾壓力0.25 MPa。

2.3 超濾分級(jí)組分分子量測(cè)定

超濾分級(jí)組分分子量見(jiàn)表4。

表4 超濾多糖的分子量Table 4 Molecular weight of ultrafiltered polysaccharides

由表4可知，Mw＜3.5 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＞10 kDa組分的多糖質(zhì)量占粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的52.46%、29.25%和 16.5%，分子量分別為 1 782、4 410、8 794 kDa。受多糖形貌、水溶性及多糖在溶劑中的分布形態(tài)的影響，經(jīng)超濾分離得到的多糖組分的分子量分布與超濾膜的截留分子量不完全成對(duì)應(yīng)關(guān)系[26]，但試驗(yàn)結(jié)果表明枸杞多糖達(dá)到了分離的初步效果。

2.4 體外抗氧化活性分析

枸杞多糖不同組分的ABTS+·、DPPH·和超氧陰離子自由基清除率見(jiàn)圖4。

圖4 枸杞多糖組分的ABTS+·、DPPH·和超氧陰離子自由基清除能力Fig.4 ABTS+·，DPPH·and superoxide anion radical scavenging ability of LBP fractions

如圖4可知，粗多糖及3種多糖組分對(duì)ABTS+自由基均具有清除效果，且清除效果與濃度呈正向線性關(guān)系。當(dāng)濃度為 4 mg/mL 時(shí)，Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖和 VC的 ABTS+自由基清除率分別為81.27%、75.33%、69.42%、62.48%和92.61%。ABTS+自由基清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)镸w＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖。當(dāng)濃度從 0提高到4 mg/mL時(shí)，粗多糖及3種多糖組分的DPPH自由基清除能力迅速增加后逐漸平緩。濃度為4 mg/mL時(shí)，Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖和 VC的DPPH自由基清除活性分別達(dá)到85.37%、70.41%、66.12%、65.46%和92.64%。DPPH自由基清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)?Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖，原因在于3種多糖組分作為供氫劑，與DPPH自由基反應(yīng)生成更穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而清除DPPH自由基，而粗多糖因其成分復(fù)雜，供氫能力較弱，與DPPH自由基結(jié)合較少[27]，從而影響了其抗氧化活性。隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，各多糖組分對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果也逐漸增強(qiáng)。濃度為4 mg/mL時(shí)，Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖和VC的超氧陰離子自由基清除率分別為70.22%、56.41%和48.43%、47.44%、91.9%。超氧陰離子自由基清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)?Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖。

綜合對(duì)比可看出，粗多糖與3種分級(jí)多糖組分均具有較好的抗氧化活性，且與多糖濃度呈正相關(guān)性，體外抗氧化活性強(qiáng)弱順序?yàn)镸w＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖，說(shuō)明超濾輔助復(fù)合酶法比復(fù)合酶法提取枸杞多糖的效果更佳，且多糖分子量越大，抗氧化活性越高。

3 結(jié)論

以甘肅枸杞為原料，多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，單因素和正交試驗(yàn)結(jié)合優(yōu)化復(fù)合酶法提取枸杞多糖工藝，得到最佳工藝條件：纖維素酶和木瓜蛋白酶質(zhì)量比為 1∶1.5（g/g），總加酶量 2%，料液比 1∶30（g/mL），提取溫度50℃，pH4。超濾分級(jí)優(yōu)化工藝為超濾時(shí)間60 min，多糖質(zhì)量濃度3 g/L，超濾壓力0.25 MPa。體外抗氧化活性結(jié)果表明，枸杞多糖具有一定的抗氧化活性，且Mw＞10 kDa組分抗氧化活性最高，其次是3.5 kDa＜Mw＜10 kDa組分，Mw＜3.5 kDa組分抗氧化活性最低，但3種級(jí)分的枸杞多糖抗氧化活性均高于粗多糖。以上結(jié)果說(shuō)明，超濾輔助復(fù)合酶法提取工藝方便可行，得到的枸杞多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，為研究不同分子量多糖與活性的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)，并為高活性枸杞多糖的制備提供了新方法。