秦宏偉，宋文霞，李桂菊，王曉強(qiáng)，韓延雷，國(guó)天慶，韓小龍

（1.濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東 濟(jì)寧 273155；2.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165；3.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250013）

丹參是指唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）干燥后的根或根莖，在我國(guó)是一種應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥材，本草綱目中記載丹參具有活血、通心包絡(luò)、治疝痛等功效[1-3]。在臨床治療中，丹參及其制劑常用于治療心脈阻滯所致的心絞痛。據(jù)報(bào)道，采用丹參注射液靜脈滴注的方法搶救心肌梗塞患者可扭轉(zhuǎn)部分病員心肌缺血的狀況，并能降低血脂[4-5]。丹參也能夠降低冠心病患者的血小板活化程度，可有效改善患者的凝血功能[6]。丹參還是養(yǎng)生食療中常見(jiàn)的材料[7]。丹參與酸棗仁配伍生產(chǎn)的茶飲能夠鎮(zhèn)靜催眠，可以改善飲用者的睡眠質(zhì)量[8-10]。丹參也可用于泡制具有保健功效的藥酒，在《千金翼方》、《圣濟(jì)總錄》等古代中醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作中就記錄有牛膝丹參酒、丹參地黃酒、狗脊酒等多種以丹參為主要原料的藥酒配方[11]。酒精是良好的極性有機(jī)溶劑，丹參中的各種有效成分都易溶于其中。山東某酒廠采用先進(jìn)的全封閉熱回流技術(shù)提取以臨朐沂山丹參為主的多種中藥材的有效成分，配制成一種低度營(yíng)養(yǎng)保健酒[12-13]。武紀(jì)天等[14]以總黃酮和總酚酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)以丹參和赤砂糖為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)丹參保健酒的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下總黃酮和總酚酸含量分別能夠達(dá)到506 mg/L和354 mg/L。

丹參中的活性成分根據(jù)溶解性不同可分為水溶性的酚酸類(lèi)化合物和脂溶性的二萜醌類(lèi)化合物[15]。從丹參中陸續(xù)分離鑒定到丹參酸甲（又名丹參素）、丹參酸乙、丹參酸丙、紫草酸、異阿魏酸和迷迭香酸等20多種酚酸類(lèi)化合物[16-18]。丹參活性成分中水溶性的酚酸類(lèi)化合物是其主要藥效活性成分，這些化合物多具有抗腫瘤、抗氧化以及抗炎等藥理活性，對(duì)心、腦、肝、腎等多組織器官均具有明顯的保護(hù)作用，因此以丹參為原料開(kāi)發(fā)的保健蒸餾酒、釀造酒對(duì)冠心病、心絞痛等疾病應(yīng)具有一定的治療效果[12]。目前，濟(jì)寧市建有多個(gè)丹參種植基地，種植面積多達(dá)數(shù)千畝，助力了當(dāng)?shù)剜l(xiāng)村振興發(fā)展?！棒~(yú)臺(tái)大米”也是濟(jì)寧市著名特產(chǎn)之一，2008年12月“魚(yú)臺(tái)大米”被認(rèn)定為“中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品”[19]。中醫(yī)認(rèn)為魚(yú)臺(tái)大米可入脾、胃、肺經(jīng)，具有補(bǔ)中益氣、健脾和胃、滋陰潤(rùn)肺、除煩渴之功效，并且濟(jì)寧當(dāng)?shù)匾恢庇惺褂敏~(yú)臺(tái)大米釀造白酒的傳統(tǒng)。因此本研究以魚(yú)臺(tái)大米白酒為溶媒浸取丹參中活性成分，開(kāi)發(fā)一種丹參白酒，并建立利用酶標(biāo)儀快速檢測(cè)丹參白酒中水溶性酚酸總量的測(cè)定方法，可用于丹參白酒的質(zhì)量控制，為當(dāng)?shù)氐a(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒曲

酒曲（安琪小曲）、復(fù)合功能菌（金裝，主要的微生物為釀酒酵母、根霉和酯化紅曲霉等）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 原料

丹參：濟(jì)寧學(xué)院釀酒工程實(shí)驗(yàn)室種植于濟(jì)寧學(xué)院試驗(yàn)田，收獲后干燥并粉碎成小于200目的顆粒；魚(yú)臺(tái)大米（津稻263）：濟(jì)寧魚(yú)臺(tái)縣鄉(xiāng)情谷物種植專(zhuān)業(yè)合作社。

1.1.3 試劑

原兒茶醛標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）：江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；冰醋酸、十二烷基硫酸鈉、無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀、三氯化鐵（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M200 Pro型多功能酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司；BSA224S電子天平：德國(guó)賽多利斯公司；5804R型離心機(jī)、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL 單道可調(diào)微量移液器：德國(guó)Eppendorf公司；MQD-S3NR振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚(yú)臺(tái)大米白酒釀造

魚(yú)臺(tái)大米白酒的釀造采用半固態(tài)發(fā)酵工藝，釀造過(guò)程如圖1所示。

圖1 魚(yú)臺(tái)大米白酒釀造流程Fig.1 The workflow of Yutai rice Baijiu production

按大米浸泡前的初始質(zhì)量加入0.4%安琪小曲和0.1%復(fù)合功能菌。發(fā)酵7 d～8 d后進(jìn)行蒸餾，分段蒸餾收集酒頭、基酒和酒尾，采用氣相色譜以乙酸正戊酯為內(nèi)標(biāo)物對(duì)其中酯類(lèi)等物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 酚酸含量測(cè)定

在黃喜茹等[20]建立的酚酸含量測(cè)定方法基礎(chǔ)上，針對(duì)酶標(biāo)儀的特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。準(zhǔn)確稱量干燥至恒重的原兒茶醛標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，用50%乙醇溶液溶解后配制成濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照表1稀釋成不同濃度梯度，每個(gè)濃度梯度做3個(gè)平行。

表1 配制不同濃度的原兒茶醛溶液Table 1 Preparation of protocatechualdehyde solutions with different concentrations

分別精密吸取不同濃度梯度的原兒茶醛溶液200 μL，加入 0.01 mol/L 十二烷基硫酸鈉溶液 80 μL，鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑（0.55 mol/L的鐵氰化鉀溶液與0.55 mol/L的三氯化鐵溶液按體積比1∶1混合）40 μL，搖勻后于暗處?kù)o置5 min，用1 mol/L的冰醋酸稀釋至1 mL（加入680 μL），搖勻后于暗處?kù)o置30 min。向每個(gè)酶標(biāo)孔精確加入200 μL反應(yīng)溶液，在波長(zhǎng)為720 nm處測(cè)定吸光度。以原兒茶醛濃度為橫坐標(biāo)，720nm波長(zhǎng)下測(cè)定的OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，得到回歸方程為y=0.052 3x+0.266 1（R2=0.997 4）。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve

1.3.3 魚(yú)臺(tái)大米白酒提取丹參水溶性酚酸工藝參數(shù)單因素優(yōu)化試驗(yàn)

分別用不同酒精度的魚(yú)臺(tái)大米白酒，設(shè)置不同的提取溫度和料液比，考察酒精度、提取溫度和料液比對(duì)丹參中水溶性酚酸提取效果的影響，提取時(shí)間為72 h，反應(yīng)液中水溶性酚酸濃度的測(cè)定參考方法1.3.2，含量以原兒茶醛計(jì)。以料液比為1∶100（g/mL）、酒精度50%vol、提取溫度30℃和提取時(shí)間72 h條件下從丹參中提取出來(lái)的水溶性酚酸的量為基準(zhǔn)，按照下列公式計(jì)算不同條件下魚(yú)臺(tái)大米白酒對(duì)丹參中水溶性酚酸的提取率。

式中：V1為魚(yú)臺(tái)大米白酒體積，mL；C1為提取液中水溶性酚酸濃度，μg/mL；m1為原料丹參質(zhì)量，g；C2為料液比為1∶100（g/mL）時(shí)提取液中水溶性酚酸濃度，μg/mL。

1.3.4 魚(yú)臺(tái)大米白酒提取丹參水溶性酚酸工藝參數(shù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

按照Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以丹參水溶性酚酸提取率（Y）為響應(yīng)值，選擇提取溫度（A）、魚(yú)臺(tái)大米白酒的酒精度（B）以及料液比（C）為影響因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行，并使用Excel 2010軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用Design-Expert V8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2015軟件繪圖，圖中誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)臺(tái)大米基酒生產(chǎn)工藝

采用乙酸正戊酯內(nèi)標(biāo)法對(duì)分段摘取的酒頭、基酒及酒尾進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 魚(yú)臺(tái)大米白酒分析結(jié)果Table 3 Detection results of Yutai rice Baijiu

使用安琪小曲和復(fù)合功能菌共同培菌發(fā)酵工藝生產(chǎn)的基酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量為87 μg/mL和24 μg/mL，與單用安琪小曲培菌發(fā)酵工藝相比分別提高了110.7%和18.8%。

2.2 丹參水溶性酚酸浸提條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

丹參在生長(zhǎng)過(guò)程中合成的酚酸主要是以酯鍵與細(xì)胞壁多糖結(jié)合的不溶性酚酸，對(duì)其干燥能夠轉(zhuǎn)化成游離酚酸[21-22]。因此為了保證較高的提取率，將丹參原料在使用前進(jìn)行干燥脫水并粉碎是必備操作。

2.2.1 酒精度對(duì)丹參水溶性酚酸提取率的影響

考察酒精度對(duì)丹參水溶性酚酸提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酒精度對(duì)丹參水溶性酚酸提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction yields of soluble phenolic acids

由圖3可知，在40%vol～55%vol，提取率隨酒精度的增加而逐步提高，當(dāng)酒精度為60%vol時(shí)提取率比55%vol略有下降，因此選擇酒精度為55%vol的魚(yú)臺(tái)大米白酒提取丹參中的水溶性酚酸。

2.2.2 提取溫度對(duì)丹參水溶性酚酸提取率的影響

在30℃～50℃范圍內(nèi)，每間隔5℃設(shè)置梯度，考察提取溫度對(duì)丹參水溶性酚酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)丹參水溶性酚酸提取率的影響Fig.4 Effect of extract temperature on the extraction yields of soluble phenolic acids

由圖4可知，隨著提取溫度提升，魚(yú)臺(tái)大米白酒對(duì)丹參中水溶性酚酸的提取率呈增加趨勢(shì)。但當(dāng)提取溫度提升到40℃以上時(shí)，提取率增加的趨勢(shì)較為平緩?？紤]到提取溫度越高，酒精的揮發(fā)性越強(qiáng)，并且酚酸類(lèi)物質(zhì)易被氧化[23-24]，因此選擇較低的提取溫度比較合適，確定提取溫度為40℃。

2.2.3 料液比對(duì)丹參水溶性酚酸提取率的影響

按照丹參與魚(yú)臺(tái)大米白酒的比例分別為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g/mL）進(jìn)行浸提試驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 料液比對(duì)丹參水溶性酚酸提取率的影響Fig.5 Effect of liquid to raw material on the extraction yields of soluble phenolic acids

當(dāng)溶劑量較低時(shí)，浸提液中水溶性酚酸的濃度較高，而當(dāng)溶劑量較高時(shí)，可以達(dá)到比較高的提取率。同時(shí)考慮水溶性酚酸濃度和提取率這兩個(gè)指標(biāo)，料液比選擇1∶9（g/mL）比較合適，此時(shí)水溶性酚酸濃度為2 103.35 μg/mL，提取率 79.06%。

2.3 丹參水溶性酚酸浸提條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

利用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)一步提高魚(yú)臺(tái)大米白酒對(duì)丹參水溶性酚酸的提取率[25]。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以提取溫度、魚(yú)臺(tái)大米酒精度和料液比作為響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化因素，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案以及提取率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與測(cè)定結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiments and assay results

對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到提取率（Y）對(duì)提取溫度（A）、酒精度（B）、料液比（C）的三元二次回歸方程為Y=-60.2-0.682A-1.614B+39.64C+0.003 53A2-0.004 87B2-2.452C2+0.015 80AB-0.036 0AC+0.167 0BC。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。

續(xù)表5 響應(yīng)面模型方差分析Continue table 5 ANOVA for response surface quadratic model

經(jīng)計(jì)算，該擬合方程的決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為0.993 9和0.983 0，并且失擬項(xiàng)P值為0.166＞0.05（不顯著），說(shuō)明這個(gè)模型對(duì)數(shù)據(jù)擬合非常好，可以準(zhǔn)確反映提取率與提取溫度、酒精度和料液比之間的關(guān)系。根據(jù)得到的三元二次回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，以確認(rèn)提取溫度、酒精度和料液比對(duì)提取率的影響，響應(yīng)面曲面圖和等高線圖見(jiàn)圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)丹參水溶性酚酸提取率的影響Fig.6 Effect of multi-factors interaction on the extraction yields of soluble phenolic acids

由表5和圖6可知，提取溫度、料液比、酒精度與料液比的交互項(xiàng)、料液比的二次項(xiàng)為極顯著影響因素（P<0.01），其他因素影響較小。

2.3.2 最優(yōu)條件驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果，通過(guò)對(duì)擬合方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。以丹參水溶性酚酸的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到最佳的提取工藝為提取溫度45℃，酒精度 60%vol，料液比為 1∶9.8（g/mL）。在此工藝下，丹參水溶性酚酸提取率的理論值為79.90%。按照最優(yōu)的提取條件，利用魚(yú)臺(tái)大米白酒提取丹參中的水溶性酚酸，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，提取率與水溶性酚酸濃度分別為（79.94±0.33）%和（1 953.05±8.06）μg/mL。

3 結(jié)論

本研究利用魚(yú)臺(tái)大米白酒浸提丹參中的水溶性酚酸等藥效活性成分。經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化之后，最優(yōu)的提取條件為提取溫度45℃，酒精度60%vol，料液比為1∶9.8（g/mL），此時(shí)魚(yú)臺(tái)大米白酒中水溶性酚酸含量為（1 953.05±8.06）μg/mL，丹參中水溶性酚酸的提取率能夠達(dá)到（79.94±0.33）%。下一步，將繼續(xù)利用魚(yú)臺(tái)大米白酒浸提濟(jì)寧當(dāng)?shù)靥禺a(chǎn)中藥材中的活性成分，并與魚(yú)臺(tái)大米丹參白酒配伍生產(chǎn)具有保健效果的養(yǎng)生酒。