宋小娟，楊衛(wèi)靈，張清海，胡迪，付國(guó)偉

（貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

火棘（Pyracantha fortuneana）又稱火把果、紅子，主要生長(zhǎng)在海拔500 m～2 800 m的山地，目前已被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為食品新資源食用果品[1]。我國(guó)野生火棘果資源豐富，占世界總資源的70%，國(guó)內(nèi)資源主要以四川、貴州、陜西、云南、湖南、湖北等省為主要產(chǎn)地，如湖北年均產(chǎn)果1億噸，貴州年均產(chǎn)果2 500萬(wàn)噸以上?；鸺且环N可藥可食可觀賞的多用途花果植物，具有很高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值[2]，其果實(shí)成熟后為橙紅色或紅色，甜酸適口、香氣濃郁、微澀，但果實(shí)小，平均單果重僅為0.177 g[3]，其含有種類齊全的天然色素、氨基酸、微量元素[4]、多酚、多糖[5]和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗氧化、抗病毒、抗細(xì)菌、抑制腫瘤、增強(qiáng)免疫力、利膽、助消化、促進(jìn)血凝等多種功效，在醫(yī)療、保健方面有廣闊的開發(fā)前景。

大量研究表明火棘多糖能抑制人體外培養(yǎng)的MDAMB-231乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]，槲皮素、蘆丁和原花青素可顯著降低體重、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和丙二醛水平，對(duì)高脂血癥和肥胖的改善與內(nèi)源性抗氧化活力的提高密切相關(guān)[7-8]。氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[9-12]，影響著食品風(fēng)味[13]。一些特殊氨基酸如支鏈氨基酸有提高運(yùn)動(dòng)能力、抗疲勞功效[14]，明確氨基酸種類及組成是食品、保健品等開發(fā)的重要依據(jù)之一。

火棘果的研究主要是活性成分的提取利用、火棘果果醋、火棘果復(fù)合飲料、火棘果美白產(chǎn)品等。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）所導(dǎo)致的酶促褐變是果蔬汁加工和貯藏面臨的難題之一，打漿過程中，在氧氣存在條件下，富含PPO的果蔬汁容易褐變，在防止酶促褐變方面通常采用物理、化學(xué)、生物方法對(duì)鮮榨果蔬汁進(jìn)行處理[15]，火棘果的PPO活力未見研究報(bào)道。研究表明，火棘果中含有抗氧化活性成分除了VC、多酚、花青素、黃酮醇以外，還含有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶[16]。

本研究采用柱前衍生-高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 測(cè)定貴州不同地區(qū)野生火棘果中水解氨基酸種類與含量，并分析火棘果實(shí)的可滴定酸、總糖、維生素C、總酚、總黃酮含量，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥基自由基（·OH）清除率以及火棘果提取物的抑菌作用等指標(biāo)，為野生火棘果資源的研究與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火棘果：采自貴州省黔西南、黔南、銅仁地區(qū)以及貴安新區(qū)等地共12個(gè)樣品，具體來源見表1。新鮮的火棘果采摘后放入保鮮袋中，儲(chǔ)藏于-80℃超低溫冰箱。

表1 火棘果來源Table 1 The source of Pyracantha fortuneana

乙腈（色譜純）：美國(guó)Tedia公司；三乙胺（色譜純）、異硫氰酸苯酯（色譜純）、正己烷（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；乙酸鈉、丙酮、鄰苯二酚（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸、濃硫酸（均為分析純）：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥98.0%）：北京索萊寶科技有限公司；苯酚（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑（生物試劑）：上海源葉生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（≥98.0%）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥98.0%）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；SOD試劑盒：南京建成生物工程研究所。

受試菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、沙門氏菌（Salmonella）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、費(fèi)氏檸檬酸桿菌（Citrobacter fischeri）由貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院食品科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；1510型酶標(biāo)儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；Haier醫(yī)用低溫保存箱（-80℃）：青島海爾特種電器有限公司；Scientz-50F型真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 火棘果中水解氨基酸種類與含量的測(cè)定

采用異硫氰酸苯酯柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定火棘果中水解氨基酸種類與含量[17-18]。

1.3.2 火棘果中營(yíng)養(yǎng)成分及活性成分的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[19]、酸堿滴定法測(cè)定可滴定酸含量[20]、固藍(lán)B鹽法測(cè)定維生素C含量[21]，F(xiàn)olin-Ciocalteus法測(cè)定總酚含量[22]，結(jié)果以每克所含沒食子酸當(dāng)量來表示（mg GAE/g），以蘆丁為標(biāo)注品測(cè)定總黃酮含量[23]，結(jié)果以每克所含蘆丁當(dāng)量來表示（mg Rutin/g）。

1.3.3 超氧化物岐化酶（SOD）活力與多酚氧化酶（PPO）活力測(cè)定

1.3.3.1 SOD活力測(cè)定

將火棘果放在研缽中，在4℃條件下研磨至糊狀，準(zhǔn)確稱取0.2 g火棘果樣品至2 mL離心管中，按照料液比 1 ∶9（g/mL）加入混合磷酸緩沖液（pH 6.0），振蕩3 min，靜置10 min后取清液備用。根據(jù)SOD試劑盒中植物組織中SOD的測(cè)定步驟，于450 nm測(cè)定。

1.3.3.2 PPO活力測(cè)定

稱取5 g火棘果放在研缽中，4℃下加少量pH 6.0的混合磷酸鹽緩沖液（預(yù)先冷藏）研磨，再加入10 mL混合磷酸鹽緩沖液，于4℃靜置20 min，取上清液經(jīng)10 mL丙酮沉淀，取沉淀，然后向沉淀中加入10mL磷酸鹽緩沖液，得待測(cè)酶液，置4℃下備用。取0.02 mol/L的鄰苯二酚溶液1 mL與混合磷酸緩沖液1.5 mL，于30℃保溫5 min，再加1 mL的待測(cè)酶液，迅速混勻后在波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定吸光度，每隔1 min記錄1次吸光度，共記錄3 min，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.4 火棘果體外抗氧化活性測(cè)定

結(jié)合樣品的水解氨基酸組成、總酚以及總黃酮含量等指標(biāo)，選擇來源為清鎮(zhèn)市的12號(hào)火棘果進(jìn)一步研究其體外抗氧化活性。火棘果樣品制備成勻漿，與無(wú)水乙醇按 1∶10（g/mL）的料液比混合，超聲 30 min，取上清液進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定?；鸺腄PPH·清除率、·OH清除率、ABTS+·清除率均參照文獻(xiàn)[24]方法進(jìn)行測(cè)定，分別以2、4 mg/mL的維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5 火棘果提取物的抑菌作用

1.3.5.1 受試菌株的活化

將受試細(xì)菌接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，生化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)20 h～22 h，菌濃度調(diào)為1.0×105CFU/mL備用。

1.3.5.2 火棘果醇提物的制備及抑菌試驗(yàn)

將12號(hào)樣品進(jìn)行粉碎，按照1∶10（g/mL）的料液比混合到75%乙醇中，超聲30 min后，放入60℃的水浴中超聲輔助提取2 h，離心取上清液在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥后用無(wú)菌水配制為濃度50 mg/mL溶液，用0.45 μm孔徑濾膜過濾除菌，采用平板擴(kuò)散法測(cè)定其對(duì)受試細(xì)菌的抑菌作用，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，75%乙醇為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定抑菌圈直徑，單位mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 火棘果中水解氨基酸的種類和含量

12個(gè)不同來源的火棘果水解氨基酸種類與含量如表2～表3所示。

表2 火棘果種子氨基酸種類和含量Table 2 Species and content of amino acids in seed of Pyracantha fortuneana mg/g

續(xù)表2 火棘果種子氨基酸種類和含量Continue table 2 Species and content of amino acids in seed of Pyracantha fortuneana mg/g

表3 火棘果果肉氨基酸種類和含量Table 3 Species and content of amino acids in pulp of Pyracantha fortuneanamg/g

由表2～表3可知，不同來源的火棘果種子和果肉所含氨基酸種類和含量存在差異，其中火棘果種子所含氨基酸種類和含量明顯高于果肉中，火棘果種子的氨基酸總量在33.09 mg/g～124.56 mg/g，火棘果果肉氨基酸總量為6.04 mg/g～35.94 mg/g。其中，5號(hào)火棘果種子的氨基酸總量最高，6號(hào)火棘果種子的氨基酸總量最低；10號(hào)火棘果果肉的氨基酸總量最高，12號(hào)火棘果果肉氨基酸總量最低。

火棘果種子必需氨基酸總量在13.80 mg/g～52.99 mg/g，必需氨基酸的范圍分別為蘇氨酸2.56mg/g～20.49mg/g，纈氨酸 0.48mg/g～1.75mg/g，蛋氨酸 0.96mg/g～25.46 mg/g，異亮氨酸 0.63 mg/g～9.45 mg/g，亮氨酸2.03 mg/g～7.56 mg/g，苯丙氨酸 2.09 mg/g～3.07 mg/g，賴氨酸1.33 mg/g～1.78 mg/g，必需氨基酸與氨基酸總量的比值（EAA/TAA）為 0.32～0.49，氨基酸評(píng)分（AAS）為2.04～3.11。

火棘果果肉必需氨基酸總量在2.91 mg/g～11.16mg/g，必需氨基酸的范圍分別為蘇氨酸0.63mg/g～4.84mg/g，纈氨酸 0.12mg/g～0.53 mg/g，蛋氨酸 0.22 mg/g～1.89 mg/g，異亮氨酸0.18 mg/g～1.76 mg/g，亮氨酸0.25 mg/g～2.85 mg/g，苯丙氨酸 0.24 mg/g～1.22 mg/g，賴氨酸0.55 mg/g～1.03 mg/g，必需氨基酸與氨基酸總量的比值（EAA/TAA）為 0.29～0.71，氨基酸評(píng)分（AAS）為1.42～3.51。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）于1973年提出，EAA/TAA值為0.4左右，則為蛋白質(zhì)的理想模式[25]。因此，火棘果可作為理想的蛋白質(zhì)來源。

2.2 火棘果中功能性氨基酸的種類與含量

不同來源的火棘果中功能性氨基酸的種類和含量如表4所示。

表4 火棘果中功能性氨基酸種類和含量Table 4 Species and content of functional amino acids in Pyracantha fortuneana mg/g

由表4可知，火棘果中呈味氨基酸與藥效氨基酸主要在火棘果種子中，火棘果種子中甜味氨基酸含量在15.89 mg/g～34.12 mg/g，鮮味氨基酸含量為5.86 mg/g～18.97 mg/g，苦味氨基酸含量為12.24 mg/g～31.87 mg/g，藥效氨基酸總量為25.54 mg/g～109.63 mg/g。種子中支鏈氨基酸總量為3.76 mg/g～13.11 mg/g，遠(yuǎn)高于火棘果肉的含量。由此可知，火棘果種子是火棘果功能性氨基酸主要存在的部位。

2.3 不同來源火棘果的營(yíng)養(yǎng)成分

不同來源火棘果的營(yíng)養(yǎng)成分如表5所示。

表5 不同來源火棘果中營(yíng)養(yǎng)成分及含量Table 5 Nutrient constituents and contents of Pyracantha fortuneana from different sources

由表5可知，火棘果樣品中總糖含量范圍在85.70 mg/g～339.34 mg/g，其中6號(hào)樣品總糖含量為（339.34±0.22）mg/g，顯著高于其他火棘果（p<0.05），總糖含量最低的是3號(hào)樣品，含量為（85.70±0.02）mg/g?；鸺麡悠分锌傻味ㄋ岷吭?.57%～10.01%，其中5號(hào)樣品可滴定酸顯著高于其他地區(qū)來源的火棘果（p<0.05）。大量研究表明，火棘果在成熟過程中，營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，隨著果實(shí)的成熟糖含量增加，有機(jī)酸和單寧含量下降，果實(shí)的酸澀味也降低。火棘果中維生素C含量為8.17 mg/100 g～12.67 mg/100 g，比柑橘、蘋果和梨都要高，僅低于獼猴桃。

大量研究表明，火棘果具有較高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，其中多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)具有抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)人體免疫力以及抗氧化等活力，本研究中12號(hào)和6號(hào)樣品的總酚含量顯著高于其他地區(qū)的火棘果（p＜0.05），分別為（1.82±0.05）mg GAE/g和（1.77±0.02）mg GAE/g，12號(hào)和5號(hào)樣品的總黃酮含量分別為（6.12±0.10）mg Rutin/g和（6.32±0.44）mg Rutin/g，顯著高于其他地區(qū)樣品（p＜0.05）。

2.4 不同來源火棘果的PPO活力和SOD活力

火棘果的多酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力如圖1所示。

圖1 不同來源火棘果的PPO活力與SOD活力Fig.1 PPO activity and SOD activity of Pyracantha fortuneana from different sources

如圖1所示，不同來源火棘果的PPO酶活力在10.00 U/g～20.00 U/g，PPO是導(dǎo)致食品酶促褐變的主要酶類，特別是在飲料的加工過程中，影響飲料的性質(zhì)和品質(zhì)，因此飲料加工原料的PPO活力的測(cè)定尤為重要。火棘果SOD活力在140.72 U/g～888.56 U/g，其中5號(hào)樣品的SOD活力最高，3號(hào)樣品的SOD活力最低。由此表明，火棘果可用作具有美白抗氧化的化妝品、保健功效功能性產(chǎn)品以及醫(yī)藥原料。

2.5 火棘果的抗氧化活性

12號(hào)火棘果醇提物的體外抗氧化活性如表6所示。

表6 火棘果提取液的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of Pyracantha fortuneana extract%

由表6可知，來源于清鎮(zhèn)的12號(hào)火棘果采用乙醇超聲后，其提取液的ABTS+·清除率為99.59%，DPPH·清除率為96.15%。與2mg/mL以及4 mg/mL的維生素C陽(yáng)性對(duì)照組的無(wú)顯著差異（p＞0.05）。ABTS+自由基以及DPPH自由基的清除能力可能是與火棘果富含的多酚類以及黃酮類物質(zhì)的含量相關(guān)。但2mg/mL和4 mg/mL的維生素C陽(yáng)性對(duì)照組的·OH清除率約為火棘果提取液的3倍，羥基自由基（·OH）是生物體內(nèi)極具反應(yīng)性的自由基，其清除能力可能與多糖、有機(jī)酸等物質(zhì)相關(guān)。

2.6 火棘果提取物的抑菌作用

火棘果醇提物對(duì)受試菌株的抑菌作用如表7和圖2所示。

表7 火棘果提取物的抑菌作用Table 7 Antibacterial action of Pyracantha fortuneana extract

圖2 火棘果提取物對(duì)細(xì)菌的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effect of Pyracantha fortuneana extract on bacteria

由圖2可知，火棘果提取物濃度為50 mg/mL，對(duì)受試細(xì)菌均有抑菌作用。由表7可知，火棘果提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌抑菌效果顯著優(yōu)于其他受試菌株（p<0.05），且50 mg/mL的火棘果提取物的抑菌效果顯著優(yōu)于75%乙醇。

3 結(jié)論

火棘果中共檢測(cè)出17種水解氨基酸，其中包括7種人體所需的必需氨基酸。12個(gè)不同地區(qū)火棘籽的氨基酸種類和含量明顯高于果肉中，其EAA/TAA符合FAO/WHO提出的理想模式，且火棘籽中富含大量的功能性氨基酸?；鸺麡悠返腟OD活力在140.72 U/g～888.56 U/g，總酚含量最高為（1.82±0.05）mg GAE/g，總黃酮含量最高為（6.32±0.44）mg Rutin/g。12號(hào)樣品的醇提液對(duì)ABTS+·、DPPH·以及·OH均有一定的清除能力，且濃度為50 mg/mL火棘果提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果顯著優(yōu)于其他受試菌株（p<0.05）。綜上所述，野生火棘果氨基酸種類齊全且含量豐富，有較強(qiáng)體外抗氧化能力，同時(shí)對(duì)常見導(dǎo)致腐敗的微生物有抑制作用，具有一定的開發(fā)利用價(jià)值。