欒濱羽， 馬 爽， 潘偉春， 朱秀清， 張 波

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院/黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150028； 3.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 浙江 杭州 310018)

大豆等植物蛋白原料，在擠壓的機(jī)械能和熱能作用下，可以形成具有類似肉類纖維狀結(jié)構(gòu)、質(zhì)構(gòu)、口感的仿肉制品[1]。在該過程中黏度不同導(dǎo)致的速度梯度曾被認(rèn)為是纖維結(jié)構(gòu)形成的原因[2-3]，即擠壓時物料黏度影響蛋白質(zhì)的拉伸，進(jìn)一步影響纖維狀結(jié)構(gòu)的形成[4]。實(shí)際上，天然高分子蛋白質(zhì)拉伸需要克服熵彈性，即首尾所受拉伸速度梯度(S)和分子鏈?zhǔn)湛s的弛豫時間(τ)的乘積(S×τ)足夠大，才可能被拉伸；而弛豫時間τ和體系黏度的二次方呈正比[5]。流變特性還與蛋白質(zhì)的種類、成分和加工工藝有關(guān)[4,6-8]，因此物料黏度等流變特性對于調(diào)控植物蛋白仿肉制品纖維狀結(jié)構(gòu)的形成具有重要指導(dǎo)意義。

受限于植物蛋白濃體系(含水率為30%～60%)難以形成內(nèi)部均一和外部規(guī)整的樣品，常用的動態(tài)流變儀無法較好地表征其流變特性，也無從研究植物蛋白隨加熱溫度、剪切方式等模擬擠壓過程流變特性的變化[9-11]。受材料科學(xué)中采用雙軸揉混儀在研究、表征聚合物材料松弛行為和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，擬采用雙軸揉混來模擬擠壓機(jī)內(nèi)的加工條件，并在此條件下研究植物蛋白的流變特性[12-13]。不同于動態(tài)流變通過施加隨時間做小幅度正弦變化的應(yīng)力使樣品產(chǎn)生可逆的小形變，雙軸揉混通過剪切等作用使樣品屈服產(chǎn)生不可逆的形變，屬于大形變。擴(kuò)散波譜可以利用激光光散射技術(shù)測量體系中示蹤顆粒的布朗運(yùn)動情況，并用該顆粒散射光的光強(qiáng)自相關(guān)函數(shù)表征樣品黏彈性的流變測量方法，適用于高黏稠半固體、透光性差等體系的流變特性測量[14-15]。由于擴(kuò)散波譜檢測的是顆粒在測量體系中布朗運(yùn)動軌跡，幾乎不擾動測量體系或不造成測量體系的形變，故屬于微形變或微流變檢測方法。與傳統(tǒng)動態(tài)流變相比，該方法既可表征較大剪切頻率范圍內(nèi)較弱流變體系的彈性模量[16]，還可檢測蛋白質(zhì)熱凝膠等含化學(xué)反應(yīng)的體系[17]，同時也可滿足在不復(fù)溶的前提下表征蛋白質(zhì)樣品流變特性的目的。雙軸揉混儀和擴(kuò)散波譜儀在合成高分子材料研究中應(yīng)用較多，但在食品材料研究中鮮有報道[18]。

本實(shí)驗(yàn)采用雙軸揉混儀和擴(kuò)散波譜分別表征大豆分離蛋白在大形變和微形變下的流變特性變化。以大豆分離蛋白為實(shí)驗(yàn)原料，研究不同含水率和攪拌時間下大豆分離蛋白表觀稠度的變化情況，以及制備的大豆分離蛋白的微流變特性，希望為理解高水分?jǐn)D壓過程蛋白質(zhì)纖維狀結(jié)構(gòu)形成機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

市售大豆分離蛋白，山東御馨生物科技有限公司，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.68%± 0.11%，其中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.82%。

1.2 儀器與設(shè)備

Plastograph EC plus型雙軸揉混儀，德國Brabender公司；RheoLab型擴(kuò)散波譜儀，瑞士LS公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大豆分離蛋白揉混實(shí)驗(yàn)

物料揉混采用的雙軸揉混儀內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖1。雙軸揉混儀由一個可控溫的“∞”型揉混腔和一對相向差速轉(zhuǎn)動的轉(zhuǎn)子(roller)組成。揉混腔混合室溫度80 ℃，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為63 r/min。揉混腔內(nèi)物料含水率和攪拌時間如表1。

圖1 揉混儀內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Internal structure diagram of kneading instrument

表1 大豆分離蛋白揉混參數(shù)

1.3.2表觀稠度測量

樣品表觀稠度由雙軸揉混儀每2 s自動檢測并記錄。50 min后收集樣品立刻真空包裝，4 ℃過夜平衡后用于后續(xù)微流變特性測量。為更好地說明表觀稠度相關(guān)指標(biāo)含義，表觀稠度隨時間變化曲線如圖2。測試指標(biāo)為：表觀稠度達(dá)到的最大值為ηp，對應(yīng)的達(dá)到峰值的時間為tp，按照式(1)計(jì)算達(dá)到峰值10 min后稠度降低幅度η。

(1)

式(1)中，|Δη|為峰值稠度ηp與達(dá)到峰值稠度10 min后對應(yīng)的稠度ηp+10之間差值的絕對值。

圖2 表觀稠度隨時間的變化Fig.2 Apparent consistency changes with times

1.3.3微流變特性測量

揉混后的蛋白質(zhì)體系的微流變特性采用擴(kuò)散波譜儀檢測[14,17]，使用光學(xué)長度為10 mm的比色皿作為容器。擴(kuò)散波譜儀的光源是波長為685 nm(45 mW)的激光。樣品溫度由帕耳貼(peltier)溫度控制器控制，由數(shù)字相關(guān)器根據(jù)通過光電倍增管的強(qiáng)度評估。使用擴(kuò)散波譜儀自帶的Micro Rheology Analysis v9.2.11軟件分析多重散射后的光信號，按照式(2)計(jì)算獲得自相關(guān)函數(shù)g1(τ)和均方位移(MSD)。自相關(guān)函數(shù)、均方位移可以提供樣品體系松弛動力學(xué)特性。

(2)

通過比較參考樣本的計(jì)數(shù)率(CR)直接計(jì)算出樣本的l*，如式(3)。

(3)

式(3)中，lref是標(biāo)準(zhǔn)樣品的光子傳輸平均自由程；下標(biāo)sample代表樣品，ref代表標(biāo)準(zhǔn)樣品；CR為計(jì)數(shù)率，表示散射光的光強(qiáng)。

根據(jù)Generalized Stokes-Einstein關(guān)系式，利用七次多項(xiàng)式的Laplace變換[19]，可以從式(1)逆向計(jì)算[Δr2(ω)]。黏彈模量在從時域到頻域的均方位移離散傅里葉變換后，可按式(4)估算。G′為儲能模量，G″為損耗模量。所有實(shí)驗(yàn)均在30 ℃下進(jìn)行。

(4)

式(4)中，G*(ω)為復(fù)數(shù)黏度，ω為頻率；kB為Boltzmann常數(shù)；T表示溫度；a為示蹤劑的半徑，i為單位虛數(shù)；[Δr2(ω)]是散射的均方位移。

1.3.4數(shù)據(jù)處理

每個樣品設(shè)置兩次平行實(shí)驗(yàn)，且兩次重復(fù)重現(xiàn)性平均在10%以內(nèi)。樣品表觀稠度測量結(jié)果采用Origin2019軟件繪制，大豆分離蛋白揉混特性和不同制備條件下樣品網(wǎng)格大小的影響表格用Excel軟件繪制，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同揉混處理?xiàng)l件對大豆分離蛋白流變特性的影響

復(fù)雜流體通常有不同結(jié)構(gòu)層次和多種組分，當(dāng)被剪切時，其形變與應(yīng)力的關(guān)系可以反映其儲能模量和損耗模量[20]，因此可通過黏度、扭矩、儲能模量、損耗模量等參數(shù)表征。

2.1.1含水率對大豆分離蛋白揉混時表觀稠度的影響

大豆分離蛋白在不同含水率下揉混的表觀稠度曲線如圖3。表觀稠度間接表征揉混腔中以恒定轉(zhuǎn)速攪拌樣品時的阻力，表觀稠度越大表明轉(zhuǎn)子所受阻力越大。圖3表明，水分加入后無法立刻與樣品混勻，此時50%含水率樣品的起始稠度更大，在5.8 min處最先達(dá)到峰值，14～31 min樣品稠度在50～88 Pa·s間不斷波動但整體呈下降趨勢，31～50 min后樣品稠度基本穩(wěn)定在50 Pa·s，曲線整體變化幅度為65 Pa·s。

圖3 50 min內(nèi)不同含水率下揉混大豆分離蛋白 表觀稠度變化Fig.3 Apparent consistency changes of soybean protein isolate kneaded under different moisture content in 50 min

在水分混勻過程中，65%含水率樣品稠度的增長相對較緩，甚至在9.0～9.5 min內(nèi)下降了22 Pa·s；在11.5 min升至峰值稠度88 Pa·s，隨后逐漸下降；在26 min時稠度為62 Pa·s，在29～50 min內(nèi)稠度保持在50～60 Pa·s間波動，曲線整體變化幅度為38 Pa·s。

80%含水率下曲線整體呈階段性上升趨勢，8～16 min、23～40 min、43～45 min、46～50 min內(nèi)稠度依次維持在38、62、75、88 Pa·s，在45.8 min時才達(dá)到峰值。

對比3種含水率樣品，50%含水率樣品達(dá)到峰值10 min后下降幅度為31.30%，65%含水率樣品為26.14%，80%含水率雖在最后5 min才達(dá)到在峰值但在攪拌過程中出現(xiàn)多次稠度穩(wěn)定的情況。在相同攪拌時間內(nèi)，樣品含水率越大，稠度曲線下降幅度越小，越穩(wěn)定。

2.1.2攪拌時間對大豆分離蛋白揉混時表觀稠度的影響

“間歇攪50 min”指攪拌10 min-暫停30 min-再攪拌10 min圖4 50 min內(nèi)不同攪拌方式下揉混大豆分離 蛋白表觀稠度變化Fig.4 Apparent consistency changes of soybean protein isolate kneaded with different mixing methods in 50 min

圖4顯示了不同攪拌時間對大豆分離蛋白揉混時表觀稠度的影響。由圖4可見，與相同含水率、持續(xù)攪拌50 min樣品相比，間歇攪拌樣品在初始10 min，表觀稠度上升較慢；伴隨著剪切停止表觀稠度瞬間降至0；暫停30 min后再次攪拌時瞬間達(dá)到峰值稠度108 Pa·s，表明80 ℃下暫停攪拌的30 min內(nèi)蛋白質(zhì)變性后轉(zhuǎn)子再次轉(zhuǎn)動時所受阻力更大。此外，圖4說明相同水分含量，間歇攪拌樣品更加不穩(wěn)定，達(dá)到峰值10 min后下降幅度為42.59%，表明剪切力對蛋白質(zhì)聚集體形成起阻礙作用，其峰值稠度(108 Pa·s )較持續(xù)攪拌峰值稠度(88 Pa·s)高，表明80 ℃下暫停攪拌的30 min內(nèi)蛋白質(zhì)熔融變性可形成強(qiáng)度更大的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

聚合物的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)與流變性變化密切相關(guān)，黏彈性則是聚合物流變學(xué)特性的主要體現(xiàn)。由于黏性行為的滯后性響應(yīng)，外力去除時材料不會立刻運(yùn)動產(chǎn)生滯后或松弛行為。該應(yīng)力松弛行為常通過扭矩、應(yīng)力、應(yīng)變等參數(shù)隨時間的變化曲線表征[21-22]。聚合物在揉混儀中的扭矩變化曲線通常有如下典型行為：物料加入揉混腔后，轉(zhuǎn)子所受阻力迅速增加，扭矩急劇上升并瞬間達(dá)到加料峰值；當(dāng)這一阻力被克服時，以固定速度旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子所需的扭矩減小，在一定時間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；隨后隨著分子剪切方向取向，扭矩會逐漸下降[23]。

本實(shí)驗(yàn)中，50%和65%含水率樣品的表觀稠度曲線在達(dá)到熔融峰值后同樣具有松弛行為，水分在揉混過程中起潤滑和增塑作用，含水率越低樣品顆粒對轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動的阻力越大，更快達(dá)到更大的扭矩峰值。這與Zhang等[24]在相同溫度下50%、55%、60%含水率條件下擠壓花生蛋白結(jié)果相似，低含水率熔體的黏度更大，混合所需的能量更多，單位機(jī)械能更大。達(dá)到峰值后，兩者稠度達(dá)到穩(wěn)定所需時間相近，但65%含水率所需時間稍長，這與蛋白質(zhì)濃度和聚集體形成有關(guān)[21]。水分降低了起彈性作用的蛋白質(zhì)聚合物比例，同時減弱了蛋白質(zhì)分子之間的摩擦，致使剪切力作用于內(nèi)層伸展?fàn)顟B(tài)的蛋白質(zhì)后不會瞬間帶動外層蛋白質(zhì)發(fā)生糾纏或粘連[25]。80%含水率樣品由于含水率較高，蛋白質(zhì)可以形成較大的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，故峰值扭矩和達(dá)到峰值的時間均較大。此外，多組分蛋白松弛行為并不是單一組分的簡單加和[26]。如大豆分離蛋白中主要包括大豆球蛋白和β-大豆伴球蛋白，兩者結(jié)構(gòu)不同因此聚集行為也不一致[27-28]，故還需進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)組分對大豆分離蛋白流變特性的影響。

2.2 不同揉混處理?xiàng)l件對大豆分離蛋白微流變特性的影響

相比于傳統(tǒng)動態(tài)流變表征的樣品受力后的宏觀變化，微流變側(cè)重于樣品微觀結(jié)構(gòu)變化，通過檢測顆粒在測量體系中布朗運(yùn)動軌跡推導(dǎo)出測量體系受力后的宏觀現(xiàn)象[20]。結(jié)果主要包括和顆粒布朗運(yùn)動軌跡相關(guān)的散射光自相關(guān)函數(shù)、表征顆粒布朗運(yùn)動軌跡的均方位移等隨時間的變化[29-31]。

2.2.1不同含水率和攪拌方式對大豆分離蛋白微流變散射光光強(qiáng)自相關(guān)函數(shù)的影響

圖5是4種不同揉混處理下大豆分離蛋白樣品的散射光自相關(guān)函數(shù)的變化，散射光自相關(guān)函數(shù)衰減速度反應(yīng)示蹤粒子運(yùn)動的快慢[30]。由圖5可知，在擴(kuò)散波譜測試過程中，所有散射光自相關(guān)函數(shù)的衰變時間都大于10-4s，根據(jù)Einstein-Stokes關(guān)系式[32]，這一現(xiàn)象表明體系可能含大顆粒和(或)體系內(nèi)部的黏性非常大。水含量越低，光強(qiáng)自相關(guān)函數(shù)衰減的越快，這表明示蹤粒子運(yùn)動的越快，但水含量升高65%以后，所對應(yīng)的自相關(guān)函數(shù)幾乎沒變化。攪拌方式對蛋白質(zhì)交聯(lián)程度有很大影響，和持續(xù)攪拌樣品相比，攪拌10 min-暫停攪拌30 min-再攪拌10 min導(dǎo)致對應(yīng)的函數(shù)衰減快，分析原因可能是持續(xù)攪拌有助于形成更多的交聯(lián)，體系黏度較大。

“間歇攪50 min”指攪拌10 min-暫停30 min-再攪拌10 min；黑色實(shí)心正方形組成的線條代表含水率50%，持續(xù)攪拌50 min的樣品；紅色空心圓形組成的線條代表含水率65%，持續(xù)攪拌50 min的樣品；粉色空心倒三角形組成的線條為含水率80%，持續(xù)攪拌50 min的樣品；藍(lán)色實(shí)心正三角形組成的線條為含水率65%,攪拌10 min-暫停30 min-再攪拌10 min的樣品。圖5 不同處理?xiàng)l件和方式所得到的大豆分離 蛋白的散射光自相關(guān)函數(shù)Fig.5 Scattered light autocorrelation function of soybean protein isolate with different treatment conditions and methods

2.2.2不同含水率和攪拌方式對大豆分離蛋白的微流變均方差位移和網(wǎng)格大小的影響

含水率對樣品中示蹤粒子運(yùn)動的影響結(jié)果見圖6。當(dāng)樣品含水率為50%時，在不同時刻，示蹤粒子的均方差位移(mean square deviation，MSD)最大，表明在該條件下，示蹤粒子運(yùn)動的最快，其次是含水率80%，最慢的是65%含水率樣品。兩種攪拌方式下MSD的數(shù)量級差異較小，故攪拌方式對體系形成網(wǎng)格尺寸的影響較小[31]，這一結(jié)果和圖5基本吻合。同時，除了含水率80%樣品，其他條件下的示蹤粒子運(yùn)動時，其MSD～τα中的α都小于1，這表明體系的流體力學(xué)特性接近固體[31]。除了中途暫停攪拌樣品，其他樣品在衰變時間足夠長時，出現(xiàn)一個不依賴于衰變時間的平臺，其對應(yīng)的均方差位移如圖6虛線指示縱坐標(biāo)值，該值的開平方可以反映樣品網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格大小(cage size)[33-34]。不同處理?xiàng)l件對樣品網(wǎng)格大小的影響結(jié)果見表3。由表3可知，不同處理的蛋白質(zhì)的網(wǎng)格大小為5～55 nm(網(wǎng)格大小由MSD值的開平方表示，MSD的單位為μm2，開方后經(jīng)換算，單位為nm)。網(wǎng)格變小，對示蹤粒子的約束越來越明顯，導(dǎo)致其所對應(yīng)的光強(qiáng)自相關(guān)函數(shù)衰減變慢，和圖5一致。這一結(jié)果和小麥面團(tuán)制備過程中面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)對示蹤粒子的約束相似[14]，即網(wǎng)格越小約束越大。

“間歇攪50 min”指攪拌10 min-暫停30 min-再攪拌10 min；虛線指示不依賴于衰變時間的平臺值；黑色實(shí)心正方形組成的線條為含水率50%，持續(xù)攪拌50 min的樣品；紅色空心圓形組成的線條為含水率65%，持續(xù)攪拌50 min的樣品；粉色空心倒三角形組成的線條為含水率80%，持續(xù)攪拌50 min的樣品；藍(lán)色實(shí)心正三角形組成的線條為含水率65%，拌10 min-暫停30 min-再攪拌10 min的樣品。圖6 不同處理?xiàng)l件和方式所得到的大豆分 離蛋白的均方差位移Fig.6 Mean square deviation shift of soybean protein isolate obtained by four different treatment conditions and methods

表3 不同處理?xiàng)l件和方式對樣品中網(wǎng)格大小的影響

2.2.3不同含水率和攪拌方式對大豆分離蛋白的微流變黏彈模量變化的影響

通過擴(kuò)散波譜測定光通過散射介質(zhì)時遵循的光路分布情況可得到材料的儲能模量G′和損耗模量G″，測定結(jié)果如圖7。由圖7可知，隨應(yīng)變頻率增大，不同含水率和攪拌方式處理的4種樣品的復(fù)數(shù)黏度(complex viscosity)逐漸下降，表明都存在剪切變稀行為。表3顯示，含水率65%樣品的網(wǎng)格較小，對應(yīng)的復(fù)數(shù)黏度較大。含水率50%和80%樣品的復(fù)數(shù)黏度幾乎無差別，但比含水率65%樣品低1～2個數(shù)量級。該結(jié)果表明，網(wǎng)格平均大小為5～7 nm時，體系中的顆粒較容易感知網(wǎng)格對它們的約束，復(fù)數(shù)黏度較高[31];反之，當(dāng)網(wǎng)格較大(11～55 nm)時，如含水率為50%或80%，體系顆粒感知到網(wǎng)格對其的約束較小，復(fù)數(shù)黏度較小。在小麥面團(tuán)中也可觀察到類似的現(xiàn)象[14]。

黑色實(shí)心正方形組成的線條代表G′；紅色空心圓形組成的線條為G″；藍(lán)色空心三角形組成的線條為復(fù)數(shù)黏度。圖7 大豆分離蛋白的制備條件對體系黏彈性能的影響Fig.7 Effect of preparation conditions of soybean protein isolate on viscoelastic properties of system

在所測的頻率范圍內(nèi)，4種樣品的儲能模量均大于損耗模量，均呈現(xiàn)出凝膠態(tài)行為[4]。儲能模量從小到大的樣品排序?yàn)?0%含水率-攪拌50 min、80%含水率-攪拌50 min、65%含水率-攪拌10 min-暫停30 min-再攪拌10 min、65%含水率-攪拌50 min；對應(yīng)的儲能模量為10-4～10-2Pa、10-3～10-2Pa、10-2～10-1Pa、10-1～1 Pa，和網(wǎng)格大小基本呈反比，即儲能模量越小，網(wǎng)格越大。

本研究表明，在雙軸揉混的4種加工條件中，較低含水率(50%)時，蛋白質(zhì)形成了網(wǎng)格較大的結(jié)構(gòu)，這可能是水分較少時，蛋白質(zhì)通過物理團(tuán)聚，故儲能模量較低；65%含水率和80%含水率形成的網(wǎng)格大小接近，但65%含水率時蛋白質(zhì)濃度較高，故其儲能模量較高；持續(xù)攪拌50 min可以形成更為均勻的蛋白質(zhì)連續(xù)相，故儲能模量較間歇攪拌高。

3 結(jié) 論

50%～80%含水率、持續(xù)攪拌或間歇攪拌的雙軸揉混實(shí)驗(yàn)顯示，隨著含水率從50%增加至80%，大豆分離蛋白表觀稠度達(dá)到峰值所需時間越長。表觀稠度達(dá)峰10 min后的下降幅度顯示，持續(xù)攪拌所形成的蛋白質(zhì)體系稠度下降幅度較小，較含水率50%或間歇攪拌所形成的體系穩(wěn)定。含水率較低(50%)時，蛋白質(zhì)傾向于形成網(wǎng)格較大，連續(xù)較差的結(jié)構(gòu)，儲能模量較低；增加含水率至65%～80%，或在較高含水率(65%)時持續(xù)攪拌，所形成的網(wǎng)格較小，儲能模量較高。本研究表明，通過揉混處理，較高含水率的大豆分離蛋白形成了網(wǎng)格較小的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這可能是高水分?jǐn)D壓組織化蛋白的纖維狀結(jié)構(gòu)較低水分?jǐn)D壓蛋白明顯的原因之一。本研究旨在探討不同種類蛋白質(zhì)或加工助劑誘導(dǎo)后蛋白質(zhì)的流變特性，同時為理解蛋白質(zhì)纖維狀結(jié)構(gòu)的形成提供可能的方法和理論參考。

致謝

衷心感謝中國科學(xué)院化學(xué)研究所賈迪研究員對本研究在流變特性分析方面的幫助。