鄒 剛，綦 睿，馬美嬌，畢小軍，王嬋娟，虎學(xué)君，蔡玉娟，李慧平

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變(FEVR)是一組以周邊視網(wǎng)膜血管發(fā)育缺陷為特征的家族遺傳性疾病，發(fā)病率較低[1]。FEVR臨床表型多樣，病變程度不一,如周邊視網(wǎng)膜血管化血管分支增多或呈毛刷樣，視盤或黃斑顳側(cè)血管牽拉，組織缺血缺氧可導(dǎo)致繼發(fā)性新生血管和各種各樣的并發(fā)癥，包括血管滲漏纖維血管增生后極部黃斑牽拉變形，視網(wǎng)膜皺褶，視網(wǎng)膜撕裂甚至視網(wǎng)膜脫離[2]。FEVR 可有常染色體顯性遺傳(OMIM 133780)[3],常染色體隱性遺傳(OMIM 601813)[4],或 X染色體隱性遺傳方式(OMIM 305390)[5],這其中常染色體顯性遺傳最為常見(jiàn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，TSPAN12(MIM# 613138)雜合突變與FEVR常染色體顯性遺傳有關(guān)[6]。TSPAN12基因位于7號(hào)染色體(7q31)，由305個(gè)氨基酸組成，編碼跨膜蛋白構(gòu)成Norrin-FZD4-LRP5信號(hào)復(fù)合體的一部分[7]，這個(gè)蛋白包括4個(gè)跨膜區(qū)域并由2個(gè)細(xì)胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)(ECL-1、ECL-2)和1個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接而成。目前研究已知TSPAN12基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在視網(wǎng)膜血管發(fā)育的NDP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演著重要的角色[8]。擴(kuò)大和豐富人類TSPAN12基因突變譜系，可以更好地理解FEVR致病機(jī)制和其編碼蛋白的功能[9]。目前在 HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)中，已經(jīng)報(bào)告96個(gè)病例中37種TSPAN12基因的致病性突變。本研究報(bào)告8個(gè)中國(guó)遺傳家系，鑒定了1個(gè)TSPAN12基因新發(fā)終止子類型的雜合突變，并證實(shí)該致病性突變?cè)诩蚁祪?nèi)與表型共分離。

1 資料與方法

1.1 一般資料:對(duì)2016年6月至2019年12月在寧夏眼科醫(yī)院就診的8個(gè)FEVR家系進(jìn)行遺傳學(xué)和臨床特征分析。本研究遵循赫爾辛基宣言，經(jīng)寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入本研究患者均為FEVR臨床診斷病例，均經(jīng)全面眼科專科檢查包括裂隙燈檢查，眼壓及驗(yàn)光檢查，眼底照相，眼底熒光血管造影(FFA)檢查明確診斷為FEVR病例。本研究所有患者及家屬均簽署研究知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及測(cè)序分析:提取家系及其成員外周血DNA，應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲芯片檢測(cè)致病基因(包括232個(gè)已知致病基因)，針對(duì)已知的致病基因及突變位點(diǎn)定制特異性的寡核酸苷酸探針，通過(guò)Applied BioSystems(ABI)(美國(guó)，Applied Biosystems公司)的Agilent Sure Select外顯子靶向序列富集系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)基因組區(qū)域進(jìn)行液相捕獲，用Illumina HiSeqTM2000高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 生物信息分析流程:將二代測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Burrows Wheeler Aligner軟件同UCSC人類基因組對(duì)照序列hg19完成比對(duì)，并運(yùn)用Genome Analysis Tool Kit工具對(duì)獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)及完善。將檢測(cè)獲得的DNA序列變異信息與單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)過(guò)濾，應(yīng)用ANNOVAR對(duì)剩余的突變基因進(jìn)行蛋白質(zhì)的改變預(yù)測(cè)，剔除同義突變，利用專業(yè)版人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因位點(diǎn)檢索獲得候選致病突變位點(diǎn)，對(duì)可疑致病變異者進(jìn)行Sanger驗(yàn)證及家系共分離分析。

致病性突變?cè)u(píng)估應(yīng)用美國(guó)醫(yī)學(xué)與遺傳學(xué)會(huì)指南(ACMG )和多種生物信息分析工具SIFT,Polyphen-2,CADD,GERP++ 和 PROVEAN。蛋白質(zhì)3-D構(gòu)型預(yù)測(cè)分析使用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)致病性突變導(dǎo)致的蛋白構(gòu)型變化[10]，參考蛋白編碼序列來(lái)自于NCBI。

2 結(jié)果

本研究共收集8個(gè)FEVR家系，臨床表型為輕至重度，見(jiàn)表1。其中4個(gè)家系篩查到致病性突變，1個(gè)家系發(fā)現(xiàn)FZD4基因的已知突變NM_012193.4:c.757C>T突變導(dǎo)致第253位的精氨酸變?yōu)榘腚装彼幔?個(gè)家系檢測(cè)到TSPAN12突變，占75%，見(jiàn)表2。其中家系1(圖1,封三)檢測(cè)到TSPAN12的雜合性突變c.633T>A導(dǎo)致第211位的酪氨酸突變而提前終止轉(zhuǎn)錄，該突變?cè)趃nomeAD,clinVar,dbSNP,and The Human Gene Mutation Database(HGMD)等數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)報(bào)道。在正常千人漢族人群及千人東亞人群中的突變頻率為0，且在物種間高度保守。經(jīng)過(guò)Sift、Polyphen-2、GERP+、 PROVEAN分析為致病突變，是新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。家系1中的先證者(Ⅱ-2)視力為0.6/0.8(R/L)，F(xiàn)FA顯示異常的周邊視網(wǎng)膜分支血管呈毛刷樣改變，伴隨血管的滲漏。其父親也攜帶該位點(diǎn)的雜合性突變，但體征較輕，僅表現(xiàn)為周邊不完全血管化而視力正常。

表1 8個(gè)FEVR家系臨床資料

表2 8個(gè) FEVR先證者中檢測(cè)出致病性突變

3 討論

目前共發(fā)現(xiàn)TSPAN12基因37個(gè)突變位點(diǎn)與FEVR 有關(guān)包括 22 個(gè)錯(cuò)義突變,9個(gè)刪除突變,5個(gè)剪切突變和1個(gè)小的插入突變。本研究報(bào)道了TSPAN12的 c.633T>A突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止，這一發(fā)現(xiàn)豐富了FEVR的突變頻譜，為非典型的散發(fā)FEVR患者診斷提供基因診斷的依據(jù)。以往研究顯示，TSPAN12突變占FEVR突變頻譜的 3.2%和8%[11]。本研究顯示，F(xiàn)EVR患者中該基因突變占高達(dá)75.0%(3/4)，明顯高于以往研究[12]。由于納入的樣本量較小，TSPAN12基因占比不具有可比性，但所納入的病例為輕度的非典型病例，這提示TSPAN12突變存在不完全外顯的特征[13]。不同的TSPAN12突變與特定表型有關(guān)，韓國(guó)人群大片段的TSPAN12刪除較點(diǎn)突變多見(jiàn)[14]。以往研究發(fā)現(xiàn)，TSPAN12突變導(dǎo)致嚴(yán)重的 FEVR,但本研究發(fā)現(xiàn)該基因的突變?yōu)榉堑湫洼p度患者，可能與終止密碼突變位點(diǎn)靠后，編碼蛋白可部分行使功能有關(guān)[11]。但也有報(bào)道顯示，位于第8外顯子的小缺失可導(dǎo)致嚴(yán)重的FEVR[15]。與本研究發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)接近，說(shuō)明終止突變后縮短的蛋白仍具有活性。在本研究中1例患者發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)為小的缺失，無(wú)任何癥狀僅在眼底熒光造影見(jiàn)周邊血管滲漏，另一例患者由于缺乏典型體征被誤診為弱視，提示TSPAN12突變的FEVR眼底血管改變表現(xiàn)多樣。應(yīng)用SWISS-MODEL三維建模顯示TSPAN12包含4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，由一個(gè)小的胞外環(huán)(SEL)和一個(gè)大的胞外環(huán)(LEL)以及一個(gè)胞內(nèi)環(huán)連接，第211氨基酸位于第2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，發(fā)生終止突變后編碼的蛋白縮短，與已報(bào)道的210位突變相鄰[3]。此外，該位點(diǎn)與位于大的胞外環(huán)中的高度保守的CCG 模式序列相鄰，該結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜蛋白間的相互作用有關(guān)[9]。該終止突變的發(fā)現(xiàn)，有利于分析功能結(jié)構(gòu)域的功能。本研究50%患者有典型的FEVR臨床表型，但不論是基因芯片檢測(cè)還是全外顯子組測(cè)序均未篩查到致病性突變，提示仍有大量的未知突變未被發(fā)現(xiàn)；有研究應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)第7染色體有40.5 Mb 的基因組區(qū)域含有與FEVR有關(guān)的致病性突變，因此非編碼突變也可能導(dǎo)致FEVR發(fā)病。

總之，TSPAN12終止突變的發(fā)現(xiàn)豐富了 FEVR的突變頻譜，深入分析基因型與表型間的關(guān)系有利于精準(zhǔn)診斷及判斷預(yù)后，對(duì)于FEVR患者尤其是非典型病例進(jìn)行基因篩查有利于對(duì)患者進(jìn)行遺傳咨詢和指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。