董佳馨，黃智敏，邢昌贏

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 南京 210029

在過去的幾十年里糖尿病在全球范圍內(nèi)發(fā)病率大幅上升，糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）已經(jīng)成為許多國家終末期腎病的主要原因［1-2］。DKD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，但腎臟纖維化包括腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化是疾病進(jìn)展到終末期腎臟病的共同通路［3］。越來越多的證據(jù)表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腎纖維化中起著至關(guān)重要的作用。EMT 是一種表型變化，它會(huì)使正常細(xì)胞失去上皮特征轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞［4-5］。

人類抗原R（human antigen R，HuR）是最具特征性的RNA 結(jié)合蛋白之一，是一種約36 kDa 的蛋白質(zhì)。它可以通過與3′-UTR 中富含A 或U 的序列元件相互作用，參與調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性。HuR 與EMT密切相關(guān)。TGF-β1/HuR反饋回路可以調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞中的纖維化反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，DKD患者和大鼠腎組織中的HuR表達(dá)升高。此外，HuR與轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的3′-UTR 結(jié)合，誘導(dǎo)EMT。而抑制HuR可能阻斷高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT，減輕DKD 中的腎纖維化［6］。這些均提示HuR 參與DKD的進(jìn)程，HuR 可能成為DKD 腎臟纖維化程度的指標(biāo)。但是，目前有關(guān)不同分期的DKD患者HuR表達(dá)差異的研究相對(duì)較少，因此，本研究選取2014 年1 月—2019年5月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)腎活檢明確診斷的DKD 患者165例，研究經(jīng)腎臟病理明確的DKD 不同病理分期患者腎組織中HuR 表達(dá)差異。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

選取2014 年1 月—2019 年5 月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)腎活檢明確診斷DKD 患者165 例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18歲；②急性腎損傷患者；③穿刺腎小球＜5個(gè)；④合并嚴(yán)重其他系統(tǒng)疾病和其他腎小球疾病患者。從腫瘤病灶0.5 cm處收集相應(yīng)的癌旁組織16 例，并經(jīng)病理證實(shí)為正常組織。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審查號(hào)：2018-SR-250），所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床數(shù)據(jù)

腎活檢時(shí)收集患者的以下臨床資料：年齡、性別、血壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白、血尿素氮、血清肌酐、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）、24 h 尿蛋白、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）等。估算的腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）根據(jù)慢性腎臟疾病流行病學(xué)協(xié)作（CKD-EPI）公式計(jì)算。

腎臟標(biāo)本由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家通過光學(xué)顯微鏡、免疫熒光和電子顯微鏡進(jìn)行常規(guī)檢查，每個(gè)患者腎臟穿刺標(biāo)本腎小球個(gè)數(shù)≥5。依據(jù)HE染色、PAS 染色、銀染以及Masson 等光學(xué)顯微鏡下的染色，再結(jié)合電鏡結(jié)果進(jìn)行DKD病理分期診斷。診斷標(biāo)準(zhǔn)如下［7］：Ⅰ期，光鏡下無或有輕微病變，電鏡示基底膜增厚（年齡≥9歲患者，基底膜增厚標(biāo)準(zhǔn)為男性基底膜厚度＞430 nm，女性基底膜厚度＞395 nm）；Ⅱa 期，出現(xiàn)輕微的系膜擴(kuò)張（＞25%所見系膜區(qū)）；Ⅱb期，嚴(yán)重的系膜擴(kuò)張（＞25%所見系膜區(qū)）；Ⅲ期，出現(xiàn)Kimmelstiel-Wilson 結(jié)節(jié)（K-W 結(jié)節(jié)）；Ⅳ期，嚴(yán)重的腎小球硬化（＞50%腎小球硬化）。

1.2.2 免疫組化

石蠟包埋組織切片2 μm，脫蠟后切片在檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中20 min，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。在室溫下用5%牛血清白蛋白封閉1 h，切片與HuR 抗體（1∶8 000，Santa Cruz 公司，美國）4 ℃孵育過夜。切片用PBS 洗滌，然后與二抗在37 ℃孵育1 h。然后切片用DAB染色2 min，再用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，最后脫水并固定。每個(gè)部分由顯微鏡隨機(jī)拍攝8～10 張照片，并由Image-Pro Plus計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布資料的數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。低于檢測值下限的數(shù)值被估算為各檢測下限的的一半［8］。使用Spearman 相關(guān)分析臨床指標(biāo)與HuR 表達(dá)的相關(guān)性。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析。所有檢驗(yàn)均以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料

共有165 例患者被納入本研究，其中男127 例（76.50%），女38 例（23.50%），血清肌酐水平為［111.50（84.05，175.95）］μmol/L，血紅蛋白（111.44±25.22）g/L?；颊?4 h 尿蛋白、糖化血紅蛋白、白蛋白等基線水平見表1。

表1 165例DKD患者臨床資料Table 1 Clinical characteristics of 165 DKD patients

將165 例患者依據(jù)病理診斷結(jié)果分為Ⅱa期、Ⅱb 期、Ⅲ期、Ⅳ期。其中Ⅱa 期16 例、Ⅱb 期37 例，Ⅲ期70 例，Ⅳ期42 例，癌旁組織作為正常對(duì)照組。單因素方差分析顯示血清肌酐、尿素氮、PTH 和血清鐵等在各分組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 不同病理分期DKD患者的臨床資料Table 2 Clinical characteristics of DKD patients in different pathological stages ［M（P25，P75）］

2.2 不同病理分期患者的HuR表達(dá)有差異

免疫組化結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，HuR 在DKD 患者腎臟組織內(nèi)表達(dá)增高，由圖1可見HuR 主要在腎小管上表達(dá)。通過半定量分析結(jié)果顯示病理分期嚴(yán)重的患者HuR表達(dá)增高。Ⅱb 期與Ⅲ期、Ⅱb 期與Ⅳ期、Ⅲ期與Ⅳ期之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Ⅱa 期與Ⅱb 期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖1 HuR在不同分期DKD患者腎臟中的表達(dá)Figure 1 Expression of HuR in kidney tissues of DKD patients in different stages

圖2 不同病理分期患者的HuR定量表達(dá)Figure 2 Quantitative analysis of HuR expressions in dif?ferent pathological stages

2.3 HuR與患者臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性

如表3 和圖3 所示，DKD 患者HuR 表達(dá)與血清肌酐、尿素氮、血尿酸、C 反應(yīng)蛋白、PTH 呈正相關(guān)（P＜0.05），與eGFR、血紅蛋白、糖化血紅蛋白、1，25羥維生素D3呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

圖3 DKD患者HuR與臨床指標(biāo)的相關(guān)性Figure 3 Correlation between HuR and clinical indexes in DKD patients

表3 DKD患者HuR與臨床指標(biāo)的相關(guān)性Table 3 Correlation between HuR and clinical index?es in DKD patients

3 討論

HuR，一種反式作用的基因元件，是一種核糖核酸結(jié)合因子且富含腺嘌呤和尿嘧啶序列的基因元件。在多種腎臟疾病中，如代謝性酸中毒、缺血和纖維化，都出現(xiàn)了HuR表達(dá)的失調(diào)［2］。靜息狀態(tài)下，HuR主要位于細(xì)胞核內(nèi)。在各種刺激下，HuR從細(xì)胞核出來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，通過核糖核酸識(shí)別序列與靶mRNA 3′-UTR 中的順式作用元件結(jié)合，從而通過抑制mRNA 降解和去甲基化來調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性［9］。在完成穩(wěn)定mRNA 的過程后，HuR 從mRNA中釋放出來，并迅速返回細(xì)胞核［10］。文獻(xiàn)表明，HuR的核轉(zhuǎn)錄和HuR 核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)都是因炎癥信號(hào)而被激活的，激活后可以發(fā)揮穩(wěn)定炎癥介質(zhì)的作用［11-13］。HuR參與了多種細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腫瘤進(jìn)展［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)HuR 參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞，如膽囊癌、結(jié)腸癌等的EMT 進(jìn)程［16-18］。近幾年來HuR 在腎小管上皮細(xì)胞中的作用備受關(guān)注。

EMT 是一種上皮細(xì)胞逐漸失去細(xì)胞極性和細(xì)胞間黏附能力，與此同時(shí)獲得成纖維細(xì)胞形態(tài)、遷移和侵襲特性的細(xì)胞程序。腎小管細(xì)胞可經(jīng)EMT轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，激活的肌成纖維細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度沉積，是維持腎纖維化持續(xù)進(jìn)展的關(guān)鍵因素。腎小管細(xì)胞中呈EMT 分子特征的細(xì)胞數(shù)目與血清肌酐水平和腎間質(zhì)損傷程度密切相關(guān)［19］。相應(yīng)地，EMT作為動(dòng)態(tài)且可逆的病理生理過程，阻斷EMT進(jìn)程的治療策略可有效減輕腎臟纖維化［20-21］。基礎(chǔ)研究證實(shí)抑制HuR可能阻斷高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT，減輕DKD中的腎纖維化。

本研究發(fā)現(xiàn)，HuR在DKD患者腎組織中主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞核，并隨著病理程度加重表達(dá)增加，進(jìn)一步佐證了HuR在DKD疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。與正常對(duì)照組相比，除了腎小管，HuR 在腎小球內(nèi)的表達(dá)也增高，尤其是在一些受損較嚴(yán)重的腎小球內(nèi)，這與本課題組前期發(fā)現(xiàn)一致［22］?？梢奌uR 在部分細(xì)胞的胞核胞漿均有表達(dá)，揭示了DKD 標(biāo)本中HuR 的核質(zhì)穿梭，這與以前的研究結(jié)果一致［6］。由于HuR 的核質(zhì)穿梭是瞬時(shí)發(fā)生的，在本研究中尚未觀察到正在轉(zhuǎn)移中的HuR。本研究重點(diǎn)關(guān)注了HuR 在DKD 中的表達(dá)，證實(shí)在DKD 患者腎臟中HuR表達(dá)增高，并且在病理分型更嚴(yán)重的糖尿病患者腎臟中，HuR 表達(dá)更高。眾所周知，病理分型程度越嚴(yán)重，腎纖維化程度越重。這提示HuR 在DKD 腎纖維化中占有一定作用。本研究數(shù)據(jù)顯示，伴隨著HuR 的升高，患者糖化血紅蛋白也上升，兩者呈正相關(guān)，而HuR表達(dá)與肌酐、尿素氮以及eGFR等反映腎臟功能的指標(biāo)呈顯著相關(guān)性。

炎癥也是糖尿病發(fā)展至終末期腎病，導(dǎo)致進(jìn)行性腎組織纖維化的重要通路［23］。HuR 參與了多種炎癥性疾?。?4-25］，并可以調(diào)節(jié)自身免疫性疾病中的炎癥因子。HuR 還可以通過與白介素-1β、腫瘤壞死因子α等炎性細(xì)胞因子結(jié)合并穩(wěn)定其轉(zhuǎn)錄來參與炎癥過程［26］。本研究結(jié)果也顯示HuR 與炎癥指標(biāo)CRP呈正相關(guān)。機(jī)體內(nèi)活性維生素D主要由腎臟產(chǎn)生，而腎臟也是影響維生素D 代謝的重要器官。1，25羥維生素D3通過胞漿內(nèi)維生素D受體復(fù)合物發(fā)揮作用，維生素D 受體的密度和功能會(huì)隨著腎功能下降而降低［27］。并且既往研究證實(shí)維生素D 具有抑制炎癥因子表達(dá)的作用［28］。1，25羥維生素D3可以通過抑制Th1 型細(xì)胞因子的產(chǎn)生抑制細(xì)胞免疫，缺乏1，25 羥維生素D3 會(huì)導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能受損［29］，這可能從多角度解釋本研究中HuR與1，25羥維生素D3 呈負(fù)相關(guān)。1，25 羥維生素D3 水平低下使PTH mRNA 水平升高，PTH 合成增加［30］。這可能間接導(dǎo)致HuR與PTH呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，在DKD 腎組織中HuR 與DKD 病理的嚴(yán)重程度與腎功能相關(guān)指標(biāo)密切相關(guān)。因此，HuR可能成為值得關(guān)注的DKD治療靶點(diǎn)。