【摘要】 為擴(kuò)大檢測(cè)范圍，滿足痕量蟲草素和腺苷含量的檢測(cè)，建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定蛹蟲草制品中蟲草素和腺苷的含量，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行測(cè)定低限及回收率的驗(yàn)證，結(jié)果表明其線性范圍0.01 μg·L-1～5 μg·L-1的相關(guān)系數(shù)均能達(dá)到0.9995以上，蟲草素和腺苷的測(cè)定低限均為0.05 μg·L-1，并具有特異性顯著，靈敏度較高等特點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 蛹蟲草;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法;蟲草素;腺苷

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2022.01.029

Determination of Cordycepin and Adenosine by Ultra High Performance Liquid Chromatography-mass Spectrometry

WANG Guan-yu

（Fushun Food Inspection and Testing Center，F(xiàn)ushun 113000，China）

Abstract： To expand detection range，in order to meet the needs of the less cordycepin and adenosine testing，the UPLC-MS/MS method was established for the determination of cordycepin and， adenosine in Cordyceps militaris products. The determination limit and recovery rate of cordycepin， adenosine and cordycepin in cordyceps militaris were verified simultaneously. The results showed that their linear ranges of 0.01 μg·L-1～5 μg·L-1 were above 0.9995，The limit of detection lower was 0.05 μg·L-1. It has the characteristics and high sensitivity.

Key words： Cordyceps;UPLC-MS/MS;cordycepin;adenosine

蛹蟲草又稱北冬蟲夏草，與冬蟲夏草具有相似的生物活性成分，主要包括蟲草素、腺苷、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇、有機(jī)酸和核苷類物質(zhì)等[1-3]。新資源食品研究表明因其多種功能性活性成分協(xié)同作用，對(duì)治療多種慢性疾病有顯著影響，具有抗腫瘤、治療白血病、提高免疫力、治療心血管相關(guān)疾病、抑菌消炎等作用[4-5]，但由于化學(xué)合成難度大成本高，導(dǎo)致價(jià)格昂貴。因此，蟲草素和腺苷常作為質(zhì)量等級(jí)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，準(zhǔn)確且便捷的檢測(cè)方法對(duì)蛹蟲草及其制品研究具有重要意義。

目前已知的蟲草素和腺苷的提取方法有浸提法、超聲法、回流法以及索氏提取法等[6]，一般提取蟲草素的方法都能一并獲得腺苷，并且結(jié)果表明水比乙醇更利于提取蟲草素。本文通過前期提取效率、提取結(jié)果以及提取方法的易操作性的比對(duì)，選擇超聲法提取，而蟲草素和腺苷的檢測(cè)方法有液相色譜法（紫外檢測(cè)器）、薄層色譜法等，受液相色譜等儀器靈敏度的限制，檢測(cè)限僅能達(dá)到10 mg/kg。對(duì)于添加量不足千分之一的蛹蟲草制品來說，以上方法已經(jīng)無法滿足其微量的功能性成分檢測(cè)要求，本文通過統(tǒng)一采用超聲提取前處理技術(shù)及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究測(cè)定蟲草素和腺苷的含量，不僅降低檢測(cè)低限從而擴(kuò)大檢測(cè)范圍，更能為整合其他功能性成分的檢測(cè)方法提供一個(gè)方向。

1.1 儀器與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（ACQUITY?? UPLC-TQD，美國(guó)Waters公司）;電子天平（ML204T，梅特勒-托利多公司）;超聲波清洗器（Prima公司）;菌株（蛹蟲草來自沈陽(yáng)師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所）;蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)sigma公司）。

1.2 液相色譜分離條件（見表1）

色譜柱：ACQUITY UPLC?BHE-C18柱，2.1×50 mm，1.7 μm;流動(dòng)相[7]：A）0.1%甲酸水溶液，B）甲醇;流速：0.2 mL·min-1;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 質(zhì)譜檢測(cè)條件

質(zhì)譜系統(tǒng)：Xevo TQD;離子化模式：ESI+;毛細(xì)管電壓：3.5 KV;霧化氣溫度：350 ℃;霧化氣流速：650 L/h;錐孔氣流速：50 L/h。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

準(zhǔn)確稱取蟲草素和腺苷各10.0 mg，用水定容至100 mL，配制成100 mg·L-1的儲(chǔ)備液，將上述儲(chǔ)備液混合后逐級(jí)稀釋至所需濃度。

1.5 樣品的制備

通過優(yōu)化NY/T 2116—2012《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測(cè)定 高效液相色譜法》使提取更充分，準(zhǔn)確稱取粉碎后樣品0.5 g，加入純水20 mL，超聲波提取120 min，5000 r·min-1，離心5 min，取上清液，并重復(fù)提取一次，定容至50 mL，待上機(jī)測(cè)定[8]。

1.6 檢測(cè)低限

本試驗(yàn)采用直接配制純標(biāo)液和陰性樣品提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作兩種曲線來測(cè)定方法測(cè)定低限，將含兩種被測(cè)物的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別用水及提取液稀釋，分別配制成含量為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.2和1.3所確定的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以信噪比（S/N）>10時(shí)蟲草素和腺苷最小含量為液相色譜-質(zhì)譜法的測(cè)定低限。

1.7 回收率

準(zhǔn)確稱取一定量樣品，用微量移液器準(zhǔn)確加入一定量的兩種待測(cè)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成0.05g·kg-1，0.1g·kg-1和0.5g·kg-1三個(gè)濃度水平進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，按上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和測(cè)定，并計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以被測(cè)物在色譜柱上的峰形、靈敏度和保留時(shí)間穩(wěn)定性等為考察指標(biāo)，對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了比較。由于蟲草素和腺苷均溶于水，且正離子模式下0.1%甲酸水溶液能更好地電離，并結(jié)合液相色譜法測(cè)定蟲草素和腺苷的參考條件，確定大比例0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，在兼顧良好分離效果和離子化效率的同時(shí)，我們?cè)?0%甲酸水-甲醇比例基礎(chǔ)上來測(cè)試調(diào)整，最終選擇進(jìn)行梯度淋洗。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜采用自動(dòng)連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行全掃描檢測(cè)，得到被測(cè)物的一級(jí)質(zhì)譜圖及其母離子，再用高純惰性氣體轟擊該母離子，獲得其二級(jí)質(zhì)譜圖及相應(yīng)子離子。結(jié)果表明，兩種物質(zhì)均是正離子模式，并且響應(yīng)值高于負(fù)離子模式，因此，本方法選擇正離子監(jiān)測(cè)的方式。采用本文中1.3質(zhì)譜檢測(cè)條件，再利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)已選定的定性離子對(duì)和定量離子對(duì)進(jìn)行相關(guān)質(zhì)譜毛細(xì)管電壓、碰撞能量、錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使各監(jiān)測(cè)離子豐度和信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，所得最佳質(zhì)譜條件參數(shù)詳見表2。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下兩種被測(cè)物的0.5 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子對(duì)和定性離子對(duì)以及Tic圖見圖1-圖3。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜能夠很好地抗基質(zhì)干擾，結(jié)合蟲草素和腺苷的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，兩者均溶于水和乙醇，比較兩者結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙醇提取或部分乙醇提取的目標(biāo)物提取率較低，水提取效果更好[10]，因此，采用水提取法處理后直接進(jìn)樣的方法。經(jīng)試驗(yàn)，結(jié)果令人滿意且水提取法更干凈、更安全、更易于推廣。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、測(cè)定低限的確定

考慮實(shí)際樣品測(cè)定，分別采取純?cè)噭┖完幮曰|(zhì)樣品提取液配制相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（μg·L-1）為橫坐標(biāo)畫曲線，并在相同的儀器參數(shù)下測(cè)定目標(biāo)物的響應(yīng)值并進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：純?cè)噭┡渲频幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液的響應(yīng)值和陰性基質(zhì)提取液配制而成的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的響應(yīng)值無明顯差異，只是峰形有拖尾現(xiàn)象存在，其程度對(duì)分析結(jié)果影響不大，所以選擇純?cè)噭┡渲频幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)曲線。

用純?cè)噭┡渲瞥傻馁|(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用外標(biāo)法定量，相關(guān)線性良好，而且腺苷的信噪比要高于蟲草素，在濃度為0.01 μg·L-1時(shí)腺苷信噪比（S/N）>10，在濃度為0.05 μg·L-1時(shí)，蟲草素信噪比（S/N）>10，為便于操作，確定統(tǒng)一的檢測(cè)低限為0.05 μg·L-1，檢測(cè)低限為5 μg/kg，相關(guān)參數(shù)見表3。降低檢測(cè)低限有助于蛹蟲草制品等相關(guān)食品的蟲草素和腺苷成分的檢測(cè)，為其保健功能提供重要的數(shù)據(jù)依據(jù)。

2.5 精密度與回收率

本研究通過陰性樣品添加0.05 μg·L-1，0.1 μg·L-1和0.5 μg·L-1濃度點(diǎn)進(jìn)行三次測(cè)試，該方法檢測(cè)蛹蟲草制品中蟲草素和腺苷的加標(biāo)回收結(jié)果見表4。兩種目標(biāo)物的平均回收率為98.0%～108.0%，RSD為0.41%～1.92%，表明該試驗(yàn)方法的回收率和重現(xiàn)性好。

2.6 不同方法分析

試驗(yàn)中，作者分別用液相色譜法[11]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了珍硒蟲草粉中蟲草素和腺苷含量，取6次測(cè)量平均結(jié)果，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蟲草素和腺苷結(jié)果明顯大于液相色譜法檢測(cè)結(jié)果，這是因?yàn)橐合嗌V串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，響應(yīng)效果好，并且取樣量少，提取更充分。

2.7 樣品分析

將五種不同酒基中添加蛹蟲草的樣品按上述方法進(jìn)行分析，結(jié)果如表6，其中兩組數(shù)據(jù)結(jié)果均低于NY/T 2116—2012高效液相色譜法測(cè)定的定量限30 mg/kg，另外《關(guān)于批準(zhǔn)蛹蟲草為新資源食品的公告》中也提及食用量≤2克/天，因此液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蛹蟲草制品中的蟲草素和腺苷具有可行性。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果表明采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蛹蟲草及其制品的方法簡(jiǎn)單，靈敏度更高，結(jié)果更準(zhǔn)確，適用于測(cè)定蛹蟲草及其制品中蟲草素和腺苷的含量。并且通過進(jìn)一步的研究，蛹蟲草中蟲草酸、噴司他丁等其他功能性成分也可以通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定[12]，因此，此文為整合蛹蟲草中功能性成分的測(cè)定方法打下基礎(chǔ)，為以后的研究提供方法依據(jù)。

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【作者簡(jiǎn)介】

王冠宇，女，1986年出生，工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。