曹倩穎，鄭 豪，王婭玲，鄒 輝，顧建紅，袁 燕，劉學(xué)忠，劉宗平，卞建春*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是禾谷鐮刀菌屬霉菌通過聚酮途徑生物合成的非甾體雌激素類真菌毒素，是谷物和谷類產(chǎn)品中最常見的污染物之一，對食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。研究表明，ZEA及其代謝物具有生殖毒性、遺傳毒性、免疫毒性以及致癌性等。近年來，關(guān)于ZEA的生殖毒性研究較為廣泛，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素相似，因而具有與雌激素受體結(jié)合的能力和生物蓄積能力，從而可能導(dǎo)致多種生殖系統(tǒng)疾病[2]。ZEA對神經(jīng)系統(tǒng)也存在毒性作用，但相關(guān)研究尤其是對其作用機(jī)制的研究卻相當(dāng)有限。有研究表明，ZEA對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞和斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育具有毒性作用[3]，相關(guān)毒性機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)[4]。氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的ROS是自噬的重要調(diào)節(jié)因子，它能誘導(dǎo)自噬發(fā)生[5]。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的溶酶體依賴的分解代謝過程。本課題組前期研究證明，ZEA可誘導(dǎo)原代大鼠間質(zhì)細(xì)胞自噬的發(fā)生[6]。且在一定濃度范圍內(nèi)，ZEA可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)大鼠睪丸支持細(xì)胞自噬的發(fā)生[7]。而在豬的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，ZEA可激活自噬，并阻斷自噬流，導(dǎo)致大量自噬體的積聚[8]。但目前尚未有研究表明ZEA所致的神經(jīng)毒性作用是否與自噬相關(guān)。PC12細(xì)胞來源于一種可移植的鼠嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病體外研究。本研究采用PC12細(xì)胞為研究對象，以不同濃度的ZEA處理細(xì)胞，探究ZEA暴露對神經(jīng)系統(tǒng)的影響及其毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞株

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系(PC12細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Sigma公司)，胎牛血清(Gibco公司)，RIPA強(qiáng)裂解液、蛋白酶抑制劑(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，LC3(3868)、p62(5114)、Atg5(9980)、Beclin-1(3495)、Cathepsin D(69854)、Cathepsin B(31718)兔單克隆抗體(美國CST公司)，LAMP-1(20011)鼠單克隆抗體(Santa公司)，SNAP29(12704-1-AP)、STX-17(17815-1-AP)、TFEB(13372-1-AP)兔多克隆抗體(武漢Proteintech公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純級。

IM-AGEQUAMT 400型凝膠成像儀、電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(美國BIORAD公司)，F(xiàn)ACS Aria型流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dick-inson公司)，5810 R型冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)(美國 Millipore公司)，WYJ-875 B型醫(yī)用凈化工作臺(蘇州金燕凈化設(shè)備廠)，超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

PC12細(xì)胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，將對數(shù)生長期的細(xì)胞分別設(shè)置為Con組(二甲基亞砜處理組)、15及30 μmol·L-1(由二甲基亞砜配制)ZEA組，染毒時間為24 h。

1.4 CCK-8法檢測PC12細(xì)胞存活率

用0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液以5×103個·100 μL-1的細(xì)胞密度將PC12細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分為Con組、ZEA 處理組(15、30 μmol·L-1)，每組設(shè)6個重復(fù)?？瞻讓φ战M加入等量PBS，Con組加等量細(xì)胞培養(yǎng)基。染毒24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，將96孔板置于全自動酶標(biāo)儀中，于450 nm波長下測定各孔光吸收值(OD450 nm)，細(xì)胞的存活率=(試驗(yàn)組OD450 nm-空白對照組OD450 nm)/(陰性對照組OD450 nm-空白對照組OD450 nm)×100%。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)

將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞分為Con組、ZEA處理組(15、30 μmol·L-1)，棄去培養(yǎng)基上清液，用預(yù)冷的PBS清洗1～2次，吸凈余液，加入裂解液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑=100∶1)100 μL，刮取細(xì)胞至1.5 mL EP管中，標(biāo)記組別，于4 ℃裂解30 min，超聲破碎細(xì)胞20 s，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min后吸取上清液。使用BCA試劑盒測定各組別蛋白濃度，并用裂解液將各組蛋白質(zhì)濃度調(diào)至一致，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，沸水浴使之變性10 min，置于-80 ℃保存。進(jìn)行Western blot試驗(yàn)時，將蛋白樣品室溫溶解，按照每孔10 μL上樣量進(jìn)行SDS電泳。電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%的脫脂乳作為封閉液，室溫封閉1.5～2.0 h，封閉結(jié)束后TBST清洗，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計將PVDF膜加入相應(yīng)蛋白的一抗稀釋液中，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌5次，每次5 min。根據(jù)一抗選擇對應(yīng)的二抗孵育2 h，TBST洗滌5次，用顯影儀進(jìn)行顯影。

1.6 mRFP-GFP-LC3檢測自噬流

待細(xì)胞密度長到50%左右的時候，根據(jù)mRFP-GFP-LC3的MOI(感染復(fù)數(shù))值，配制所需工作液。加入培養(yǎng)皿體積1/2的工作液后，將細(xì)胞移至37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，所有操作均需避光。培養(yǎng)6 h后，補(bǔ)充培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿的正常體系。

1.7 AO染色觀察ZEA對PC12細(xì)胞酸性環(huán)境的影響

取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞接種于含有爬片的6孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，試驗(yàn)設(shè)置Con組、不同濃度ZEA(15、30 μmol·L-1)處理組，以1 μg·mL-1吖啶橙避光染色15 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 免疫熒光檢測LC3、TFEB定位情況

將細(xì)胞接種于24孔板中，以不同濃度ZEA(15、30 μmol·L-1)作用PC12細(xì)胞24 h。棄去培養(yǎng)液，使用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定30 min，PBS洗滌2次，0.5% TritonX-100室溫條件下固定20 min，PBS洗滌2次，以50 g·L-1BSA室溫封閉30 min后，加入一抗，在4 ℃條件下孵育12 h；PBS洗滌3次后，加入二抗作用1 h，PBS洗滌3次，加入DAPI作用15 min，再次使用PBS洗滌3次后,加入防熒光淬滅劑，封片處理，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇有代表性的細(xì)胞并拍照。

1.9 數(shù)據(jù)的處理與統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)和單因素方差(ANOVA)分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ZEA對PC12細(xì)胞存活率的影響

將處于對數(shù)期的細(xì)胞分別設(shè)置為Con組、ZEA處理組，本課題組前期研究中，關(guān)于ZEA處理使生殖細(xì)胞發(fā)生自噬的作用濃度多為20 μmol·L-1，而ZEA對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用弱于生殖系統(tǒng)，為探究ZEA使PC12細(xì)胞發(fā)生自噬的最佳濃度范圍，使用CCK-8對不同濃度的ZEA(7.5、15.0、30.0、45.0 μmol·L-1)進(jìn)行篩選，每組設(shè)6個重復(fù)，染毒處理24 h后，使用CCK-8檢測細(xì)胞活力。結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，15 μmol·L-1及以上濃度ZEA染毒組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)，而45 μmol·L-1的ZEA組細(xì)胞存活率低于50%，細(xì)胞死亡率過高將會影響試驗(yàn)結(jié)果，因此將采用15、30 μmol·L-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

*.P<0.05，下同

2.2 ZEA對PC12細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

取對數(shù)期PC12細(xì)胞，用不同濃度ZEA(15、30 μmol·L-1)處理24 h后，Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，15、30 μmol·L-1的ZEA處理組ATG5、LC3 Ⅱ、p62表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05)，30 μmol·L-1的ZEA組Beclin1表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，結(jié)果表明，ZEA可引起PC12細(xì)胞自噬體增加及自噬水平升高。

A.蛋白印跡檢測ATG5、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62蛋白表達(dá)水平；B.灰度分析ATG5、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62相對蛋白水平

2.3 ZEA對PC12細(xì)胞自噬體生成的影響

自噬體的形成是自噬過程必不可少的階段。通過免疫熒光檢測定位于自噬體的LC3，結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，ZEA不同濃度處理組都呈現(xiàn)LC3熒光聚點(diǎn)增加的情況，表明PC12細(xì)胞自噬體生成增加，提示ZEA可引起PC12細(xì)胞自噬水平升高。

免疫熒光檢測LC3標(biāo)記的自噬體定位情況

2.4 ZEA對PC12細(xì)胞自噬流的影響

mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后，不同劑量ZEA(15、30 μmol·L-1)處理PC12細(xì)胞，mRFP用于標(biāo)記及追蹤LC3，GFP的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體，由于GFP熒光蛋白對酸性敏感，當(dāng)自噬體溶酶體融合后，GFP熒光發(fā)生淬滅，只能檢測到紅色熒光，即紅綠熒光融合后出現(xiàn)的紅色斑點(diǎn)指示自噬溶酶體，黃色斑點(diǎn)為自噬體，通過共聚焦顯微鏡可對此進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示，Con組呈現(xiàn)出彌散的黃色熒光，隨著染毒濃度的增加，觀察到黃色熒光聚點(diǎn)明顯增多，紅色熒光聚點(diǎn)幾乎不可見，15 μmol·L-1ZEA組最為明顯，提示LC3定位于自噬體內(nèi)，表明ZEA處理使PC12細(xì)胞發(fā)生自噬流阻滯。

mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞檢測自噬流

2.5 AO染色觀察細(xì)胞內(nèi)溶酶體狀態(tài)

吖啶橙是一種親溶酶體劑，也是一種熒光素，可透過正常細(xì)胞膜蓄積在細(xì)胞內(nèi)的酸性結(jié)構(gòu)中，常用來檢測溶酶體的功能狀態(tài)。AO在具有酸性環(huán)境的溶酶體中處于高濃度狀態(tài)，而在細(xì)胞質(zhì)和核中處于低濃度狀態(tài)，溶酶體中的AO呈紅色熒光，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的AO呈綠色熒光。結(jié)果如圖5所示，對照組即正常培養(yǎng)條件下PC12細(xì)胞內(nèi)可見明顯的紅色熒光斑點(diǎn)，體現(xiàn)PC12細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)水平的溶酶體，隨著ZEA染毒濃度的增加，紅色熒光減少,綠色熒光稍有增強(qiáng)，30 μmol·L-1ZEA組紅色熒光幾乎不可見，表明溶酶體受到損害，膜通透化且數(shù)量減少，提示ZEA可能通過損傷溶酶體來阻礙自噬流。

圖5 AO染色觀察細(xì)胞內(nèi)溶酶體狀態(tài)

2.6 ZEA對PC12細(xì)胞溶酶體相關(guān)膜蛋白及組織蛋白酶蛋白表達(dá)水平的影響

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的溶酶體依賴的分解代謝過程。溶酶體的正常運(yùn)作是維持自噬通量的重要保障。前期試驗(yàn)證明，ZEA可能通過損傷溶酶體來阻礙自噬通量，下步試驗(yàn)將驗(yàn)證ZEA是否會對PC12細(xì)胞溶酶體產(chǎn)生損傷。

LAMP1是溶酶體的標(biāo)志蛋白，通常通過檢測LAMP1來識別溶酶體。溶酶體內(nèi)含多種水解酶，組織蛋白酶是其中之一，其具有多種生物活性,是哺乳動物體內(nèi)蛋白水解的主要參與者。而本試驗(yàn)檢測的是細(xì)胞質(zhì)中CTSB和CTSD的表達(dá)水平。在本研究中，對照組及ZEA組(15、30 μmol·L-1)處理24 h后，Western blot檢測LAMP1、CTSB、CTSD蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖6所示，與對照組相比，隨著ZEA染毒濃度增高，CTSD表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，CTSB表達(dá)水平在ZEA為30 μmol·L-1時顯著升高(P<0.05)，LAMP1表達(dá)水平在ZEA為30 μmol·L-1時顯著下降(P<0.05)。有研究報道，LAMP1蛋白在維持溶酶體膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起著重要作用[9]，其表達(dá)水平降低時將影響細(xì)胞自噬功能。表明ZEA可能通過降低LAMP1蛋白水平來對溶酶體造成損傷，同時原本位于溶酶體內(nèi)的CTSB和CTSD在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)升高意味著溶酶體受到損害導(dǎo)致CTSB和CTSD流入細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步證實(shí)ZEA可對溶酶體造成損傷。

A.蛋白印跡檢測LAMP1、CTSB、CTSD蛋白表達(dá)水平；B.灰度分析LAMP1、CTSB、CTSD相對蛋白水平

2.7 ZEA對PC12細(xì)胞中TFEB蛋白的表達(dá)及入核的影響

TFEB是自噬-溶酶體途徑(ALP)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它積極調(diào)節(jié)自噬和溶酶體生物發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)自噬體的形成、自噬體-溶酶體的融合和自噬底物的降解[10]。ERK(細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶)，是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，磷酸化激活的ERK由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性。不同濃度ZEA(15、30 μmol·L-1)處理PC12細(xì)胞24 h后，Western blot檢測ERK、p-ERK、胞質(zhì)及核內(nèi)TFEB蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，隨著ZEA濃度增高，p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，30 μmol·L-1ZEA組核內(nèi)TFEB蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TFEB表達(dá)水平未見顯著性變化。ERK通過磷酸化激活進(jìn)而由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核內(nèi)來調(diào)節(jié)TFEB的活性，與此一致，p-ERK表達(dá)水平的顯著下降伴隨著核內(nèi)TFEB表達(dá)水平得顯著下降，表明ZEA可能通過阻礙ERK的激活來影響TFEB的轉(zhuǎn)錄活性，也表明ZEA對PC12細(xì)胞TFEB蛋白的入核起抑制作用，進(jìn)而影響溶酶體功能和自噬通量。同時使用免疫熒光檢測TFEB的入核表達(dá)情況，結(jié)果如圖7所示,對照組細(xì)胞TFEB入核明顯，細(xì)胞核內(nèi)綠色熒光與藍(lán)色熒光聚集，呈現(xiàn)比細(xì)胞核稍淺的淡藍(lán)色熒光，隨著ZEA染毒濃度的增高，TFEB在細(xì)胞核內(nèi)定位減少，所以細(xì)胞核內(nèi)藍(lán)色熒光強(qiáng)度明顯比對照組加深，表明TFEB入核受到抑制，與Western blot結(jié)果一致。

A.蛋白印跡檢測ERK、p-ERK、TFEB在細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)蛋白表達(dá)水平；B.灰度分析p-ERK、TFEB在細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)相對蛋白水平；C.免疫熒光檢測TFEB入核情況

2.8 ZEA對PC12細(xì)胞自噬溶酶體融合相關(guān)蛋白的影響

自噬的最后一步是自噬體與溶酶體的融合，這是由SNARE蛋白介導(dǎo)的，SNARE蛋白中涉及自噬體定位的Q-SNARE，如STX17和SNAP29對自噬體與溶酶體的融合起重要作用[11]。本研究用不同劑量ZEA(15、30 μmol·L-1)處理 PC12 細(xì)胞后，Western blot 檢測自噬體與溶酶體融合關(guān)鍵蛋白SNAP29、STX17蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖8所示，與對照組相比，隨著ZEA染毒濃度增加，SNAP29、STX17 蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，表明ZEA可通過影響自噬體與溶酶體的融合來阻礙自噬流。

A.蛋白印跡檢測SNAP29、STX17蛋白表達(dá)水平；B.灰度分析SNAP29、STX17相對蛋白水平

3 討 論

細(xì)胞自噬是進(jìn)化上高度保守的，針對胞內(nèi)成分再循環(huán)的溶酶體降解過程。細(xì)胞自噬幫助清除受損的細(xì)胞器、蛋白聚集體和生物大分子，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞物質(zhì)的循環(huán)與再利用，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[12]。在自噬過程中，細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)被自噬體(一種雙膜結(jié)構(gòu))隔離，并被運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行消化[13]。自噬體的形成受到一組自噬相關(guān)蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。其中，LC3是自噬體形成所必需的[14]，也是公認(rèn)的自噬標(biāo)志物。自噬被誘導(dǎo)及自噬流被阻斷均可引起LC3升高，同時p62升高是自噬流阻斷的一個很好的指示標(biāo)志[15]。本試驗(yàn)對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平分析顯示，LC3 Ⅱ、p62、ATG5及Beclin1表達(dá)均增加，提示ZEA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生自噬，而細(xì)胞內(nèi)LC3 Ⅱ增加可能與其阻斷自噬流有關(guān)，免疫熒光試驗(yàn)中LC3熒光聚點(diǎn)增多也提示自噬體增多。為進(jìn)一步驗(yàn)證，作者使用mRFP-GFP-LC3檢測自噬流，由于GFP對酸性敏感，GFP的減弱可指示自噬流活化，當(dāng)LC3定位于酸性環(huán)境的自噬溶酶體時只表現(xiàn)紅色熒光，定位于自噬體時呈黃色熒光，觀察發(fā)現(xiàn)紅色熒光的量明顯少于黃色熒光的量，即自噬流阻滯。試驗(yàn)結(jié)果表明，ZEA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬涉及自噬流阻滯。

為探究ZEA致PC12細(xì)胞自噬流阻滯的機(jī)制，本試驗(yàn)采用AO染色觀察了具有酸性環(huán)境的溶酶體生成情況。AO染色中胞核和胞質(zhì)呈綠色熒光，其聚集在酸性隔室時呈紅色熒光，當(dāng)紅光減弱，綠光增強(qiáng)時，提示環(huán)境中pH升高且溶酶體膜通透化，結(jié)果證明ZEA處理使溶酶體數(shù)量降低伴隨膜通透化。隨后，本試驗(yàn)檢測了自噬體與溶酶體融合階段所必需的蛋白LAMP1[16]及細(xì)胞質(zhì)起蛋白水解作用的CTSB、CTSD[17]蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中CTSB和CTSD表達(dá)呈不同程度的增高，即溶酶體受到損傷，蛋白水解酶由溶酶體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而影響了溶酶體的降解能力。Song等[18]研究發(fā)現(xiàn)，鉛可通過影響CTSB和CTSD的成熟來抑制溶酶體的降解能力，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

TFEB是自噬-溶酶體途徑的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)自噬體的生成和自噬溶酶體的融合等過程[19]。此外TFEB還參與溶酶體的生物發(fā)生和胞吐，通過促進(jìn)溶酶體基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)自噬溶酶體的產(chǎn)生和外排功能[10]。本研究通過檢測p-ERK及TFEB在核內(nèi)外的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)p-ERK及核內(nèi)TFEB蛋白表達(dá)下降，而胞質(zhì)內(nèi)TFEB未見顯著變化。p-ERK從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核內(nèi)調(diào)節(jié)TFEB的活性，ZEA影響TFEB的轉(zhuǎn)錄活性可能通過阻礙ERK的激活來實(shí)現(xiàn)，也表明ZEA對TFEB的入核起抑制作用。免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)ZEA暴露后TFEB入核減少，提示ZEA可能通過抑制TFEB的入核來阻滯自噬流。

在自噬過程中，自噬體和溶酶體的融合是完全降解必不可少的，自噬體的早期生物發(fā)生和溶酶體的晚期降解都需要膜融合活性[20]。自噬體通過與溶酶體融合，將細(xì)胞內(nèi)部待消化的物質(zhì)完全包裹后送入溶酶體中才得以降解并實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用。自噬小體定位的STX17、SNAP29和溶酶體定位的VAMP8或VAMP7被認(rèn)為是參與融合過程的關(guān)鍵因素[11]。自噬啟動過程中，STX17轉(zhuǎn)位到自噬體，與SNAP29形成二元復(fù)合物，然后STX17-SNAP29與溶酶體Vamp8相互作用形成膜復(fù)合物，促進(jìn)自噬體-溶酶體融合[21]。本研究中STX17及SNAP29的蛋白表達(dá)量均降低，ZEA可能通過抑制STX17及SNAP29的表達(dá)及結(jié)合過程來阻礙自噬溶酶體的膜融合，進(jìn)而阻滯自噬流。

4 結(jié) 論

ZEA暴露對溶酶體造成了損傷，影響了其數(shù)量及降解功能，抑制了TFEB入核過程，降低了自噬溶酶體融合蛋白表達(dá)水平，引起自噬流阻滯，而自噬體無法正常降解會堆積在細(xì)胞內(nèi)，造成自噬體數(shù)量增多的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂，提示自噬流阻滯參與了ZEA對PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用。本研究為進(jìn)一步揭示ZEA對神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用機(jī)制提供了重要科學(xué)依據(jù)。