龍亞麗，田啟會

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070; 2.甘肅畜牧工程職業(yè)技術學院，武威 733006)

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)屬于骨髓基質(zhì)干細胞，同時具有橫向向骨分化的能力，因此被認為是骨組織損傷修復的種子細胞之一[1-2]。但骨組織損傷通常伴隨著嚴重的組織腫脹，形成局部缺氧環(huán)境[3]。文獻報道，缺氧一方面可以導致BMSCs生物學特性改變，同時還會造成其分化能力的異常，這為其在應用中的有效性提出挑戰(zhàn)[4-5]。BMSCs骨分化能力是受損骨組織再生和修復的基礎，因此，如何避免缺氧環(huán)境中BMSCs的成骨分化能力異常改變，是BMSCs應用前必需解決的關鍵問題。

BMSCs大量存在于脊髓中，骨碎補作為補腎中藥，根據(jù)“腎主骨生髓”理論，其極可能是能夠促進BMSCs增殖和成骨分化的重要藥物[6-7]。因此，在中醫(yī)理論的支持下，骨碎補總黃酮(total flavonoids ofDrynariaRhizoma, TFDR)可能對BMSCs成骨分化能力具有影響作用。本研究擬通過建立缺氧微環(huán)境，并探究骨碎補總黃酮對缺氧環(huán)境中BMSCs成骨分化的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 犬骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)細胞株購自美國 ScienCell 公司(編號：7500)。

1.1.2 主要試劑及儀器 骨碎補總黃酮(北京岐黃制藥有限公司，批號：國藥準字Z20133051)；間充質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基、胎牛血清(ScienCell)；RT-PCR轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，批號：AKG1212A)，RT-PCR熒光定量試劑盒(TaKaRa公司，批號：AL12412A)，兔抗人Runx2、Osterix多克隆抗體(GeneTex)，山羊多克隆抗體二抗抗兔(Alexa Fluor?488)(Abcam公司)，OriCell TM 狗骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒(Cyagen 批號:CAXMX-90021)，JC-10細胞線粒體膜電位(MMP)活細胞熒光染料(美國AAT公司，批號：2191362)，堿性磷酸酶(AKP)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號: 20170719)；PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

CO2細胞低氧培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，酶標儀(美國BIO-RAD公司)，光學顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡FV10-ASW 2.1 Viewer(日本Olympus公司)，F(xiàn)ACS CelestaTM型流式細胞儀(美國BD公司)，RT-PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗分組 試驗分為空白組(Control)、低氧組(Hyp)、TFDR干預組(Hyp+TFDR)，低氧組和TFDR組細胞培養(yǎng)氧濃度為10%[8]，TFDR的濃度為50 μg·mL-1(前期預試驗篩選出能夠促進BMSCs最大增殖的濃度)。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 取第3代對數(shù)期生長的BMSCs細胞，并調(diào)整成細胞濃度為1×104個·mL-1的單細胞懸液，接種于包被明膠的六孔板內(nèi)，每組定容為2 mL，并設3個平行重復。將細胞置于常氧環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞匯合達到60%～70%時，低氧組和TFDR干預組置于10%的氧濃度環(huán)境中培養(yǎng)4周，TFDR干預組加入含有50 μg·mL-1TFDR的培養(yǎng)基。在第2周結(jié)束后，向六孔板中加入骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化誘導劑，繼續(xù)在10%的氧濃度環(huán)境中成骨誘導分化14 d，TFDR干預組誘導培養(yǎng)基中含有50 μg·mL-1TFDR。

1.2.3 細胞形態(tài)觀察 細胞成骨誘導過程中，每天將各組細胞置于顯微鏡下進行形態(tài)觀察，并采集圖像，重點觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。

1.2.4 茜素紅染色 成骨誘導結(jié)束后，棄掉六孔板中剩余誘導液，PBS清洗；每孔加入 2 mL細胞固定液，固定 30 min后，棄掉細胞固定液，PBS清洗兩次。每孔加入1 mL茜素紅染色液，染色3～5 min。PBS清洗兩次，于顯微鏡下觀察。

1.2.5 堿性磷酸酶(ALP)活性測定 誘導完成后，棄培養(yǎng)瓶中誘導液，PBS反復搖晃清洗，用細胞裂解液裂解細胞，反復吹打后，12 000 r·min-1離心6 min，取上清，檢測ALP活性。在96孔板中分別加入標準品和各組樣品與底物的混合液，37 ℃條件下孵育30 min。每孔加入終止液終止反應，于酶標儀檢測每孔OD405 nm值。ALP活性單位為“U·g-1”。

1.2.6 流式細胞術檢測線粒體膜電位 誘導完成后，用胰酶消化細胞，用PBS清洗1遍后，用PBS將細胞重懸，并移入流式上樣管，將JC-10熒光探針工作液加入細胞懸液，37 ℃避光孵育20 min后，通過流式細胞儀進行檢測。當膜電位水平低時，激發(fā)波長527 nm，通過FITC熒光通道收集；當膜電位水平高時，激發(fā)波長590 nm，通過PE熒光通道收集，每組細胞進行3次重復。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡檢測成骨分化關鍵基因熒光表達 將蓋玻片平鋪入24孔細胞培養(yǎng)板中，將干預后的細胞消化、吹散并接種于6孔板中，匯合度控制在20%左右，進行培養(yǎng)。待細胞匯合度達到60%～70%時，每個孔中加1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定20 min，棄多聚甲醛，再加入1 mL甲醇繼續(xù)固定5 min。棄甲醇，加入1 mL免疫熒光用Blocking buffer，室溫封閉10 min。棄封閉液，加入含兔抗Runx2抗體(1∶500)和Osterix抗體(1∶500)的Blocking buffer，慢搖過夜。PBS液，洗3遍后，加入1 mL含Alexa Fluor? 488 F(ab)羊抗兔熒光二抗(500∶1)的Blocking buffer，避光慢搖1 h。PBS液潤洗細胞5遍，每遍5 min。載玻片上滴加含DAPI染料的封片液，將蓋玻片取出并倒扣在封片液上，于激光共聚焦顯微鏡下觀察，每組細胞隨機挑選3個視野，每個視野隨機選擇10個細胞進行熒光定量，熒光表達水平通過FV10-ASW 2.1 Viewer軟件進行分析。

1.2.8 RT-PCR檢測成骨分化關鍵基因表達水平 干預完成后，提取各組細胞中RNA并進行濃度測定。以20 μL的體系反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進行實時熒光定量檢測，檢測成骨分化關鍵基因Runx2、Osterix的轉(zhuǎn)錄水平，反應條件：95 ℃變性1 min；[95 ℃ 10 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s收集熒光]40個循環(huán)；熔解曲線制備65～95 ℃，0.5 ℃·s-1。

2 結(jié) 果

2.1 TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs形態(tài)學的影響

分別于誘導成骨分化第4、7、14天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞變化?？瞻讓φ战M細胞生成較多高密度鈣結(jié)節(jié)，成片分布；與空白對照組細胞相比，在分化前期(第0～7天)，低氧條件下BMSCs高密度鈣結(jié)節(jié)較少，后期(第8～14天)更明顯；與低氧組相比，加TFDR組細胞誘導分化鈣結(jié)節(jié)均明顯增多(圖1)。

圖1 TFDR對低氧環(huán)境中 BMSCs形態(tài)學的影響

2.2 TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs鈣鹽茜素紅染色的影響

誘導各組細胞向成骨方向分化14 d，茜素紅染色后倒置顯微鏡下觀察，空白對照組BMSCs呈鮮紅色，著色均勻，緊密連接成片；而低氧組細胞紅色鈣結(jié)節(jié)分布較為分散，結(jié)節(jié)明顯較小；相較于低氧組，加TFDR組細胞生成鈣結(jié)節(jié)沉積數(shù)量增多(圖2)。

圖2 TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs 茜素紅染色的影響(10×4)

2.3 TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs ALP活性的影響

在405 nm波長條件下，檢測各組細胞ALP活性值，與空白對照組細胞相比，低氧組細胞ALP活性明顯降低，差異極顯著(P<0.01)；與低氧組相比，TFDR組細胞ALP活性升高，差異顯著(P<0.05)(圖3)。

與Control組相比，*.P<0.05,**.P<0.01；與Hyp組相比，#.P<0.05

2.4 TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs線粒體膜電位的影響

通過流式細胞術檢測各組細胞膜電位變化情況(圖4A～C)，結(jié)果顯示，與空白對照組BMSCs相比，低氧組細胞線粒體膜電位降低，差異顯著(P<0.05)；與低氧組比較，TFDR干預組細胞線粒體膜電位增強，差異顯著(P<0.05)(圖4D)。

A.Control組；B.Hyp組；C.Hyp+TFDR組；D.各組線粒體膜電位；與Control組相比，*.P<0.05；與Hyp組相比，#.P<0.05

2.5 TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs成骨關鍵基因Runx2和Osterix熒光表達的影響

激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞Runx2和Osterix的表達，結(jié)果顯示，與空白對照組BMSCs相比，低氧組細胞Runx2和Osterix熒光表達強度明顯減弱，差異顯著或極顯著(P<0.05或0.01)；與低氧組比較，TFDR干預組細胞Runx2和Osterix熒光表達強度增強，差異顯著(P<0.05)(圖5～7)。

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察各組BMSCs細胞Runx2的表達(10×40)

2.6 TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs Runx2和Osterix基因水平表達的影響

通過RT-PCR檢測各組細胞Runx2和Osterix的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，低氧組細胞Runx2和Osterix基因轉(zhuǎn)錄水平降低；與低氧組比較，TFDR干預組細胞Runx2和Osterix基因轉(zhuǎn)錄水平增強(表2)。

表2 TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs成骨相關轉(zhuǎn)錄因子的影響

3 討 論

多向分化潛能是BMSCs的重要特點，在經(jīng)過誘導后，其可以向多個胚層的組織細胞進行分化，其中包括骨細胞[1-2]。因此，BMSCs在組織再生科學方面的應用是現(xiàn)在的研究熱點之一。目前，大量研究證實，BMSCs能夠修復骨組織損傷，因而，BMSCs在骨損傷的修復方面具有開發(fā)潛力[1-2, 9]。但是，骨損傷通常也會引起肌肉組織的水腫或者是血腫的形成，腫脹將造成局部壓迫，最終導致?lián)p傷局部形成缺氧環(huán)境[3]。盡管BMSCs的再生修復能力已經(jīng)得到認可，但通過文獻可發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境十分容易導致其生物學特性的改變，在不同的低氧濃度下均能造成大鼠間充質(zhì)干細胞成骨、成脂分化能力的降低[10]，這也可能成為制約BMSCs進一步應用于臨床的關鍵。因此，有效地維持低氧環(huán)境下BMSCs成骨分化潛能，是其運用于臨床損傷修復的前提之一。

ALP廣泛分布于人體骨骼中，對骨形成具有重要意義，是BMSCs早期成骨分化能力評估的關鍵指標之一[11]；Runx2是骨細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)骨組織的形成和重建，并與破骨細胞分化及細胞外基質(zhì)的形成密切相關[12-13]。Osterix(Osx)處于Runx2 的下游位置，受到Runx2的表達影響，Osterix是干細胞向成骨細胞分化過程中的重要標志基因。Runx2主要是在成骨細胞早期未成熟分化時期進行調(diào)節(jié)，而成骨細胞在成熟分化時期主要由 Osterix 進行調(diào)控[14-15]。而在成骨分化終末期，鈣結(jié)節(jié)形成的多少是評估骨分化程度最關鍵的效應性指標。本研究以10%的氧濃度為缺氧標準進行低氧環(huán)境的模擬，并發(fā)現(xiàn)缺氧導致BMSCs成骨分化的早期調(diào)控酶ALP和早期調(diào)節(jié)基因Runx2的降低，成熟分化時期的調(diào)節(jié)基因Osterix表達降低，同時也引起關鍵的終末效應性標志物鈣結(jié)節(jié)形成的明顯減少。通過對成骨分化早期、成熟期及終末期相關標志物和基因的檢測結(jié)果均提示，在模擬的低氧環(huán)境中BMSCs成骨分化的能力降低明顯。細胞的分化需要能量供給，線粒體是細胞通過呼吸鏈進行能量代謝的關鍵場所，而在缺氧條件下，線粒體會因為產(chǎn)生的能量不足，無法持續(xù)支持BMSCs成骨分化，導致了成骨分化能力減弱[16-17]。通過檢測細胞線粒體膜電位來評估線粒體的活性，發(fā)現(xiàn)低氧條件下，BMSCs線粒體膜電位明顯下降，證實缺氧可以導致線粒體活性降低。

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察各組BMSCs細胞Osterix的表達(10×40)

與Control組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與Hyp組相比，#.P<0.05

傳統(tǒng)中藥骨碎補具有補腎強骨、活血止痛的功效，根據(jù)“腎主骨生髓”理論，骨碎補對骨相關疾病具有較好的治療作用[18]。而骨碎補的主要成分骨碎補總黃酮(TFDR)在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、骨修復等方面具有明顯功效[5-6,19]。本研究用濃度為50 μg·mL-1的TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs進行干預后，通過檢測上述指標，發(fā)現(xiàn)TFDR能夠有效地提高BMSCs成骨分化關鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix表達，并促進其對成骨分化相關的酶ALP的轉(zhuǎn)錄、表達，增加末期的鈣鹽沉積量，線粒體活性升高，有效維持BMSCs在低氧環(huán)境中成骨分化能力的相對穩(wěn)定。

綜上，缺氧環(huán)境會導致BMSCs成骨分化能力降低，而TFDR能夠維持缺氧環(huán)境中BMSCs成骨分化能力穩(wěn)定。但是，體外模擬的低氧環(huán)境無法完全構(gòu)建出體內(nèi)的狀況，研究還應進一步通過體內(nèi)成骨試驗證實TFDR對低氧環(huán)境中BMSCs成骨分化潛能的保護作用，但TFDR仍然值得被作為維護缺氧條件下干細胞生物穩(wěn)定性的天然化合物進行進一步的研究。

4 結(jié) 論

骨碎補總黃酮能夠維持低氧濃度下犬BMSCs線粒體活性、促進成骨分化關鍵基因Runx和Osterix基因表達，增加鈣結(jié)節(jié)生成，進而提高低氧環(huán)境中犬BMSCs成骨分化能力，為骨碎補總黃酮防護缺氧環(huán)境中犬BMSCs的成骨分化能力降低以及BMSCs在骨折疾病治療中的應用提供試驗依據(jù)。