韓 晨 張玉華 陳潤潤 李 鈾，2 楊具田 陳偉基*

（1西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730100；2西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心/甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅蘭州 730030）

密點麻蜥（Eremias multiocellata）是我國北部和西北部荒漠草原和半荒漠草原最常見的一種卵胎生蜥蜴，在生態(tài)系統(tǒng)中處于消費者的位置，可保證能量遵循食物鏈和食物網(wǎng)逐級流動，在荒漠化草原生態(tài)系統(tǒng)中具有極其重要的作用。密點麻蜥的食性很廣，捕食大量有害昆蟲，對荒漠害蟲的消滅與沙生植物的保護(hù)均具有重要意義[1]。在我國西北部，農(nóng)場等人工基地越來越多，致使密點麻蜥棲息地數(shù)量急劇下降，嚴(yán)重影響其正常生理活動，現(xiàn)在密點麻蜥已被列為中國具有經(jīng)濟和科研價值的陸生動物之一[2]，且在2000年，密點麻蜥被錄入《國家保護(hù)的有益的或有重要經(jīng)濟、科學(xué)研究價值的陸生野生動物名錄》[3]。因此，對密點麻蜥進(jìn)行群體系統(tǒng)發(fā)育分析，對后續(xù)密點麻蜥的保種工作以及資源合理利用具有重要意義。

動物線粒體DNA（mtDNA）具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、母性遺傳等特征，且基因重組發(fā)生率極低。基于這些特點，mtDNA可作為候選標(biāo)志用于生物種群遺傳變異、親緣關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育的研究，尤其適用于種下水平分類研究。編碼蛋白質(zhì)的ND4基因變異適中，含有準(zhǔn)確的系統(tǒng)發(fā)育信息，是系統(tǒng)進(jìn)化和種群遺傳研究中的理想標(biāo)記基因[4]；而NADH脫氫酶第二亞基基因（ND2）進(jìn)化速率適中，能較好地反映出種內(nèi)與群體間的遺傳變化差異及系統(tǒng)分類地位，在鳥類、節(jié)肢動物、魚類、爬行類、哺乳類等動物中被廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育和種群劃分研究[5]。國內(nèi)少有對密點麻蜥進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化的研究，且未有研究者用ND2與ND4 2個基因?qū)γ茳c麻蜥進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。本研究基于線粒體ND2與ND4基因?qū)幭呐c內(nèi)蒙古兩地的密點麻蜥進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，探討其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以期為保種密點麻蜥、合理利用資源及維護(hù)我國西北部荒漠草原生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性與生態(tài)平衡提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

在寧夏回族自治區(qū)與內(nèi)蒙古自治區(qū)兩地5個采集點共采集了20個密點麻蜥肌肉樣本，采樣地點見圖1，樣本信息見表1。

圖1 采樣地點

表1 樣本信息

1.2 基因組DNA的提取

取少量保存于-20℃冰箱或95%乙醇中的肌肉組織，采用通用型基因組DNA提取試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）對其進(jìn)行基因組DNA的提取。使用Qubit4對所提取的基因組DNA進(jìn)行濃度檢查。

1.3 PCR擴增

以GenBank中密點麻蜥mtDNA全序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物，由寶生物工程（大連）公司合成。利用引物對寧夏回族自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)密點麻蜥進(jìn)行線粒體ND2與ND4基因序列的擴增。本研究所用擴增ND2與ND4基因的引物有2對，引物序列見表2。

表2 密點麻蜥引物序列

PCR 擴增體系（25 μL）為上、下游引物各 0.5 μL，濃度為（10 mmol/L）；DNA 樣品（50 ng/μL）2 μL，并添加 12.5 μL Premix Taq（Takara），濃度為 5 U/μL；補加9.5 μL無菌水。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性 45 s，55～60℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物進(jìn)行1.4%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像儀上檢測。將檢測合格的擴增產(chǎn)物送至蘭州天啟基因生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將獲得的測序結(jié)果利用Geneious Prime 2021.1.1（https：//www.geneious.com）處理原始測序文件，將 2 條序列的波峰進(jìn)行拼接得到較完整的序列波峰圖，并對完整的樣本序列波峰圖進(jìn)行校對，最終生成Fasta文件格式，獲得單個樣本的完整序列。所得密點麻蜥ND2、ND4基因序列與Genbank上已發(fā)表的國內(nèi)其他麻蜥的ND2、ND4基因序列用MEGA-X[6]處理，所用信息見表3。利用MEGA-X將處理好的密點麻蜥ND2與ND4基因序列與在GenBank下載的7個國內(nèi)其他麻蜥的部分序列，分別利用鄰近法與最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。Genbank上已發(fā)表的國內(nèi)其他麻蜥物種信息見表3。

表3 Genbank上已發(fā)表的國內(nèi)其他麻蜥物種信息

選用p-disdtance作為模型且運用鄰接法分別基于ND2與ND4基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），通過1 000次自展值檢驗計算支持率來保證系統(tǒng)樹的可靠性。首先，運用MEGA-X軟件中的MODELS功能，計算最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的最佳模型。其次，分析序列數(shù)據(jù)的BIC值（BIC值表示模型對數(shù)據(jù)的解釋度，BIC值越小表示模型對數(shù)據(jù)的解釋力越強），并選取BIC值最低的模型作為最佳模型。通過計算，基于ND2與ND4基因用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的最佳模型分別為HKY+G+I與TN93HKY+G+I。最后，運用最大似然法構(gòu)建ND2與ND4基因的系統(tǒng)發(fā)生樹（圖 3）。

圖2 NJ系統(tǒng)發(fā)生樹

圖3 ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹

2 結(jié)果與分析

2.1 ND2基因和ND4基因序列分析結(jié)果

將檢測合格的PCR擴增產(chǎn)物送至蘭州天啟基因生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示擴增序列長度合適，為所擴增目標(biāo)基因。序列經(jīng)拼接比對后，獲得一致序列：ND2基因長801 bp、ND4基因長1 123 bp。序列已輸入美國生物信息中心（NCBI）的基因庫（Genbank），ND2基因登錄號為MZ516498-MZ516517，ND4基因登錄號為MZ516477-MZ516496。應(yīng)用MEGA-X軟件中Statistic功能分析（僅針對20個密點麻蜥樣本），ND2基因序列中堿基T、C、A和G平均含量分別為29.2%，30.5%，31.4%和8.9%。所有序列中變異位點共有70個，包括58個簡約性信息位點、12個單變異性位點、10個轉(zhuǎn)換以及2個顛換，轉(zhuǎn)換數(shù)明顯高于顛換數(shù)，其中C—T的轉(zhuǎn)換發(fā)生頻率高，顛換僅在A—G發(fā)生。ND4基因序列中堿基 T、C、A和 G的平均含量分別為 27.2%、33.3%、28.7%和10.8%。所有序列中變異位點共89個，包括79個簡約性信息位點、10個單變異性位點、8個轉(zhuǎn)換、2個顛換，其中A—G的轉(zhuǎn)換發(fā)生頻率高，A—T與C—A均發(fā)生顛換，C—G和T—G均未發(fā)生顛換。2個基因的A+T平均含量（60.6%、55.9%）均高于C+G平均含量（39.4%、44.1%），表現(xiàn)出較強的少G偏倚性，符合脊椎動物線粒體DNA序列特征[7]。

2.2 密點麻蜥基于ND2、ND4基因系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ND2基因構(gòu)建的NJ樹與ML樹不完全一致，在NJ樹（圖2）中，20個密點麻蜥樣本分成2支，寧夏地區(qū)與內(nèi)蒙古地區(qū)的樣本各為1支且每個地區(qū)又各自分為2支。在寧夏地區(qū)，陶樂鎮(zhèn)采集點的樣本M60與沙坡頭區(qū)采集點的樣本M81聚為一支，說明兩者間有較近的親緣關(guān)系，且此支也與其他沙坡頭區(qū)采集點的樣本及1個陶樂鎮(zhèn)采集點的樣本M61聚為一支。陶樂鎮(zhèn)采集點的樣本M61與沙坡頭區(qū)采集點的樣本距離較遠(yuǎn)，但仍聚在同一支上。同是陶樂鎮(zhèn)采集點的樣本M59整體上與甘塘鎮(zhèn)采集點所有樣本聚為一支，說明樣本間存在較近的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示，陶樂鎮(zhèn)與沙坡頭區(qū)采集點以及陶樂鎮(zhèn)與甘塘鎮(zhèn)采集點的密點麻蜥樣本間均具有親緣關(guān)系，也說明陶樂鎮(zhèn)與沙坡頭區(qū)及與甘塘鎮(zhèn)的樣本間均可能存在基因流；內(nèi)蒙古地區(qū)鄂爾多斯市鄂托克前旗采集點的2個樣本（M92、M99）與二連浩特市采集點的2個樣本（M195、M196）各自聚為一支，說明每個采集點中的2個樣本間均具有較近的親緣關(guān)系；其余7個其他麻蜥樣本中，麗斑麻蜥與山地麻蜥各聚為一支，且與敏麻蜥、網(wǎng)紋麻蜥、荒漠麻蜥、快步麻蜥與蟲紋麻蜥各分為6支，其中荒漠麻蜥與密點麻蜥雖然具有較遠(yuǎn)的樣本距離，但整體仍聚在同一支上，可能由滲透雜交所致，其余6種麻蜥未與密點麻蜥聚在一支上，說明與密點麻蜥之間具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，其中蟲紋麻蜥最遠(yuǎn)。在ML樹（圖3）中，20個密點麻蜥樣本與荒漠麻蜥、敏麻蜥、麗斑麻蜥、山地麻蜥、網(wǎng)紋麻蜥、快步麻蜥均聚為一支，且20個密點麻蜥樣本間未見有其他分支，而蟲紋麻蜥仍未與其聚為一支，與密點麻蜥樣本親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

基于ND4基因序列構(gòu)建的NJ樹與ML樹所顯示的各試驗樣本的位置和關(guān)系基本一致，且與ND2基因建立的NJ樹大致相同。不同的是，基于ND4基因序列構(gòu)建的NJ樹顯示，7個其他麻蜥樣本中，快步麻蜥與蟲紋麻蜥也聚為一支，說明2個物種間可能存在親緣關(guān)系；而基于ND4基因序列構(gòu)建的ML樹與其NJ樹相比，樣本M80與M79等之間未見有明顯分支。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

mtDNA由于其特有的優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于分子變異種間或種內(nèi)研究：①結(jié)構(gòu)無組織特異性；②更易從材料中提取，母系遺傳方式，便于進(jìn)行群體分析，只需少量個體便能反映群體遺傳結(jié)構(gòu)；③進(jìn)化速度快，一般為核基因組的5～10倍。常用的線粒體分子標(biāo)記（包括蛋白編碼基因，如 Cytb、ND2、ND4）進(jìn)化速率較快，常表現(xiàn)出相對較大的變異，一般適合于親緣關(guān)系較近的物種或種內(nèi)遺傳變異的研究[8]。蔣艷琳等[9]基于ND2基因?qū)鴥?nèi)龍頭魚群體遺傳多樣性進(jìn)行了分析，了解了其種間的遺傳分化情況，揭示了我國龍頭魚種質(zhì)資源現(xiàn)狀，并為其保護(hù)提供了參考依據(jù)；魏 磊等[10]基于ND2和ND4基因合并序列探討了豹屬的分子系統(tǒng)關(guān)系，均驗證了ND2、ND4基因在物種進(jìn)化研究中的可行性。截至目前，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)利用ND2與ND4基因共同探討密點麻蜥系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的相關(guān)研究。

本研究經(jīng)反復(fù)試驗，選取PCR最優(yōu)反應(yīng)體系對來自2個地區(qū)的5個采樣點的20個密點麻蜥樣本mtDNA的ND2與ND4基因分別進(jìn)行擴增。因為核苷酸序列數(shù)據(jù)屬于性狀數(shù)據(jù)，不能通過核苷酸序列來研究物種的進(jìn)化距離，所以得到的擴增結(jié)果經(jīng)測序及Geneious Prime 2021.1.1軟件校對處理后需要用軟件將核苷酸序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為種群個體之間的距離值，再進(jìn)行分析[11]。

本次試驗結(jié)果顯示，密點麻蜥20個樣本間整體聚為一支，根據(jù)采樣地區(qū)不同又大致分為2個亞支，每個亞支間又因采集點不同再次產(chǎn)生分支。其中，陶樂鎮(zhèn)與沙坡頭區(qū)采集點的樣本（M60與M81）以及陶樂鎮(zhèn)與甘塘鎮(zhèn)采集點（M59與M172等）的樣本分別聚為同一支，具有較近的物種距離，說明其均具有親緣關(guān)系，推斷陶樂鎮(zhèn)與沙坡頭、陶樂鎮(zhèn)與甘塘鎮(zhèn)的樣本間均可能存在基因流；從圖 2（a）、圖 3（a）、圖3（b）等3個系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，寧夏地區(qū)的16個密點麻蜥樣本與內(nèi)蒙古地區(qū)的4個密點麻蜥樣本之間距離較遠(yuǎn)，具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，可能因為地貌的特殊性和氣候的差異性會對密點麻蜥種群的適應(yīng)性造成壓力，使得密點麻蜥適應(yīng)各生境下的氣候環(huán)境，進(jìn)而在遺傳上各種群產(chǎn)生了較高的分化程度[12]。同時，基于2個基因所建的4種不同的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，荒漠麻蜥與所采集的所有密點麻蜥樣本整體上也聚為一支，說明二者間有可能也具有較近的親緣關(guān)系，可能是密點麻蜥與荒漠麻蜥之間產(chǎn)生了滲透雜交，這與竇靜莉[13]的研究相吻合。竇靜莉[13]研究討論了密點麻蜥和荒漠麻蜥形成漸滲雜交現(xiàn)象的原因，可能是人類活動使得密點麻蜥與荒漠麻蜥的生活環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致其中一個物種的數(shù)量發(fā)生改變，被迫選擇與親緣關(guān)系非常近且數(shù)量較豐富的物種進(jìn)行交配，這便逐漸形成了雜交。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，物種內(nèi)種群間的基因流可以維持物種自身的完整性，防止不同區(qū)域種群的適應(yīng)性分化或遺傳漂變引起種群產(chǎn)生遺傳分化。但是，自然界中的小種群由于過度的基因交流，可能會產(chǎn)生近交衰退和遺傳多樣性的喪失，種群數(shù)量減少甚至趨于瀕危。與物種內(nèi)的基因流相比，不同物種種群間的基因流或雜交漸滲可以極大地豐富自然界生物多樣化的程度，進(jìn)一步促進(jìn)物種形成[14]。

基于2個基因分別利用鄰接法與最大似然構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不完全一致，未完全解決采集樣品的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系問題，這可能是由構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法不同導(dǎo)致的。此外，所選基因長度的代表性有限和受譜系隨機分選的影響，提供的系統(tǒng)發(fā)育信息不足以解析全面的系統(tǒng)關(guān)系也會導(dǎo)致拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的不一致[15]。

在今后的研究中，應(yīng)盡可能利用更多試驗手段，全方位且系統(tǒng)地揭示密點麻蜥種群遺傳情況與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為其種質(zhì)資源的有效保護(hù)和高效利用提供可靠參考。

3.2 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，寧夏地區(qū)的3個采集點之間存在基因流，且所采集的全部密點麻蜥樣本與國內(nèi)荒漠麻蜥也存在著基因交流。對密點麻蜥種質(zhì)資源的保護(hù)應(yīng)避免密點麻蜥種群間的過度基因交流以及適當(dāng)控制與近緣物種的滲透雜交，防止物種間差別縮小導(dǎo)致遺傳同化，進(jìn)而使得物種滅絕。