付紅萍 方夢(mèng)嬋 萬(wàn)益群

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，如能在早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)，則患者治愈率較高，如發(fā)現(xiàn)過(guò)晚，則是不可避免的致命疾病[1]。因此，早期診斷在臨床上具有重大意義。近年來(lái)的研究表明，腫瘤標(biāo)志物在癌癥患者的早期診斷、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程、確定預(yù)后及幫助制定治療方案中都發(fā)揮非常重要的作用[2-3]。因此，開(kāi)展乳腺癌特異性腫瘤標(biāo)志物篩查很有必要。

代謝組學(xué)是研究生命系統(tǒng)對(duì)病理生理刺激或基因修飾的多參數(shù)代謝反應(yīng)的學(xué)科，通過(guò)分析各種生物樣品(如血液、尿液、唾液及組織等)中的某些或全部代謝產(chǎn)物，建立代謝組(代謝物的定量集合)。目前，代謝組學(xué)被認(rèn)為是一個(gè)功能強(qiáng)大的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各類(lèi)腫瘤標(biāo)志物的篩查和改變的代謝途徑的識(shí)別。代謝組學(xué)研究中使用的主要分析技術(shù)有質(zhì)譜分析技術(shù)和核磁共振技術(shù)，其中質(zhì)譜分析技術(shù)靈敏度較高，被廣泛應(yīng)用于潛在的腫瘤標(biāo)志物的篩查研究[4]。

本文采集了乳腺癌女性患者和健康人的血清樣本，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜法，通過(guò)對(duì)血清樣本進(jìn)行分析，建立了乳腺癌血清代謝指紋圖譜，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出一些顯著性差異的代謝物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 5977A/7890B 氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國(guó)，安捷倫公司)；IKA MS3型迷你振蕩器(中國(guó)，艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司)；TG20.5臺(tái)式高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；MD200-2型氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；AR124CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；MILLI-QS超純水器(美國(guó)，Millipore公司)。

BSTFA+TMCS(99∶1,v/v)(美國(guó)Sigma公司)；吡啶(無(wú)水級(jí)，99.8%，美國(guó)Aladdin公司)；甲氧胺鹽酸鹽(美國(guó)Sigma公司)；甲醇、乙腈、正庚烷、丙酮(色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正二十二烷(美國(guó)Aladdin公司)。

分析標(biāo)準(zhǔn)品：乳酸、甘氨酸、葡萄糖、核糖(美國(guó)Aladdin公司)，纈氨酸、絲氨酸、亮氨酸、甘露糖(美國(guó)sigma公司)。

1.2 色譜分離條件

色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：高純氦氣，流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量：1.0 μl，分流進(jìn)樣(分流比為2∶1)；升溫程序：70℃保持4 min，以8℃/min升至280℃，保持15 min。

1.3 質(zhì)譜條件

電離方式：EI(70 eV)；離子源溫度：230℃；四級(jí)桿溫度：150℃；采集方式：全掃描(35～800 m/z)；溶劑延遲時(shí)間：5.3 min。

1.4 血清樣品前處理方法選擇

血清樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，為了獲得血清樣品中更多內(nèi)源性代謝物的信息，本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、丙酮和乙腈對(duì)血清樣品中代謝物的提取效果，結(jié)果表明，甲醇溶劑的提取效果更好。因此本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇溶劑作為血清樣品的提取溶劑。

1.5 樣品采集及前處理

采集41例乳腺癌女性患者血清樣本，所采集的患者符合以下標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織學(xué)診斷證實(shí)罹患乳腺癌，患者在采集前未接受任何藥物或手術(shù)治療，無(wú)其他癌癥病史。采集20例健康對(duì)照組血清樣本，所采集者符合以下標(biāo)準(zhǔn)：乳腺檢查正常，無(wú)乳腺癌病史及其它癌癥病史。采集晨起靜脈血2 ml，于4000 r/min離心20 min，取其上清液，樣品存于-80℃超低溫冰箱備用。

取100 μl血清于1.5 ml離心管中，加入400 μl甲醇，渦旋1 min，混合均勻，14000 r/min離心15 min。取上清液150 μL，在溫和的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至近干，然后加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(20 mg/mL)，于烘箱中60℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入100 μL BSTFA+TMCS(99∶1,v/v)，于60℃反應(yīng)1 h后，加入150 μL正庚烷(含0.1 g/L正二十二烷，正二十二烷為內(nèi)標(biāo)物質(zhì))，終止反應(yīng)。衍生完成后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用隨機(jī)森林算法(RF)對(duì)血清樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 色譜分離條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了血清樣品在3種升溫程序下的分離效果，依據(jù)色譜峰的數(shù)量以及組分的分離效率，本實(shí)驗(yàn)選擇了第2個(gè)升溫程序。血清樣品的色譜圖如圖1所示，獲得了二十多個(gè)峰，分離效果較好。

圖1 乳腺癌血清樣本的色譜分離圖

實(shí)驗(yàn)分別考察了下列3種升溫程序下組分的分離情況:(1)60℃保持5 min，15℃/min升至300℃，保持10 min；(2)70℃保持4 min，以8℃/min升至280℃，保持15 min；(3)70℃保持5 min，以4℃/min升至280℃，保持10 min；

2.2 血清樣本分析

本實(shí)驗(yàn)采集了健康對(duì)照組個(gè)體樣本20例，乳腺癌Ⅱ期患者樣本12例，乳腺癌Ⅲ期患者樣本29例，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)血清樣品進(jìn)行分析，通過(guò)用NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)化合物鑒定得到24個(gè)共同峰。本實(shí)驗(yàn)用正二十二烷作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，以代謝物的峰面積(Ax)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積(Ai)比值的形式表示定量結(jié)果。最后，成功鑒定了24個(gè)共同峰，定性和定量分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血清中24個(gè)色譜共有峰分析結(jié)果

2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用RF對(duì)乳腺癌Ⅱ期組、乳腺癌Ⅲ期組及健康對(duì)照組樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，3組樣本間的差異明顯，乳腺癌Ⅱ期組、乳腺癌Ⅲ期組及健康對(duì)照組可以被有效地區(qū)分開(kāi)，其中2組乳腺癌組樣本與健康組樣本距離較遠(yuǎn)，乳腺癌Ⅱ期組樣本靠近乳腺癌Ⅲ期組樣本。

圖2 3組樣本的隨機(jī)森林算法分析結(jié)果

2.4 潛在差異性標(biāo)志物的篩選

圖3列出了該分類(lèi)模型的代謝物的變量重要度，結(jié)果表明，在乳腺癌組樣本和健康組樣本中具有明顯差異的代謝產(chǎn)物主要有：肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、1-棕櫚酸單甘油酯。

圖3 各代謝產(chǎn)物的變量重要度

3 討論

本文應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜法，通過(guò)對(duì)乳腺癌患者和健康志愿者血清樣本進(jìn)行分析，建立了乳腺癌血清代謝指紋圖譜。采用隨機(jī)森林算法(RF)對(duì)血清樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析處理。隨機(jī)森林算法(RF)最初是由Breiman在2001年提出的，由于其可以有效地區(qū)分不同組樣本之間的差異，因此得到了廣泛的應(yīng)用[5]。RF是一種受監(jiān)督的機(jī)器學(xué)習(xí)分類(lèi)器，與其他算法相比，它具有良好的性能并具有很大的優(yōu)勢(shì)。RF可以用于高維數(shù)據(jù)的處理(許多特征數(shù)據(jù))，并且不需要進(jìn)行特征選擇。與其他分類(lèi)模型相比，它對(duì)分類(lèi)結(jié)果的偏倚估計(jì)值低，這使得隨機(jī)森林算法可應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域。對(duì)于組間樣本差異，隨機(jī)森林算法可以有效地進(jìn)行區(qū)分。隨機(jī)森林算法可以根據(jù)各代謝物對(duì)分類(lèi)的貢獻(xiàn)程度，得到相應(yīng)的變量重要度信息，對(duì)分類(lèi)貢獻(xiàn)程度大的變量可作為潛在的標(biāo)志物。

我們應(yīng)用隨機(jī)森林算法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)潛在的差異性標(biāo)志物進(jìn)行了篩選，共篩選出4種具有明顯差異的代謝物：肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、1-棕櫚酸單甘油酯。棕櫚酸，又被稱(chēng)為十六烷酸，是動(dòng)植物及微生物中最常見(jiàn)的飽和脂肪酸之一。人體內(nèi)過(guò)量的碳水化合物會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)化，成為棕櫚酸，而在脂肪酸合成過(guò)程中，棕櫚酸是其生成的第一種脂肪酸，它也是較長(zhǎng)脂肪酸的前體，由它可以生成更長(zhǎng)的脂肪酸。硬脂酸，又稱(chēng)十八烷酸，屬于長(zhǎng)鏈脂肪酸。1-棕櫚酸單甘油酯是單?；视王?，是由一個(gè)通過(guò)酯鍵與甘油分子共價(jià)鍵合的脂肪酸鏈組成的甘油酯。單?；视椭久笇?duì)其進(jìn)行分解，將單?；视王マD(zhuǎn)化為游離脂肪酸和甘油。肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸這三種代謝物都是飽和脂肪酸。脂肪酸是人體中主要的能量來(lái)源。生物細(xì)胞膜也是由脂肪酸組成的。脂肪酸貯存于人體的脂肪細(xì)胞中，以備不時(shí)之需。當(dāng)人感到饑餓時(shí)，脂肪酸在細(xì)胞的線(xiàn)粒體內(nèi)進(jìn)行氧化分解，釋放出大量能量。同時(shí)它可以維持細(xì)胞膜的相對(duì)流動(dòng)性，從而確保細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。脂肪酸在許多代謝途徑中起著關(guān)鍵作用，脂肪酸代謝又稱(chēng)為β-氧化，在新陳代謝的過(guò)程中會(huì)生成乙酰輔酶A，然后進(jìn)入檸檬酸循環(huán)。當(dāng)人體需要ATP時(shí)，可以通過(guò)脂肪酸代謝的增加來(lái)生成ATP，而脂肪酸代謝的本質(zhì)就是脂肪酸合成的逆反應(yīng)。乳腺癌患者血清中這三種脂肪酸水平顯著降低，這可能是乳腺癌發(fā)展過(guò)程中大量的能量消耗所造成的[6]。這些脂肪酸的水平變化可能反映了乳腺癌在發(fā)展過(guò)程中發(fā)生的潛在代謝變化，引起脂肪酸代謝紊亂[7]。

肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、1-棕櫚酸單甘油酯的顯著性差異變化反映了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，其會(huì)引起脂肪酸代謝紊亂，有可能成為潛在的乳腺癌標(biāo)志物，為乳腺癌的早期診斷提供了新的方法。