鄭晶冰

作為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的常用治療手段，化療可有效殺滅癌細(xì)胞，改善患者病情，延長(zhǎng)生存時(shí)間。但部分NSCLC患者接受化療后會(huì)出現(xiàn)化療耐藥性，影響治療效果，甚至造成治療失敗，不利于預(yù)后[1]。因此，早期預(yù)測(cè)NSCLC化療患者是否發(fā)生耐藥對(duì)提高化療效果，改善患者預(yù)后具有重要意義。目前，臨床已有研究指出，微小核糖核酸(MicroRNA，miR)與多種癌癥疾病的化療耐藥性密切相關(guān)[2]。研究指出，miR可通過(guò)翻譯抑制或信使RNA降解，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其已成為NSCLC的診斷標(biāo)志物之一[3]。作為miR中的常見(jiàn)類(lèi)型，miR-146a可與原癌基因啟動(dòng)子區(qū)相互結(jié)合，降低原癌基因表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[4]；miR-638已被研究證實(shí)具有類(lèi)似抑癌基因的作用，增加肝細(xì)胞癌預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)[5]。由上述miR-146a、miR-638在腫瘤疾病中的作用特點(diǎn)，推測(cè)血清miR-146a、miR-638水平可能與NSCLC患者化療耐藥性有關(guān)。既往研究多關(guān)注miR-146a、miR-638與腫瘤患者的預(yù)后、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞遷移、侵襲方面[6]，而關(guān)于化療耐藥方面的研究較少?；诖?，本研究將重點(diǎn)分析血清miR-146a、miR-638水平與NSCLC患者化療耐藥性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2019年1月至2020年2月接受化療且化療結(jié)束后產(chǎn)生耐藥性的62例NSCLC患者作為耐藥組，同期納入接受化療且化療結(jié)束后未產(chǎn)生耐藥性的62例NSCLC患者作為敏感組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NSCLC相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且經(jīng)影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)檢查確診；②預(yù)計(jì)生存時(shí)間>3個(gè)月；③惡性腫瘤國(guó)際臨床病理分期(tumor lymph node metastasis，TNM)[8]為ⅢB期；④全部患者均接受相同的同步放化療方案，且放化療周期一致；⑤患者病歷資料、影像學(xué)檢查結(jié)果等資料均完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他胸廓內(nèi)腫瘤的患者；②既往接受手術(shù)治療的患者；③合并傳染性疾病的患者；④合并敗血癥的患者；⑤血小板<80×109/L的患者。2組一般資料比較(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 全部患者均接受相同的同步放化療方案?；煵捎肊P方案：第1、8天，靜脈滴注順鉑50 mg/m2，正規(guī)水化、利尿；第1～5天，靜脈滴注依托泊苷50 mg/m2，1次/天。每4周重復(fù)，化療2個(gè)周期，同步接受三維適形放療，單次劑量46～50 Gy，每周進(jìn)行5次，共進(jìn)行10次。

1.2.2 化療耐藥性(膠滴腫瘤藥物檢測(cè)法)檢測(cè)方法 化療結(jié)束1 d時(shí)，患者接受纖維鏡活檢，取0.5～1 mm的新鮮腫瘤組織，使用組織消化酶進(jìn)行消化，消化后使用篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，最后使用湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司的KC-42B低速離心機(jī)進(jìn)行離心處理，以3000 r/min的離心速度，共離心10 min，離心完畢后取下部分，并將其加入在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基中，制備細(xì)胞混懸液。在冰浴環(huán)境下，制備細(xì)胞-膠原蛋白混合液，接種在24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板。24 h后，加入血漿藥物濃度的順鉑，靜置24 h。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及無(wú)藥物的空白組。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[9]：采用含藥組的細(xì)胞數(shù)量/空白組數(shù)目的百分比評(píng)估藥物敏感性，若<50%則判定為化療敏感，≥50%則為化療耐藥，分別納入耐藥組和敏感組。

1.2.3 基線資料調(diào)查方法 自制基線資料調(diào)查問(wèn)卷，記錄患者一般情況，包括：①年齡；②腫瘤直徑；③病理類(lèi)型；④飲酒史：飲酒時(shí)間>5年，每次攝入酒精量>10 g；⑤吸煙史：連續(xù)或累計(jì)吸煙6個(gè)月或以上；⑥病程。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)方法 (1)血清糖類(lèi)抗原(carbohydrate antigen，CA)125、CA199：采集患者化療前1 d的清晨空腹靜脈血5 ml，以8000 r/min的離心速度共離心6 min，離心完畢后取上清液待檢。使用上海酶聯(lián)生物的試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定血清CA125、CA199水平。(2)血清miR-146a、miR-638：采集患者化療前1 d的清晨空腹靜脈血3 ml，使用長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司的TD4A型低速醫(yī)用離心機(jī)進(jìn)行離心處理，以3000 r/min的離心速度，共離心10 min，離心完畢后取上清液待檢。以總RNA 5 μl為模板，使用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary DNA，cDNA)?？偡磻?yīng)體系為15 μl，反應(yīng)條件如下：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。miR-146a的正向引物序列為：5'-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3'，反向引物序列為：5'-CGAGAAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3'。內(nèi)參基因U6上游序列為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游序列為：3'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5'。miR-638的正向引物序列為：5'-TTGGCCTACCTATAACT-GG-3，反向引物序列為：S'-CTGTAATATGCGGTAAGTCTd。以cRNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃10 min，95 ℃ 45 s，58 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，U6正向引物序列為：5'-ATTG-GAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物序列為：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，計(jì)算miR-146a 的相對(duì)定量表達(dá)水平(ΔCt=CtmiR-146a-CtU6)及miR-638 的相對(duì)定量表達(dá)水平(ΔCt=CtmiR-638-CtU6)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組患者基線資料、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)比

耐藥組血清miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量水平低于敏感組，miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量高于敏感組，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間其他資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組患者基線資料、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)比

2.2 NSCLC患者化療耐藥性與血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析

經(jīng)Kendall's tau-b相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，NSCLC化療耐藥性與血清miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量水平呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.707，P<0.001)，與血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量水平呈正相關(guān)(γ=0.687，P<0.001)。

2.3 血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)NSCLC患者化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的效能分析

將化療前血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量水平作為檢驗(yàn)變量，NSCLC患者化療耐藥性情況作為狀態(tài)變量(1=耐藥，0=敏感)，繪制ROC曲線(見(jiàn)圖1)，結(jié)果顯示，血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)NSCLC患者化療耐藥風(fēng)險(xiǎn)的AUC均>0.70，預(yù)測(cè)價(jià)值較理想，且以化療前血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量cut-off值取2.845、1.875時(shí)，聯(lián)合預(yù)測(cè)的價(jià)值最好。見(jiàn)表2。

圖1 血清miR-146a、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)NSCLC患者化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線圖

表2 血清miR-146a、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)NSCLC患者化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的效能

3 討論

化療已被證實(shí)是癌癥的常用治療方法，但部分患者對(duì)化療藥物存在不同程度的耐藥，當(dāng)患者出現(xiàn)化療耐藥時(shí)，不僅會(huì)影響化療效果，還會(huì)增加病情惡化風(fēng)險(xiǎn)，不利于預(yù)后[10]。因此，為降低NSCLC患者的化療耐藥性，需早期預(yù)測(cè)患者化療耐藥性發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并給出針對(duì)性建議。

研究表明，細(xì)胞凋亡與化療耐藥性密切相關(guān)，凋亡因子的異常表達(dá)可降低化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用，增加耐藥性風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。miRNA可調(diào)節(jié)notch、mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多條腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究表明，miRNA與腫瘤細(xì)胞凋亡、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[13]。作為miRNA類(lèi)型中的一種，miR-146a可與靶基因巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)結(jié)合后抑制靶基因MIF表達(dá)，而MIF的編碼蛋白主要由T淋巴細(xì)胞分泌，能夠抑制腫瘤細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞發(fā)揮招募、遷徙等功能，從而抑制巨噬細(xì)胞功能，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。此外，研究表明，miR-146a可影響c-Jun氨基末端激酶基因表達(dá)，從而參與調(diào)控NSCLC腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡[14]。miR-638也是miRNA中的一種，已被研究證實(shí)在多種惡性腫瘤中的表達(dá)下調(diào)，表明miR-638在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能具有負(fù)向調(diào)控的作用。研究表明，miR-638與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)聯(lián)[15]。因此，結(jié)合上述，推測(cè)血清miR-146a、miR-638可能與NSCLC化療耐藥性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，耐藥組血清miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)低于敏感組，miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)高于敏感組，且經(jīng)雙變量Kendall直線相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，NSCLC化療耐藥性與血清miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)。表明血清miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌患者化療耐藥性具有相關(guān)性。分析其可能的原因?yàn)椋涸┗?C myc oncogene，c-Myc)與細(xì)胞增殖、抑制凋亡等過(guò)程有關(guān)，當(dāng)c-Myc缺失、突變時(shí)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡異常，繼而降低化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，增加化療耐藥性[16]。miR-146a可通過(guò)降低核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)(nuclear factor Kappa Beta，NF-κB)的表達(dá)，促使c-Myc的蛋白表達(dá)下降，促使化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程發(fā)生異常，導(dǎo)致化療耐藥情況發(fā)生[17]。作為一種癌基因，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)與細(xì)胞凋亡抑制有關(guān)，研究表明，Bal-2表達(dá)產(chǎn)物可阻斷或阻礙化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)程，促使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受[18]。研究指出，miR-638表達(dá)上調(diào)，可抑制癌基因bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[19]。最后本研究對(duì)血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)患者化療耐藥風(fēng)險(xiǎn)繪制了ROC曲線，結(jié)果顯示，血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638mRNA相對(duì)表達(dá)單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)NSCLC患者化療耐藥風(fēng)險(xiǎn)的AUC均>0.70，預(yù)測(cè)價(jià)值較理想，且以聯(lián)合預(yù)測(cè)的價(jià)值最好。上述結(jié)果均證實(shí)，NSCLC患者化療前血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量不僅是患者發(fā)生化療耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)因子，且可作為評(píng)估患者發(fā)生化療耐藥性的關(guān)鍵標(biāo)志物。上述結(jié)果也表明，臨床早期監(jiān)測(cè)NSCLC患者化療前血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量，可在積極治療原發(fā)病的同時(shí)實(shí)施合理干預(yù)，如提高患者免疫功能，中西醫(yī)結(jié)合治療等，可能對(duì)降低化療耐藥性發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、提高化療效果有積極意義。雖本研究得到了血清miR-146a mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量與NSCLC患者化療耐藥有關(guān)，但該結(jié)果可能會(huì)受研究設(shè)置條件、樣本量小等因素影響而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏倚，未來(lái)還需進(jìn)一步開(kāi)展研究、探索。

綜上所述，NSCLC患者化療前血清miR-146a mRNA、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量與化療耐藥有關(guān)，臨床可考慮通過(guò)檢測(cè)NSCLC患者化療前血清miR-146a mRNA、miR-638 mRNA相對(duì)表達(dá)量，分析患者化療耐藥風(fēng)險(xiǎn)，以盡早予以合理干預(yù)。