李 雪 朱亞芯 雷立鋒 胡會(huì)杰

在臨床中，肺癌為常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，在惡性腫瘤病死率中居于首位，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%[1]。非小細(xì)胞肺癌有大細(xì)胞癌、腺癌、鱗癌，有較緩慢的癌細(xì)胞分裂生長(zhǎng)、較晚轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的特點(diǎn)，所以，雖然醫(yī)療科技已經(jīng)非常發(fā)達(dá)，但是依然存在約75%的病患于發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)為中晚期，5年生存率極低[2]。微小RNA(miRNA)屬于非編碼序列，有高度保守性，長(zhǎng)度往往有18～24個(gè)核苷酸，它由RNA聚合酶Ⅲ與RNA聚合酶Ⅱ自身的基因或連接于內(nèi)～外顯子、外顯子、內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄為原始miRNA[3]。通過(guò)細(xì)胞核的DGCR8與Drosha實(shí)施處理之后，結(jié)合靶基因mRNA之3'UTR或5' UTR，對(duì)翻譯mRNA進(jìn)行抑制或使其降解[4]。大量的證據(jù)顯示，對(duì)于不一樣的腫瘤類型，miRNA有特異性，它的表達(dá)譜能夠?qū)δ[瘤組織及正常組織進(jìn)行區(qū)分[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因亮氨酸拉鏈腫瘤抑制基因1(LZTS1)在肺癌組織內(nèi)有表達(dá)異常的狀況[6]。基于此，本研究對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1表達(dá)水平及臨床意義進(jìn)行探討。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年6月到2020年12月在我院治療的非小細(xì)胞肺癌患者100例為研究對(duì)象。男性53例，女性47例；年齡25～76歲，平均(53.75±7.26)歲；鱗癌60例，腺癌40例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例；吸煙64例，不吸煙36例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期61例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將通過(guò)病理確診的非小細(xì)胞肺癌病患的癌組織與癌旁正常組織在液氮罐中放置，然后保存于-80℃的冰箱中，檢測(cè)時(shí)從冰箱中取出，于液氮環(huán)境下研磨，選擇TRIzol法對(duì)標(biāo)本中的總RNA進(jìn)行抽提。使用實(shí)時(shí)熒光定量法(qRT-PCR)對(duì)miR-371-5p、LZTS1進(jìn)行檢測(cè)，使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)miR-452、miR-5100進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1 miR-371-5p、LZTS1檢測(cè) 選擇紫外分光光度計(jì)(Nano-Drop 2000C)對(duì)RNA濃度、純度測(cè)定，A260與A280比值介于1.6～2.0者選取實(shí)施下一步；對(duì)逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行配置,把總的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cD-NA；按照qRT-PCR的擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒擴(kuò)增、檢測(cè)cDNA，LZTS1、miR-371-5p以GAPDH、U6為內(nèi)參，它們相應(yīng)的引物序列為：LZTS1正義鏈5'ACGGGCTGCTGAG-GTTTGG3'，反義鏈：5' GGGCTTTCTGGCTGACCTT-GAT3'；GAPDH 正義鏈5' GTGAAGGTCGGAGTCG-GAGTCAACGG3'，反義鏈:5' CCTGGAAGATGGT-GATGGGA3'。miR-371-5p正義鏈:5'GATCGCCGC-CTTGCCGCATCC3'，反義鏈:5' GAGACATCGTGG-TAGACTTT3'；U6正義鏈：5'GAGTACATCTTCAAGC-CATCCTG3'，反義鏈：5' TGCTCTATCTTTCTTTG-GTCTGC3'。LZTS1、miR-371-5p計(jì)算相對(duì)表達(dá)量選擇2-△△Ct。

1.2.2 miR-452、miR-5100檢測(cè) 95℃反應(yīng)條件，10 min預(yù)變性，15 s變性，60℃退火1 min，循環(huán)45個(gè)。miR-452正向引物5'-GCGCAACTGTTTGCAGAG-3'，反向引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。miR-5100正向引物5'-TGGCTCTGCCTTTATTCCCTAGT-3'，反向引物5'-AAATAAGGTGCTTTGGGAATCTGT-3'。U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。內(nèi)參為U6，miR-452、miR-5100計(jì)算相對(duì)表達(dá)量選擇2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織與癌旁正常組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1的表達(dá)水平

肺癌組織中miR-371-5p、miR-452、LZTS1水平明顯低于癌旁正常組織，miR-5100水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 肺癌組織與癌旁正常組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1的表達(dá)水平比較

2.2 癌組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

在非小細(xì)胞肺癌組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1都以相對(duì)表達(dá)水平的均值作為界限，小于平均值為低表達(dá)組，大于平均值為高表達(dá)組。miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1低表達(dá)組分別有51、47、50、53例。非小細(xì)胞肺癌組織中miR-371-5p、LZTS1表達(dá)水平與年齡、吸煙、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)；miR-452表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型顯著相關(guān)(P<0.05)；miR-5100表達(dá)水平同TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 癌組織miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

惡性腫瘤的所有病患中，發(fā)生肺癌的幾率及由肺癌致死的幾率都是最高的，外科手術(shù)是治療肺癌的主要方式[7]。然而，TNM分期屬于Ⅰ期同時(shí)沒(méi)有轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)的病患在進(jìn)行腔鏡下肺癌完全性切除術(shù)或開(kāi)胸肺癌根治術(shù)后，依然會(huì)有25%～30%的病患復(fù)發(fā)[8]。所以，更進(jìn)一步研究肺癌的轉(zhuǎn)移及侵襲機(jī)制，對(duì)于尋找有效的治療與診斷肺癌的靶點(diǎn)及改善肺癌病患預(yù)后都有非常重要的意義。

分子檢測(cè)技術(shù)在近幾年得到了大力發(fā)展，所以對(duì)microRNAs等基因的功能研究也取得了重要成果[9]。雖然microRNAs為不進(jìn)行編碼的蛋白質(zhì)，然而它能夠同mRNA靶基因的3'UTR進(jìn)行配對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯作用進(jìn)行抑制或直接對(duì)mRNA進(jìn)行降解，在靶基因中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用[10]。microRNAs能夠?qū)C(jī)體細(xì)胞的數(shù)種生理進(jìn)程如細(xì)胞分化、增殖、發(fā)育、凋亡等進(jìn)行廣泛的參與，在卵巢癌、血液腫瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、食管鱗癌、胰腺癌等惡性腫瘤中能夠作為早期的診斷指標(biāo)，聯(lián)合數(shù)種miRNA進(jìn)行檢測(cè)亦或是同血清學(xué)、影像學(xué)等輔助手段進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，能夠有效提升早期診治腫瘤特異度、靈敏度[11]。

有文獻(xiàn)顯示，在結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌中miR-371-5p的表達(dá)水平不正常，能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，能夠作為生物學(xué)標(biāo)志物[12-13]。本研究的結(jié)果說(shuō)明miR-371-5p有可能對(duì)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程產(chǎn)生影響并進(jìn)行參與。

相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)，在惡性腫瘤中miR-452一方面能夠起到促癌基因作用，另一方面又能起到抑癌基因作用，如于乳腺癌病患體內(nèi)，miR-452有較高水平，但是于食管癌病患體內(nèi)，miR-452有較低水平[14-15]。本研究中與正常癌旁組織比較，miR-452于癌組織內(nèi)水平較低，這可以說(shuō)明miR-452低水平對(duì)形成非小細(xì)胞肺癌有促進(jìn)作用，它在非小細(xì)胞肺癌內(nèi)起到抑癌基因作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-452低表達(dá)同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型相關(guān)，這說(shuō)明miR-452低水平能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及增殖過(guò)程發(fā)揮促進(jìn)作用。

相關(guān)研究顯示，胰腺癌細(xì)胞內(nèi)，miR-5100增加外源性表達(dá)能夠使細(xì)胞侵襲遷移及增殖得到抑制，于肺癌細(xì)胞株與組織內(nèi)miR-5100表達(dá)增加，同時(shí)miR-5100能使細(xì)胞增殖，所以，miR-5100兼具抑癌基因與促癌基因作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示同正常癌旁組織比較，miR-5100于癌組織內(nèi)水平較高，起到促癌作用。于肺上皮細(xì)胞內(nèi)，Smad2/3能夠被miR-5100激活，對(duì)細(xì)胞出現(xiàn)EMT發(fā)揮促進(jìn)作用，目前miR-5100于非小細(xì)胞癌內(nèi)的作用機(jī)制還不清楚[18]。

在各種細(xì)胞質(zhì)、正常組織中，LZTS1均有表達(dá)，然而于數(shù)種惡性腫瘤內(nèi)表達(dá)不正常，LZTS1于肺癌內(nèi)表達(dá)不正常，是受到了miR-135b的調(diào)控，它在激發(fā)肺癌中可能起到了一定的作用[19-20]。本研究結(jié)果說(shuō)明LZTS1在非小細(xì)胞肺癌中可能發(fā)揮重要作用。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-371-5p、miR-452、LZTS1均為低表達(dá)，miR-5100為高表達(dá)。癌組織中miR-371-5p、LZTS1表達(dá)水平與年齡、吸煙、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，miR-452同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型顯著相關(guān)，miR-5100同TNM分期顯著相關(guān)，故miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1都有可能參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。