鄭大煒 郭 娜 孫 輝

根據(jù)2018年WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)肺癌病例超過200萬人，因肺癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過170萬[1]，而在我國肺癌的發(fā)病率位列所有惡性腫瘤第一位，且近年來患病人數(shù)呈現(xiàn)上升和年輕化的趨勢[2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%以上，具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點[3]，早期NSCLC發(fā)病隱匿且缺乏相關(guān)診斷指標(biāo)，常導(dǎo)致患者預(yù)后不良的發(fā)生[4]。隨著醫(yī)療事業(yè)的進步，各種靶向藥物、免疫制劑在治療NSCLC中取得良好效果[5]，但患者5年生存率仍低于20%。目前對NSCLC發(fā)病分子機制的研究尚不完全明確，尋找新的標(biāo)志物，完善疾病的分子機制對NSCLC的診療及預(yù)后評估具有重大意義。腦膜瘤相關(guān)蛋白(meningioma associated protein 30，MAC30)屬于胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族[6]，在睪丸、胃腸道等正常組織中均有表達(dá)，相關(guān)研究表明MAC30在結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤中表達(dá)增多且常與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)，且MAC30能夠?qū)е禄熌退幍陌l(fā)生[7]，但相關(guān)機制尚不明確。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測MAC30在NSCLC及癌旁組織中的表達(dá)，采用RT-PCR技術(shù)檢測MAC30 mRNA表達(dá)水平，探討MAC30與NSCLC化療效果及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2014年8月至2017年8月于本院就診的64例NSCLC患者作為研究對象，診斷依據(jù)《CSCO原發(fā)性肺癌診療指南(2016)》[8]，依據(jù)國際抗癌聯(lián)合會(UICC)第七版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤進行分期[9]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查、病理診斷確診為NSCLC；②患者身體狀況良好，無化療禁忌證；③患者均為初診，未經(jīng)過放化療、靶向治療及生物免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤患者；②不能耐受化療患者；③臨床資料不全患者。研究對象中男性41例，女性23例，年齡42～74歲，平均年齡(61±9.17)歲。研究對象及家屬均簽署研究知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 化療方案及效果評估

患者行肺癌根治術(shù)后使用TC方案即紫杉醇(PTX)+卡鉑(CBP)方案進行化療[8]，紫杉醇注射液靜滴，175 mg/m2；卡鉑注射液靜滴，AUC=5(mg/ml.min)，化療周期為21 d，患者最多治療6個周期，平均4個周期。周期開始時若患者不良反應(yīng)尚未恢復(fù)可適當(dāng)推遲，最長不超過14 d。若患者發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)時應(yīng)下調(diào)用藥劑量或暫停用藥，PTX下調(diào)為135 mg/m2、CBP下調(diào)為AUC=4(mg/ml.min)。治療結(jié)束后依據(jù)實體腫瘤治療反應(yīng)評價指南[10]將患者分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進展(PD)。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測組織中MAC30表達(dá)情況

使用SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)檢測患者腫瘤組織及癌旁組織中MAC30表達(dá)情況，MAC30定位于細(xì)胞質(zhì)中，染色后呈棕黃色顆粒。染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：按陽性細(xì)胞占比計分，≤5%記0分、>5%～25%記1分、>25%～50%記2分、>50%～75%記3分、>75%記4分。按著色程度計分，無染色記0分、淺黃色記1分、棕黃色記2分、深棕色記3分。以二者得分相乘為最終結(jié)果，>6分為高表達(dá)，≤6分為低表達(dá)。

1.4 RT-PCR技術(shù)檢測MAC30 mRNA表達(dá)水平

使用Trizol法提取患者組織中總RNA，酶標(biāo)儀檢測RNA質(zhì)量。使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)合成cDNA模板，使用美國solarbio公司通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)檢測MAC30 mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 60 s，共35個循環(huán)，引物委托上海生工生物公司合成。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 MAC30在NSCLC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示MAC30在NSCLC組織中高表達(dá)率為81.25%(52/64)，而癌旁組織中高表達(dá)率為23.44%(15/64)，MAC30在NSCLC組織中高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=42.881,P<0.001)。

2.2 MAC30 mRNA在NSCLC組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

RT-PCR結(jié)果顯示NSCLC組織中MAC30 mRNA相對表達(dá)量為(0.74±0.22)，而癌旁組織中MAC30 mRNA相對表達(dá)量為(0.51±0.13)，NSCLC組織中MAC30 mRNA水平明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.201，P<0.001)。

2.3 MAC30水平與患者臨床資料的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，MAC30表達(dá)水平與患者年齡、性別及腫瘤病理類型無關(guān)(P>0.05)，而與患者TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度相關(guān)(P<0.001)，見表1。

表1 MAC30水平與患者臨床資料的關(guān)系/例

2.4 MAC30 mRNA水平與化療效果的關(guān)系

64例NSCLC患者根據(jù)化療效果分為CR組11例、PR組19例、SD組20例、PD組14例。取得不同化療效果的患者組織MAC30 mRNA水平分別為CR組0.53±0.12、PR組0.59±0.17、SD組0.68±0.19、PD組0.87±0.21，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.350，P<0.001)，CR組及PR組患者MAC30 mRNA水平明顯低于PD組患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 MAC30水平與患者預(yù)后的關(guān)系

采用門診、微信、郵件等方式對患者進行隨訪，間隔3個月，以患者死亡或截止到2020年8月計算生存率。64例NSCLC患者死亡25例、存活37例、失訪2例，存活率57.81%，死亡患者均死于腫瘤復(fù)發(fā)或相關(guān)并發(fā)癥。采用Kaplan-Meier生存曲線分析MAC30水平與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明組織中MAC30高表達(dá)的NSCLC患者生存率明顯低于低表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 MAC30水平與患者生存率的關(guān)系

3 討論

MAC30最初被發(fā)現(xiàn)在腦膜瘤中過度表達(dá)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)食管癌、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤中也存在MAC30表達(dá)上調(diào)的情況[11]，提示其促進了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。MAC30是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族成員，通過調(diào)控胰島素樣生長因子(IGF)發(fā)揮生理學(xué)作用[12]。MAC30基因位于常染色體17q11.2，其編碼的cDNA包含5個拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域和4個跨膜結(jié)構(gòu)域[13]，主要分布于細(xì)胞核及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之中。本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者組織中MAC30表達(dá)較癌旁組織相比明顯上調(diào)，且MAC30的高表達(dá)與患者TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度相關(guān)，提示MAC30在NSCLC中發(fā)揮促瘤作用，其高表達(dá)可能與腫瘤疾病的進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

研究表明MAC30能夠通過靶向PI3K/AKT通路調(diào)控腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展[14]?，F(xiàn)有研究已證實PI3K/AKT通路在腫瘤中異常激活，通過上調(diào)VEGF、IL-8等細(xì)胞因子水平誘導(dǎo)腫瘤進一步惡化，發(fā)揮其促瘤作用[15]，而PI3K/AKT通路還能夠調(diào)控PD-1/PD-L1等免疫檢查點蛋白的表達(dá)水平，通過上調(diào)PD-1/PD-L1的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸和腫瘤耐藥的發(fā)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)不同化療效果組中患者組織MAC30 mRNA水平存在明顯差異且CR組及PR組患者MAC30 mRNA水平明顯低于PD組患者，說明MAC30高表達(dá)能夠?qū)颊呋熜Чa(chǎn)生消極影響。研究發(fā)現(xiàn)敲低MAC30后p-AKT表達(dá)水平明顯下降，且PI3K/AKT通路下游蛋白Bcl-2、Bax、Cyclin D1等表達(dá)水平下降[17]，可能通過自噬途徑調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡。而MAC30高表達(dá)通過上調(diào)AKT磷酸化水平導(dǎo)致PI3K/AKT通路過度激活，促進腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移[18]，MAC30高表達(dá)患者化療效果較差可能與PD-1/PD-L1高表達(dá)導(dǎo)致的化療耐藥或細(xì)胞自噬水平改變相關(guān)，結(jié)果與文獻報道結(jié)果一致[15-16]，但相關(guān)機制尚不完全明確，需要進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)MAC30高表達(dá)的NSCLC患者3年生存率低于低表達(dá)患者。相關(guān)研究表明MAC30高表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)，國內(nèi)學(xué)者Shan等[19]的研究表明胸腔積液中MAC30水平能夠作為肺癌預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)發(fā)揮臨床作用，其高表達(dá)常預(yù)示患者預(yù)后不良的發(fā)生；而動物實驗表明下調(diào)MAC30水平能夠延長荷瘤小鼠的生存時間、延緩腫瘤生長速度和浸潤深度[20]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示MAC30能夠作為NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)評價指標(biāo)。

綜上所述，MAC30表達(dá)水平不僅與NSCLC的發(fā)病、轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)，還與患者化療效果及預(yù)后相關(guān)。MAC30高表達(dá)患者腫瘤惡性程度較高，化療效果及預(yù)后較差，可能作為患者預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)發(fā)揮作用。但本研究樣本量較少，且只對蛋白表達(dá)水平進行研究，因此結(jié)果可能存在一定的局限性，需要在后續(xù)的研究中加以改進和完善。