饒德新 潘麗紅 劉 恒 劉雙飛 孫明飛 孟慶江

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率均高的惡性腫瘤，據(jù)報道顯示，全球每年肺癌新發(fā)病例可達(dá)180萬，死亡病例159萬，約占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的19%[1]。肺癌中以非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)數(shù)量最多，其5年生存率不足55%[2]。相關(guān)研究顯示，NSCLC發(fā)生與多種基因表達(dá)密切相關(guān)，而深入研究其發(fā)病機制對提供新的治療思路和方法具有重要意義[3]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度大于200nt的RNA，雖不編碼蛋白質(zhì)、但能通過調(diào)控相關(guān)基因參與機體多種生物學(xué)活動。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中存在異常LncRNA表達(dá)譜，其表達(dá)及功能變化可影響多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[4]。LncRNA ANCR位于染色體4q12上，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在胃癌、膀胱癌等眾多腫瘤發(fā)展過程起作用，但對NSCLC作用尚不明確[5]。LncRNA LINC00355與部分小分子RNA及細(xì)胞周期蛋白存在結(jié)合位點，同樣能影響胃癌、膀胱癌等腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為過程[6]。本次研究通過檢測NSCLC患者血清LncRNA ANCR、LncRNA LINC00355表達(dá)水平，探究其在NSCLC中表達(dá)變化及與患者臨床病理、預(yù)后關(guān)系，初步分析兩者表達(dá)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月到2020年6月我院收治的104例NSCLC患者作為NSCLC組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理確診為NSCLC，參考2015年WHO提出的肺腫瘤分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②初診患者，年齡≥18歲；③臨床資料完整；④患者知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①采血前接受過放化療或其他治療者；②存在其他惡性腫瘤；③合并心肺或其他臟器嚴(yán)重疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病或代謝性疾病。NSCLC組中有男性63例，女性41例，年齡42～63(48.51 5.92)歲；腫瘤直徑≥5 cm 34例，<5 cm 70例；病理類型，鱗癌42例，腺癌62例；分化程度，低分化41例，中分化30例，高分化33例；TNM分期[8]：Ⅰ期32例，Ⅱ期29例，Ⅲ期25例，Ⅳ期18例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例。另選65例體檢健康人員作為對照組，其中男性40例，女性25例；年齡38～66(47.64±6.38)歲。兩組患者性別、年齡比較無顯著差異(P>0.05)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

RT-PCR檢測血清ANCR、LINC00355表達(dá)：于清晨抽取受試者空腹靜脈血5 ml，采集的血液樣本在4℃條件下以1700 g離心10 min，收集血清后以2000 g再次離心10 min，然后將樣品保存在-80℃。在樣品中加入Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成用于檢測lncRNA的cDNA，然后進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件，95℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，β-action擴增23 cycles，其余基因擴增35 cycles，引物序列：ANCR上游5'-GCCACTATGTAGCGGGTTTC-3'，下游5'-ACCTGCGCTAAGAACTGAGG-3'；LINC00355上游，5'-GTCTTGCTTTGTCACCCAGG-3'；下游5'-CTAACACTITGGGCAGCGTT-3'；內(nèi)參β-action：上游5'-ATT GCCGACAGGATG CAGAA-3'，下游5'-GCT GAT CCA CAT CTG CTG GAA-3'。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較NSCLC組和對照組血清ANCR、LINC00355表達(dá)水平；②收集NSCLC組患者臨床資料，分析血清ANCR、LINC00355表達(dá)與患者臨床病理資料相關(guān)性；③分析血清ANCR與LINC00355表達(dá)相關(guān)性；④自NSCLC組患者出院之日起隨訪1年，每個月電話或門診復(fù)查隨訪1次，內(nèi)容為患者生存情況，以患者死亡作為隨訪結(jié)束，比較不同血清ANCR、LINC00355表達(dá)患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組和對照組血清ANCR、LINC00355表達(dá)比較

NSCLC組血清ANCR、LINC00355表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 NSCLC組和對照組血清ANCR、LINC00355表達(dá)比較

2.2 血清ANCR、LINC00355表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清ANCR、LINC00355表達(dá)水平，分別高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，見表2。

表2 血清ANCR、LINC00355表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清ANCR與LINC00355表達(dá)相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，血清ANCR與LINC00355表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.467，P<0.001)，見圖1。

圖1 血清ANCR與LINC00355表達(dá)的相關(guān)性分析

2.4 血清ANCR和LINC00355表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪1年，中位隨訪時間7個月，生存72例，死亡32例，以NSCLC患者血清 ANCR與 LINC00355水平的均數(shù)為界限分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)果顯示，ANCR高表達(dá)組、LINC00355高表達(dá)組1年總生存期(OS)分別低于ANCR低表達(dá)組、LINC00355低表達(dá)組(P<0.05)，見表3，圖2、3。

表3 血清ANCR與LINC00355表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

圖2 不同ANCR表達(dá)患者的生存曲線

圖3 不同LINC00355表達(dá)患者的生存曲線

3 討論

NSCLC是臨床最常見的肺腫瘤類型，目前主要治療方法為手術(shù)和化療，但總體預(yù)后較差。隨著對NSCLC發(fā)生機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)多種LncRNA基因的表達(dá)異常，且對腫瘤發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[9-10]。LncRNA相對于小分子RNA(miRNA)在結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，在人體血液中表達(dá)更能反映機體的病理變化，故對疾病診斷治療及提示預(yù)后更具有應(yīng)用價值[11]。

ANCR是一種在多個腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用的LncRNA，如朱金庚等[12]發(fā)現(xiàn)ANCR能通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶序列2的增強子表達(dá)從而促進(jìn)胃癌的發(fā)展。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ANCR在人體乳腺癌組織中表達(dá)水平較低，而在體外實驗中過表達(dá)ANCR可抑制乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的增殖和侵襲能力[13-14]。本次研究采用RT-PCR檢測ANCR在血清中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NSCLC組血清ANCR水平明顯高于對照組，提示ANCR可能在NSCLC中起到促癌作用。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)ANCR表達(dá)與宮頸腺癌組織的細(xì)胞增殖指數(shù)(ki-67)值呈正相關(guān)，而ki-67與腫瘤細(xì)胞惡性增殖程度及預(yù)后密切相關(guān)[15]，提示ANCR表達(dá)量能反映惡性腫瘤預(yù)后。本次研究中TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清ANCR表達(dá)分別高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，且ANCR高表達(dá)組OS低于ANCR低表達(dá)組，提示ANCR表達(dá)與NSCLC臨床病理特征及不良預(yù)后存在一定相關(guān)性，是癌癥治療過程中可能探索的新靶點。

LINC00355是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在胃癌、膀胱癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)的另一種LncRNA，主要在惡性腫瘤中起到促癌作用[16-18]。本次研究中NSCLC組血清LINC00355表達(dá)均高于對照組，提示LINC00355在NSCLC中同樣起到促癌作用。本次研究顯示，相關(guān)研究顯示，LINC00355可能通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)化(EMT)及上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(p21)表達(dá)從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[19]。此外，本次研究中TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清LINC00355表達(dá)分別高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，且LINC00355高表達(dá)組OS低于LINC00355低表達(dá)組，提示LINC00355表達(dá)同樣與NSCLC臨床病理特征及不良預(yù)后相關(guān)。Pearson相關(guān)性分析顯示，血清ANCR與LINC00355表達(dá)呈正相關(guān)，提示LINC00355與ANCR在NSCLC患者表達(dá)具有相同趨勢和高度相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，LINC00355能激活其他相關(guān)LncRNA表達(dá)，并在細(xì)胞中表現(xiàn)出廣泛調(diào)節(jié)作用[20]，推測這可能是LINC00355與ANCR表達(dá)呈正相關(guān)的原因之一，而具體機制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，血清LncRNA ANCR、LncRNA LINC00355在NSCLC中均表達(dá)上調(diào)，且與患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，能在一定程度上反映NSCLC患者短期預(yù)后，兩者有望成為提示NSCLC病情進(jìn)展及預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。未來可進(jìn)行長期的隨訪調(diào)查，進(jìn)一步分析兩LncRNA對NSCLC遠(yuǎn)期預(yù)后的臨床價值。