孫國(guó)慶 鄭保良 胡耀宇

最近的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明中國(guó)前列腺癌發(fā)病率逐年上升，有可能成為威脅男性健康的最主要?dú)⑹諿1-3]。目前雖然有多種前列腺癌治療方案，包括手術(shù)切除、去勢(shì)、放化療以及其他姑息療法，但是其5年生存率尚不能達(dá)到理想水平[3-6]。前列腺癌的轉(zhuǎn)移常發(fā)生于骨、肺等器官[7-9]，已有大量研究表明其轉(zhuǎn)移與多種信號(hào)和分子相關(guān)[7]，但是關(guān)于其轉(zhuǎn)移發(fā)生的決定性機(jī)制并沒(méi)有定論。近年的研究表明淀粉樣前體蛋白(APP)在腫瘤的血行轉(zhuǎn)移中具有重要作用[10-11]，當(dāng)在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)APP后，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著上升[12-14]。與此同時(shí)，在宮頸癌，前列腺癌以及結(jié)腸癌和胰腺癌患者的癌癥組織中也檢測(cè)到APP的顯著高表達(dá)，且患者預(yù)后與APP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[15-17]。但是在腫瘤組織中，APP為什么呈高表達(dá)并無(wú)研究報(bào)道，了解其上調(diào)表達(dá)可能有助于尋找腫瘤治療的新靶點(diǎn)。已有大量研究表明TGF β在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸中具有重要意義[18-20]。一方面，TGF β可以通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞，從而抑制腫瘤免疫的發(fā)生[21-23]；另一方面，TGF β也可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中多種基因的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[24-26]，但是目前尚無(wú)研究表明TGF β與前列腺癌細(xì)胞APP的表達(dá)之間具有相關(guān)性，因此本研究旨在證實(shí)APP與TGF β誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

前列腺癌PC-3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；total RNA提取試劑盒購(gòu)自碧云天試劑公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR購(gòu)自TAKARA公司；β actin、APP、p-Smad 1、p-Smad 2、smad兔抗人一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自CST；TGF β購(gòu)自Protein tech公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天；引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 前列腺癌PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM-F12完全培養(yǎng)基中，置于37℃，含有5%的CO2細(xì)胞孵育箱，培養(yǎng)2～3天待密度達(dá)到90%時(shí)1∶3傳代。

1.2.2 細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè) 參照TGF β在其他癌細(xì)胞的研究中方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種至24孔板之后，適應(yīng)生長(zhǎng)24 h更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入20 ng/ml的TGF β處理48 h[27-28]，收集并用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，添加至Transwell遷移小室上腔，下腔加入FBS終濃度為6%的含血清培養(yǎng)基。上下腔組合完整，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。終止遷移后取出上腔，用棉簽除去聚碳酸酯膜內(nèi)壁未遷移細(xì)胞，晾干后用終濃度為0.1%的結(jié)晶紫染液于37 ℃染色15 min，取出再次晾干后于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并拍照。

侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell遷移小室上腔預(yù)先添加基質(zhì)膠溶液，待基質(zhì)膠沉積于碳酸酯膜之后吸棄廢液，如上所述重懸細(xì)胞后加入上腔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h并如上染色并拍照。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化重懸后，以每孔5×105個(gè)的密度接種到6孔板中，保證密度在40%左右，培養(yǎng)過(guò)夜后，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)濃度后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA，程序?yàn)?37 ℃孵育15 min，85 ℃反應(yīng)5 sec，反應(yīng)結(jié)束保存于4 ℃。隨后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qPCR反應(yīng)，程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性15 sec；95 ℃變性5 sec，62 ℃退火30 sec，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以β actin為內(nèi)參，通過(guò)2-△△ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下所述：β actin上游：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT；下游：GCTGTCACCTTCACCGTTCC。APP上游：CAAGCAGTGCAAGACCCATC；下游：AGAAGG-GCATCACTTACAAACTC。

1.2.4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化重懸后，以每孔5×105個(gè)的密度接種到6孔板中，保證密度在40%左右，適應(yīng)培養(yǎng)過(guò)夜后，提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，加入相應(yīng)體積的上樣緩沖液并煮沸5 min后凍存于-20℃。配制SDS-PAGE凝膠后對(duì)上述樣本進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉2 h，添加β actin、APP、p-Smad 1、p-Smad 2、smad稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗，添加已經(jīng)稀釋的HRP-IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗后使用發(fā)光液進(jìn)行曝光，以β actin作為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較在SPSS 21.0軟件中使用雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)，多組間兩兩比較使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF β對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用

前列腺癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，使用相應(yīng)濃度的TGF β處理細(xì)胞，通過(guò)遷移小室檢測(cè)TGF β對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果如圖1、圖2所示，20 ng/ml的TGFβ能顯著提升腫瘤細(xì)胞的遷移能力，即增加了細(xì)胞跨膜遷移侵襲的數(shù)目(P<0.05)。

注：*表示P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：*表示P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 TGF β通過(guò)Smad途徑對(duì)APP表達(dá)的促進(jìn)作用

前列腺癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，使用相應(yīng)濃度的TGF β處理細(xì)胞，提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)TGF β對(duì)Smad信號(hào)通路相關(guān)分子活化水平的影響。結(jié)果如圖3所示，20 ng/ml的TGF β顯著提升腫瘤細(xì)胞Smad 1和Smad 2的磷酸化水平(P<0.05)。 前列腺癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，使用相應(yīng)濃度的TGF β處理細(xì)胞，提取總蛋白和總RNA后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和qPCR檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，無(wú)論在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平，20 ng/ml的TGF β都顯著提升腫瘤細(xì)胞APP的表達(dá)(P<0.05)。

注：A為凝膠電泳圖；B為蛋白印跡灰度值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*表示P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：A為凝膠電泳圖；B為蛋白印跡灰度值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C為qPCR檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)基因含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*表示P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 LY2109761對(duì)TGFβ/Smad途徑誘導(dǎo)的APP表達(dá)的抑制作用

前列腺癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，使用相應(yīng)濃度的TGF β處理細(xì)胞，提取總蛋白和總RNA后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和qPCR檢測(cè)TGF β對(duì)Smad信號(hào)通路相關(guān)分子活化水平以及APP表達(dá)水平的影響。結(jié)果如圖5所示，Smad抑制劑LY2109761能夠逆轉(zhuǎn)TGF β的生物學(xué)效應(yīng)，即降低Smad 1和Smad 2的磷酸化水平(P<0.05)，并下調(diào)APP的表達(dá)(P<0.05)。

注：A為SPS-PAGE凝膠電泳圖；B為蛋白印跡灰度值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C為qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞的相對(duì)基因含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*表示與對(duì)照組相比，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#表示與TGF β處理組相比，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 APP表達(dá)對(duì)PC-3細(xì)胞的遷移和侵襲的影響

采用TGF β/Smad前列腺癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，使用相應(yīng)濃度的TGF β處理細(xì)胞，同時(shí)使用Smad抑制劑LY2109761處理細(xì)胞控制細(xì)胞內(nèi)APP的表達(dá)，通過(guò)遷移小室檢測(cè)TGF β或TGF β+Smad抑制劑對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果如圖6所示，APP表達(dá)高的組別其遷移和侵襲能力明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而在對(duì)APP表達(dá)加以抑制后，細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯下降(P<0.05)。

注：A為各組細(xì)胞的遷移能力；B為遷移各組細(xì)胞的侵襲能力；C為遷移實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。D為侵襲實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*表示與對(duì)照組相比，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#表示與TGF β處理組相比，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

前列腺癌的轉(zhuǎn)移一直是其治療的難點(diǎn)，也是腫瘤患者生存率不佳的主要原因[1,27-28]。前列腺癌的轉(zhuǎn)移與多種因素相關(guān)[1,4]，但是目前尚無(wú)定論，因此深入研究其轉(zhuǎn)移的機(jī)制有助于找到新的治療靶點(diǎn)。

APP是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的細(xì)胞膜蛋白，在多種腫瘤組織中顯著高表達(dá)[14-16]。TGF β與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)[21,24]，然而TGFβ在前列腺癌中的機(jī)制尚未清楚。本研究通過(guò)遷移小室實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)TGF β能夠促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞的遷移和侵襲。在進(jìn)一步研究中，發(fā)現(xiàn)TGF β能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著上調(diào)APP的表達(dá)水平，且對(duì)此效應(yīng)產(chǎn)生的APP表達(dá)的抑制能夠明顯降低細(xì)胞的遷移和侵襲水平。這提示TGF β可能通過(guò)上調(diào)APP的表達(dá)水平產(chǎn)生上述效應(yīng)。

研究表明，Smad 1和Smad 2磷酸化后處于激活狀態(tài)，能夠移位入核影響下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[29-31]，并以此調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。在對(duì)TGF β對(duì)前列腺癌影響的機(jī)制研究中，本研究檢測(cè)了TGF β下游分子Smad 1和Smad 2的磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF β顯著上調(diào)了Smad 1和Smad 2的磷酸化，從而促進(jìn)其入核并調(diào)節(jié)其下游的基因APP的表達(dá)。當(dāng)使用Smad 抑制劑LY2109761處理后，發(fā)現(xiàn)此途徑引起的APP表達(dá)也受到抑制，遷移小室證實(shí)細(xì)胞的遷移和侵襲能力也隨之減弱，這說(shuō)明APP的表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力密切相關(guān)。

盡管如此，本實(shí)驗(yàn)仍然存在缺陷。本實(shí)驗(yàn)采用的APP表達(dá)抑制方法存在缺陷，只能夠通過(guò)抑制TGF β/Smad通路途徑實(shí)現(xiàn)，這會(huì)使得此通路下游的各種蛋白情況均受到影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾。關(guān)于APP在前列腺癌中的作用仍然存在爭(zhēng)議。BCR survival圖顯示APP在前列腺癌中起抑癌作用，與本文結(jié)果相反。這可能是由于本次實(shí)驗(yàn)采取的APP抑制方法導(dǎo)致了其他一些蛋白的抑制，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生了干擾。本文僅探討了APP對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖遷移的影響，不能完全反映APP在癌細(xì)胞中的其他作用。此外，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在體外條件得到的，在體內(nèi)前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移還受到各種因素的調(diào)節(jié)，因此APP對(duì)機(jī)體內(nèi)癌細(xì)胞的作用還需要進(jìn)一步探討。

總體而言，本研究初步證實(shí)TGF β/Smad通路能夠使得前列腺癌細(xì)胞中的APP水平上調(diào)，并可能通過(guò)此途徑促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，APP很可能是前列腺轉(zhuǎn)移抑制的新靶點(diǎn)。