羅翔，黃寶學 ，曾如筆，陸志方，鮑鋒光

(1.田東縣祥周鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 田東 531502；2.田東縣動物疫病預防控制中心，廣西 田東 531500； 3.田東縣畜牧技術(shù)推廣站，廣西 田東 531500)

肉雞細菌性腹瀉是養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)中常見的疾病，主要由禽大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌及沙門氏菌3種細菌感染引起發(fā)病[1]。大腸桿菌與巴氏桿菌為條件性致病菌，可以在雞的呼吸道和消化道存在，沙門氏菌隨帶菌雞糞便排出體外后仍可繼續(xù)繁殖，環(huán)境污染面大[2]，不同日齡階段的雞易感性強。當雞抵抗力下降時，這3種病原菌感染雞時均能引起消化道代謝紊亂，從而引起雞腹瀉并常繼發(fā)或混合感染其他病原，造成雞發(fā)病率和死亡率上升，料肉比高，死淘率增加，雞群均勻度差，雞只生長受阻，發(fā)育不良，嚴重影響雞群的生產(chǎn)性能和經(jīng)濟效益。為有效控制該病的發(fā)生與流行，2021年筆者通過對初診發(fā)現(xiàn)存在發(fā)病的田東縣祥周鎮(zhèn)20個規(guī)模肉雞場(戶)開展流行病學調(diào)查，采集59份樣品送獸醫(yī)實驗室進行檢測，重點分析3種病原菌感染情況并進行藥敏試驗，探討疾病的發(fā)病原因和防治措施，為今后防控肉雞細菌性腹瀉提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2021年1—12月，收集田東縣祥周鎮(zhèn)20個規(guī)模肉雞場(戶)患有腹瀉癥狀且剖檢可見典型的雞大腸桿菌病、沙門氏菌病、巴氏桿菌病單一或混合病變特征的病死雞或瀕死雞的病料59份(心、肝、脾)。每個雞場采集不超過3份。

1.2 主要試劑

鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍平板培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白大豆瓊脂平板培養(yǎng)基(TSA、含10%血清)、營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、生化試驗用培養(yǎng)基、生化反應管。藥敏試驗藥敏紙片：阿莫西林、頭孢曲松、新霉素、土霉素、丁胺卡那、恩諾沙星、磺胺二甲氧嘧啶、氟苯尼考。以上試劑均購自廣東省環(huán)凱生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

1日齡商品肉雛雞300只、小白兔30只。

1.4 流行病學調(diào)查

深入養(yǎng)雞場詢問了解飼養(yǎng)的數(shù)量、病史和治療用藥等情況，對死亡和腹瀉癥狀明顯的雞只進行剖檢并記錄病理變化。

1.5 細菌病原診斷

1.5.1細菌的分離培養(yǎng)

第一階段：將每份病料同時劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂平板，置于37℃培養(yǎng)24h，初步培養(yǎng)出不同的菌落。第二階段：在第一階段的麥康凱瓊脂上分別挑取典型大腸桿菌與沙門氏菌的優(yōu)勢菌落分別繼續(xù)接種到伊紅美藍瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取優(yōu)勢菌落進行涂片革蘭氏鏡檢，將鏡檢結(jié)果為大腸桿菌和沙門氏菌的菌落分別在不同的營養(yǎng)瓊脂平板進一步劃線純化，獲得純培養(yǎng)物后，置4℃冰箱備用。在第一階段的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上挑取典型巴氏桿菌優(yōu)勢菌落繼續(xù)接種到TSA平板培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24h，挑取優(yōu)勢菌落進行涂片革蘭氏鏡檢，將鏡檢結(jié)果為巴氏桿菌的菌落在普通肉湯培養(yǎng)基上進一步劃線純化，獲得純培養(yǎng)物后，置4℃冰箱備用。

1.5.2生化試驗

取各細菌的純培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、靛基質(zhì)、明膠、尿素酶、MR試驗、VP試驗的生化鑒定管，37℃ 培養(yǎng)24h，觀察并記錄反應結(jié)果。

1.6 藥敏試驗

挑取經(jīng)生化鑒定確認為大腸桿菌、沙門氏菌與巴氏桿菌的分離菌株，參照徐強[3]的紙片擴散法，對8種藥物進行藥敏試驗。分別將分離菌制成菌懸液，后將菌懸液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基適當位置，待菌液被完全吸收后，將各藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24h，測量抑菌圈直徑大小。參照試劑說明書進行判定。

1.7 致病性實驗

將1日齡雛雞飼養(yǎng)3d，挑選236只健康雛雞，隨機分為59組，每組4只，57組設為試驗組，另2組設為對照組。34個試驗組雛雞皮下注射不同的大腸桿菌分離菌肉湯培養(yǎng)物、23個試驗組雛雞皮下注射不同的沙門氏菌分離菌肉湯培養(yǎng)物，0.2mL/只；對照組無菌注射生理鹽水0.2mL/只。挑選健康小白兔26只，隨機分成13組，設試驗組12組，對照組1組。試驗組用不同的巴氏桿菌肉湯培養(yǎng)物皮下注射，0.2mL/只，對照組無菌注射生理鹽水0.2mL/只。接種后，每隔4h觀察記錄雞與小白兔的發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 流行病學調(diào)查結(jié)果

共調(diào)查雞只62516羽，均有腹瀉癥狀，總體發(fā)病率33.62%，死亡率 11.3%，病死率33.62%。3種細菌病在不同日齡雞中均有發(fā)生，大腸桿菌病主要侵害31～60日齡的肉雞，沙門氏菌病主要發(fā)生于30日齡以內(nèi)的肉仔雞，巴氏桿菌病主要發(fā)生于60日齡以上的肉雞。雙重感染的治愈率比單一感染病例低，轉(zhuǎn)良時間比單一感染長2～3d。多數(shù)雞場發(fā)現(xiàn)雞群發(fā)生腹瀉后不考慮發(fā)病原因，直接使用氨基糖苷類抗生素藥物，存在不合理使用甚至濫用抗生素的情況。

2.2 細菌病原學檢測結(jié)果

2.2.1細菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

對59份樣品經(jīng)過第一階段與第二階段的細菌分離培養(yǎng)后，有34株細菌疑似大腸桿菌：這34株細菌在麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上形成紅色菌落；在伊紅美藍瓊脂平板上形成圓形稍隆起、黑色帶金屬閃光的菌落，直徑約為2.5mm；在營養(yǎng)瓊脂上形成圓形凸起、半透明、灰白色的菌落；鏡檢發(fā)現(xiàn)細菌革蘭氏染色陰性、散在或成對、兩端鈍圓的桿菌，由此初步鑒定這34株細菌為大腸桿菌。有23株細菌疑似沙門氏菌：這23株細菌在麥康凱瓊脂平板上形成圓形光滑隆起、灰白色的小菌落；在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成淡紅色菌落，菌落中心有黑褐色；營養(yǎng)瓊脂平板上形成無色半透明、圓形、邊緣整齊的小菌落；染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌、大小均一、多散在、無芽孢和莢膜，初步鑒定這23株為沙門氏菌。有12株細菌疑似巴氏桿菌：這12株細菌在鮮血瓊脂平板上長出灰白色露珠樣針尖大小菌落，菌落周圍不溶血；在TSA培養(yǎng)基上形成光滑、濕潤的水滴樣小菌落；普通肉湯培養(yǎng)基表面形成菌環(huán)，管底有黏稠沉淀；在麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上不生長；染色鏡檢可見兩端鈍圓、中央微凸、單個或成雙排列的革蘭氏陰性小桿菌，初步鑒定這12株為巴氏桿菌。

2.2.2生化試驗結(jié)果

通過對34株可疑大腸桿菌、23株可疑沙門氏菌、12株可疑多殺性巴氏桿菌分別進行10項生化項目鑒定，結(jié)果表明本次分離的菌株符合大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌的生化特性。見表1。

表1 分離菌生化試驗結(jié)果

2.2.3病料組織檢測結(jié)果

在59份樣品中，檢出大腸桿菌34份，占57.63%；沙門氏菌23份，占38.98%；巴氏桿菌12份，占20.34%。單一感染樣品數(shù)為49份，占樣品總數(shù)的83.05%，雙重感染樣品數(shù)為10份，占樣品總數(shù)的16.95%，均為大腸桿菌與沙門氏菌或巴氏桿菌共感染。見表2。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

對大腸桿菌分離株34株、沙門氏菌23株、巴氏桿菌12株進行8種抗生素的藥敏試驗，大腸桿菌對土霉素耐藥率(94.12%)最高，其次為磺胺二甲氧嘧啶(73.53%)；沙門氏菌對阿莫西林、磺胺二甲氧嘧啶耐藥率(82.61%)最高，其次為恩諾沙星(65.22%)；巴氏桿菌對頭孢曲松耐藥率(83.33%)最高，其次為阿莫西林(75%)。3種細菌均為多重耐藥菌株，見表3。

表2 病料組織檢測結(jié)果

表3 藥敏試驗結(jié)果

2.4 致病性試驗結(jié)果

大腸桿菌試驗雞于接種后8h陸續(xù)開始發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、拒食或少食、白色腹瀉糞便、肌肉干癟、肛羽污濕，24h后開始陸續(xù)死亡 。接種后總體發(fā)病率達89.62%，死亡率為78.68%，生理鹽水對照組感染率為0。從病死雞的心、肝組織中可回收到致病菌，表明試驗的34株菌為致病性大腸桿菌。沙門氏菌試驗雞于接種后6h陸續(xù)開始發(fā)病，表現(xiàn)為下痢、拉白色糊狀糞便、肛門周圍羽毛被糞便污染、排便困難、有尖叫聲，12h后開始死亡。接種后總體發(fā)病率達100%，死亡率為89.13%，生理鹽水對照組感染率為0。從病死雞的心、肝組織中可回收到細菌，表明試驗的23株菌為致病性沙門氏菌。巴氏桿菌攻毒后16～24h, 試驗組小白兔全部死亡，2只對照組小白兔健康存活。取死亡小白兔肝臟涂片染色鏡檢并同時分離培養(yǎng), 可見卵圓形小桿菌, 細菌的形態(tài)、染色特征與初次分離的細菌相同，表明試驗的12株菌為巴氏桿菌。

3 討論

本調(diào)查涵蓋田東縣祥周鎮(zhèn)20個養(yǎng)雞場(戶)，在臨床癥狀、病理剖檢、收集有關流行病學資料等的基礎上對59份疑似感染大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌雞組織進行細菌分離鑒定檢測，檢測結(jié)果基本能夠反映當前田東縣祥周鎮(zhèn)肉雞細菌性腹瀉主要病原菌的感染流行情況。通過對收集到的59份病料分離鑒定，感染率由高到低依次為大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌。大腸桿菌總分離率為57.63%，低于曹民川[4]、宋玉偉[5]等報道的陜西省銅川市、河南省許昌地區(qū)大腸桿菌分離率66.67%、100%。沙門氏菌總分離率為38.98%，低于元振杰[6]等報道的西藏雞沙門氏菌分離率57.65%。巴氏桿菌總分離率為20.34%。不同地區(qū)分離率的差異，可能與雞群為單一感染或混合感染、臨床診斷的準確性、采樣前已使用抗生素藥物治療、發(fā)病程度、病程長短、采樣地點的雞場獸醫(yī)衛(wèi)生狀況等因素有關。大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌是當前造成田東縣祥周鎮(zhèn)肉雞細菌性腹瀉的主要病原, 在雞群中普遍存在，對不同日齡、性別、品種的肉雞均可感染，不但可以單一感染, 還可以混合感染 ，對養(yǎng)雞業(yè)的危害日益嚴重。收集病料中單一感染占總樣品數(shù)的83.05%(49/59), 混合感染占總樣品數(shù)的16.95%(10/59)，不同感染類型給雞場造成了不同程度的死亡，雙重感染治愈率最低且疾病轉(zhuǎn)良時間最長。提示養(yǎng)雞場(戶)肉雞一旦發(fā)生腹瀉，在流行病學調(diào)查的基礎上應首先進行病原菌的分離鑒定，找出引起感染的主要病原，確定感染病原類型后再制定防治方案，有針對性地進行防控。

致病性試驗結(jié)果表明，3種病原分離菌均具有強致病性且均可引起雞腹瀉，其中沙門氏菌引起雛雞的發(fā)病率與死亡率最高，發(fā)病率達100%，死亡率為89.13% ，這與元振杰[6]等、王亮[7]等致病性試驗得出的發(fā)病率與死亡率結(jié)果基本相符。雞場一旦發(fā)病會導致大量的雛雞死亡[8]，提示養(yǎng)殖場(戶)在育雛階段要重點做好沙門氏菌的防控，減少其造成的經(jīng)濟損失。沙門氏菌主要通過垂直與水平兩種傳播途徑感染，生產(chǎn)上引進雛雞要嚴格檢疫，要提升飼養(yǎng)管理水平，嚴格執(zhí)行全進全出飼養(yǎng)模式，定期做好圈舍內(nèi)外的環(huán)境衛(wèi)生消毒，在不同飼養(yǎng)階段對不同日齡的雛雞給予適宜的養(yǎng)殖密度，同時要做好通風、防寒保暖，保持舍內(nèi)干燥，提高環(huán)境飼養(yǎng)質(zhì)量，防止雞群應激反應。在用藥物治療病雞時，除了使用抗生素殺滅沙門氏菌外還要考慮革蘭氏陰性菌在死亡后會產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素對病雞的內(nèi)臟器官會產(chǎn)生嚴重的毒害作用，在治療時要加入魚腥草等抗內(nèi)毒素中藥[9]。

由于大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌血清型眾多，且不同血清型間缺乏交叉保護力，故疫苗免疫接種不作為首選的預防手段，目前，還是要通過藥物防治來控制疫病的發(fā)生。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，多數(shù)雞場用抗生素治療肉雞細菌性腹瀉時，重復使用單一藥物且盲目加大用量，但效果欠佳。抗菌藥物的不合理使用給養(yǎng)殖生產(chǎn)增加了成本，增加病原菌耐藥性[10]，破壞雞群腸道菌群，增加治療難度。當前，許多學者[11-13]在廣西不同地區(qū)分離的雞源致病性大腸桿菌、雞源致病性沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌普遍存在多重耐藥現(xiàn)象。本研究對所獲得的3種病原菌致病性分離株進行目前臨床常用的8種抗生素藥敏試驗,發(fā)現(xiàn)3種病原菌的耐藥性都非常嚴重，大腸桿菌和巴氏桿菌呈5種耐藥，沙門氏菌呈6種耐藥，且有交叉耐藥現(xiàn)象，都對阿莫西林、土霉素、磺胺二甲氧嘧啶3種藥物的耐藥率超過15%。在臨床控制雞細菌性腹瀉的過程中，應結(jié)合病原菌檢測、耐藥性分析結(jié)果，制定科學、合理的治療方案。