羅 俊,黨 露,鄭鹿平,劉金玲,柴書軍,趙 東,楊艷艷,滕 蔓
(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物免疫學重點實驗室/河南省動物免疫學重點實驗
室,河南 鄭州 450002;2. 河南省農(nóng)業(yè)科學院 中英禽病國際研究中心,河南 鄭州 450002;3. 廣州醫(yī)科大學 附屬第三醫(yī)院,廣東 廣州 510095)
異質(zhì)核糖核蛋白(hnRNPs)分屬于一大類RNA結合蛋白(RBP)家族,目前共鑒定出19個hnRNP 基因,其編碼的蛋白質(zhì)大小介于30~120 ku。hnRNPs蛋白各家族成員間沒有共有結構域,多樣性的蛋白質(zhì)結構決定了該家族蛋白質(zhì)功能的多樣性。該家族成員除了參與核酸代謝的多個方面,包括選擇性剪接、mRNA 穩(wěn)定、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)功能以外,還參與DNA 修復和端粒延長、染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄、mRNA 3′端加工、維持mRNA 穩(wěn)定性以及促進或抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1?4]。異質(zhì)核糖核蛋白AB(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AB,hnRNPAB)是該蛋白質(zhì)家族中一個特殊的成員,其直系同源物在N 端存在進化上保守的獨特肽結構域[5?7]。除與其他家族成員在細胞水平上調(diào)節(jié)基因表達的功能之外,hnRNPAB還在脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中具有重要作用[8?11],同時還參與了腫瘤的發(fā)生[12?14]。
雞hnRNPAB 蛋白包含有8 個轉(zhuǎn)錄變體和2 個同型蛋白質(zhì),其中p37 型含有353 個氨基酸殘基,而p32型含有284個氨基酸殘基[15]。前期研究發(fā)現(xiàn),作為細胞癌基因miR-155 的同源物,馬立克病毒(Marek’s disease virus,MDV)編碼的miR-M4-5p 可特異性靶向識別并下調(diào)雞hnRNPAB 蛋白的表達,從而促進原代雞胚成纖維細胞(CEF)和永生化細胞系DF-1 的細胞增殖,同時還抑制細胞的凋亡,可能與MDV 的致瘤性有關[13]。目前,市售商品化抗hnRNPAB蛋白的抗體只能識別哺乳動物細胞,無法識別禽源hnRNPAB 蛋白,制約了開展進一步相關研究。鑒于此,通過原核表達系統(tǒng)制備雞hnRNPAB蛋白,免疫小鼠后通過細胞融合技術篩選制備hnRNPAB 單克隆抗體,為開展hnRNPAB 蛋白相關功能研究奠定基礎。
pET-30a(+)載體、SP2/0細胞、HEK293T、BHK-21、Marc-145、MDBK 傳代細胞系均為本實驗室保存;E.coli克隆菌株DH5α 和表達菌株BL21、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ、ExTaq酶、DNA Ligation Kit 2.0 和DNA Marker 等均購自TaKaRa 公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Solarbio 公司;Ni-NTA Fast Start Kit 購自Qiagen 公司;PEG-1500 購自德 國 Roche 公 司 ;NE-PERTMNuclear and Cytoplasmis Extraction Reagents 購自Thermo 公司;NcmECL Ultra(NCM)顯影液和無血清細胞凍存液購自新賽美公司;FITC-羊抗鼠IgG 和HRP-羊抗鼠IgG 購自美國Abbkine公司;細胞培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司。
用Primer Premier 5.0 軟件設計擴增雞hnRNPAB基因(GenBank 登錄號:NM_205328)的特異 性 PCR 引 物 , 上 游 引 物 : 5′-GGAATTCGAAGGCGACCAGATCAACG-3′,下游引物: 5′-CCTCGAGTAAAGGCGAAAGGAGCTGC-3′(下劃線標示限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點),常規(guī)方法提取CEF 總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以此為模板,PCR 擴增雞hnRNPAB基因的部分片段。切膠回收經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析純化的PCR 產(chǎn)物,連接pMDTM19-T 載體并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞,挑選陽性質(zhì)粒測序鑒定。用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切測序正確的pMDTM19-T-hnRNPAB質(zhì)粒,膠回收后用DNA Ligation Kit 2.0 連接酶連接獲得pET-30a-hnRNPAB重組表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coliBL21,并涂含氨芐青霉素的LB 平板,過夜培養(yǎng),將PCR 鑒定為陽性的單菌落擴大培養(yǎng)、提取質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定。
用含100 mg/L 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基活化含pET-30a-hnRNPAB重組表達質(zhì)粒的菌種,置37 ℃搖床,以250 r/min 振搖培養(yǎng)菌液,至其OD600達到0.6~0.8 時加入IPTG,32 ℃繼續(xù)誘導培養(yǎng),收集菌體,離心并重懸后進行超聲破碎,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析裂解后的上清液和沉淀中蛋白質(zhì)的表達情況和可溶性。將檢測確定誘導表達的菌種按上述方法大量誘導表達,收集菌體按照Qiagen 公司的Ni-NTA Fast Start Kit 試劑盒說明書進行蛋白質(zhì)純化,測定純化的蛋白質(zhì)含量,通過SDS-PAGE電泳檢測純化結果。
將純化的hnRNPAB 蛋白與佐劑乳化后免疫6周齡Balb/c 雌性小鼠5 只(50 μg/只),背部皮下分點注射,其中弗氏完全佐劑用于首免,弗氏不完全佐劑用于此后的加強免疫,每次免疫間隔3周,共免疫4次,4 免后的第21 天斷尾采血。以純化的hnRNPAB 蛋白包被酶標板(10 mg/L),分別利用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)和間接免疫熒光試驗(IFA)來檢測免疫小鼠血清效價。選擇其中效價最高的小鼠,以2 倍免疫劑量且不加佐劑的抗原腹腔注射小鼠進行超免,3~5 d 后無菌取小鼠脾臟用于細胞融合。
采用常規(guī)方法進行細胞融合,SP2/0 細胞與超免后Balb/c 小鼠脾細胞按1?10 的比例混合后,加PEG-1500 融 合 劑1 mL,用RPMI-1640/HAT/10%FBS培養(yǎng)液將融合后的細胞分散接種于6塊96孔細胞板中,200 μL/孔,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后取雜交瘤細胞上清進行檢測。按照iELISA方法,以純化的hnRNPAB 蛋白包被酶標板(10 mg/L),檢測雜交瘤細胞上清,將結果為陽性的雜交瘤細胞轉(zhuǎn)至24 孔細胞板擴大培養(yǎng)3~4 d,選擇iELISA 復測強陽性孔進行有限稀釋,一般2~3次,最后選出狀態(tài)良好的單克隆雜交瘤細胞,擴大培養(yǎng)后離心收集細胞,用無血清細胞凍存液重懸后凍存于液氮中。
采用體內(nèi)腹水誘生法生產(chǎn)單克隆抗體。將滅菌液體石蠟腹腔注射經(jīng)產(chǎn)的Balb/c母鼠進行致敏預處理,0.5 mL/只。收集3×106~5×106個單克隆抗體雜交瘤細胞,無菌PBS洗2遍,最后重懸于0.5 mL無菌PBS 中,腹腔接種已致敏至少14 d 的Balb/c 經(jīng)產(chǎn)母鼠。觀察7~14 d,待小鼠腹部明顯膨脹時無菌采集腹水,在5 000 r/min 條件下離心15 min,收集上清,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
收集1×106個CEF,2 000 r/min 離心5 min,棄去上清,按照NE-PERTMNuclear and Cytoplasmis Extraction Reagents 試劑盒說明書提取CEF 核蛋白,-80 ℃保存?zhèn)溆?。將提取的CEF 核蛋白進行SDS-PAGE 電泳,然后將凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,5%脫脂奶粉通過室溫封閉PVDF膜2 h,PBST 洗滌3 遍;加待檢的抗hnRNPAB 蛋白單克隆抗體,置4 ℃冰箱孵育過夜,PBST 充分振搖洗滌;加1%脫脂奶粉稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶1 000),37 ℃孵育1 h,PBST 充分振搖洗滌。將NcmECL Ultra(NCM)顯影液A、B(1∶1)混合后滴在膜上孵育1~3 min,置凝膠成像儀中觀察結果。
分別用IFA 和ICA 對篩選的單克隆抗體與不同來源細胞蛋白質(zhì)的反應性進行檢測。取8~10 日齡SPF 雞胚,常規(guī)方法制備CEF,同時從液氮中取出凍存的HEK293T、BHK-21、Marc-145、MDBK 和PK-15 傳代細胞系進行復蘇,分別接種到24 孔細胞板中,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去生長液,加預冷的甲醇/丙酮(1∶1)200 μL/孔,室溫固定15 min;棄 去 固 定 液,PBST 洗3 遍,加 入 待 檢 的hnRNPAB 單克隆抗體,置37 ℃溫箱孵育30 min;PBST 洗3 遍,加入FITC-羊抗鼠IgG 和HRP-羊抗鼠IgG(1∶500),37 ℃溫箱孵育30 min;PBST 洗3 遍后加PBST(200 μL/孔),熒光顯微鏡下觀察細胞染色結果。
PCR 擴增雞hnRNPAB部分基因片段,回收純化PCR 擴增產(chǎn)物并連接pMDTM19-T 載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,對PCR 鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒并進行測序分析,將符合預期的pMDTM19-ThnRNPAB質(zhì) 粒 用EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙 酶 切,回 收hnRNPAB基因片段并連接轉(zhuǎn)化E.coliBL21 感受態(tài)細胞,挑取單菌落,擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,分別進行雙酶切和PCR鑒定,可見1 317 bp大小的電泳條帶,符合預期(圖1)。測序分析結果也與預期完全相符,確認成功構建重組表達質(zhì)粒pET-30ahnRNPAB。
用IPTG 誘導培養(yǎng)pET-30a-hnRNPAB轉(zhuǎn)化的E.coliBL21 陽性菌液8 h 后,收集并超聲破碎菌體,通過12% SDS-PAGE 電泳分析超聲上清液和沉淀中蛋白質(zhì)的表達情況。結果表明,雞hnRNPAB 蛋白以可溶性形式表達。上清液中可溶性表達的目的蛋白質(zhì)用樹脂Ni 進行純化,收集洗脫液經(jīng)SDSPAGE 電泳分析,結果表明,純化后可獲得純度較高的hnRNPAB蛋白(圖2)。
圖2 雞hnRNPAB蛋白的誘導表達及純化蛋白的SDSPAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed and purified chicken hnRNPAB protein
用純化后的hnRNPAB 重組表達蛋白4 次免疫Balb/c 小鼠,最后一次免疫第21 天,iELISA 檢測免疫小鼠血清效價。結果顯示,5 只小鼠均產(chǎn)生較高效價的抗體,其中2 號小鼠血清iELISA 效價最高,達到了1∶32 000(表1)。IFA 檢測結果也顯示,抗體熒光染色主要集中在CEF 細胞核內(nèi)(圖3)。故選擇2 號小鼠進行超免,無菌摘取超免小鼠脾臟,與SP2/0 細胞(10∶1)混合后進行細胞融合,9 d 后取雜交瘤細胞上清,利用iELISA 試驗篩選效價最高的雜交瘤細胞株,進行3 輪亞克隆后獲得1 株穩(wěn)定分泌抗雞hnRNPAB 蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞株,命名為5H5-H1。收集5H5-H1 雜交瘤細胞接種石蠟致敏的經(jīng)產(chǎn)母鼠,成功制備了抗雞hnRNPAB 蛋白的單克隆抗體腹水。
表1 免疫小鼠血清iELISA效價Tab.1 The iELISA titers of serum from immunized mice
圖3 hnRNPAB免疫小鼠血清與CEF反應的IFA染色(100×)Fig.3 IFA staining of CEF cells using serum from hnRNPAB-immunized mice(100×)
提取CEF 核蛋白,經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)膜封閉,然后依次孵育5H5-H1 單克隆抗體腹水(1∶4 000)和HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶1 000),進行Western blot 鑒定。結果顯示,單克隆抗體5H5-H1特異性識別雞hnRNPAB 蛋白,出現(xiàn)2條特異性反應條帶,分別約為37 ku 和32 ku,與預期的雞hnRNPAB蛋白大小相符(圖4)。
圖4 Western blot分析5H5-H1單克隆抗體與雞hnRNPAB蛋白的反應性Fig.4 Specific reaction of mAb 5H5-H1 to chicken hnRNPAB protein determined by Western blot analysis
待原代CEF 和傳代細胞HEK293T、BHK-21、Marc-145、MDBK、PK-15 長至稀疏單層,固定細胞,分別孵育5H5-H1 單克隆抗體腹水(1∶4 000),然后再分別孵育FITC-羊抗鼠IgG 和HRP-羊抗鼠IgG,鑒定5H5-H1 單克隆抗體與不同細胞的反應性。IFA 和ICA 結果顯示,5H5-H1單克隆抗體與CEF 及5 種哺乳動物細胞均發(fā)生特異性反應,并且這種特異性染色都是集中在細胞核(圖5)。
圖5 IFA和ICA染色檢測5H5-H1單克隆抗體與6種不同細胞的反應性(100×)Fig.5 Reaction of mAb 5H5-H1 to six cell lines determined by IFA and ICA(100×)
哺乳動物的hnRNPAB 蛋白氨基酸同源性很高,基本都在92%以上,而雞的hnRNPAB 蛋白氨基酸序列與哺乳動物hnRNPAB 蛋白氨基酸序列同源性僅為83.3%~86.2%。但不同物種的hnRNPAB 蛋白仍具有一些共同結構,如RNA 識別基序(RNA recognition motif,RRM)、Gly-Rich 基序和其他輔助區(qū)域[2]。筆者所在課題組長期致力于家禽腫瘤病的相關研究,前期研究發(fā)現(xiàn),MDV 編碼的miR-M4-5p可靶向下調(diào)雞hnRNPAB基因的表達,進而調(diào)控細胞增殖,與MDV 腫瘤發(fā)生有關[13]。為開展相關功能研究及信號通路分析,曾先后購買多種進口或國產(chǎn)的商業(yè)化抗hnRNPAB 蛋白的抗體。然而,這些抗體與大部分哺乳動物細胞的hnRNPAB 蛋白反應性良好,但均與禽類細胞hnRNPAB 蛋白不發(fā)生反應,這很可能是由于禽類與哺乳動物hnRNPAB 蛋白氨基酸同源性不高所致。
為了制備能夠與禽源細胞hnRNPAB 蛋白反應的單克隆抗體,本研究首先對雞hnRNPAB 蛋白與哺乳類hnRNPAB 蛋白氨基酸進行了同源性序列比對,進而對雞hnRNPAB 蛋白抗原性和疏水性進行分析,去掉雞hnRNPAB蛋白N末端相對疏水且含有較少潛在抗原的區(qū)域,選取雞hnRNPAB 蛋白與哺乳類hnRNPAB 蛋白比較保守的抗原性區(qū)域,進行引物設計,從CEF 中PCR 擴增了雞hnRNPAB基因,成功構建了pET-30a-hnRNPAB原核表達載體,轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細胞,經(jīng)IPTG誘導后獲得了可溶性表達的hnRNPAB 蛋白,以純化后的可溶性重組蛋白多次免疫Balb/c 小鼠后進行細胞融合,多種方法篩選最終獲得了能夠穩(wěn)定分泌抗雞hnRNPAB蛋白的特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株5H5-H1,并制備了相應的單克隆抗體腹水。IFA 和Western blot鑒定結果表明,5H5-H1單克隆抗體與雞CEF細胞核內(nèi)表達的hnRNPAB 蛋白產(chǎn)生了很強的特異性反應。進一步的IFA 和ICA 分析表明,該單克隆抗體與其他來源于人、鼠、猴、牛和豬的多種哺乳動物細胞系表達的hnRNPAB 蛋白反應特異性均良好。綜上,本研究制備的hnRNPAB 單克隆抗體,不僅識別雞源細胞表達的相應蛋白質(zhì),而且可以與多種哺乳動物細胞表達的hnRNPAB 蛋白產(chǎn)生特異性反應,可同時滿足禽類和哺乳類hnRNPAB 蛋白相關的功能研究的需要,具有比較重要的科學價值。