硫化氫對植物根系生長及組蛋白去乙?；傅挠绊?/h1>
2022-04-23 02:42:36裴鋅鋅陳虹宇劉華杰
河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年2期
裴鋅鋅，陳虹宇，李 曉，劉華杰，李 華
（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002）
硫化氫（H2S）是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后被發(fā)現(xiàn)的第3 種氣體信號分子，高濃度的H2S 可抑制線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶的活性，是細(xì)胞代謝的毒性物質(zhì)，低濃度H2S 對細(xì)胞生理功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[1?2]。YANG 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，H2S 在動(dòng)物體內(nèi)可以內(nèi)源產(chǎn)生，并且可通過血管平滑肌細(xì)胞上的三磷酸腺苷敏感性鉀通道（Adenosine triphosphate?sensitive potassium，KATP）調(diào)節(jié)血壓。在植物中，H2S 可調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)、種子萌發(fā)、根系發(fā)育、衰老、果實(shí)后熟等[3]諸多種生理過程，還能響應(yīng)各種生物和非生物（干旱、鹽、重金屬、高溫等）脅迫[4?5]。在植物根系中，H2S 對植物根系的調(diào)節(jié)一般具有濃度依賴性，隨著NaHS（H2S 供體）濃度的不斷增加，黃瓜根系長度和數(shù)目均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[6]，番茄的側(cè)根長度和密度也具有相同趨勢[7]，并且H2S對番茄側(cè)根生長的調(diào)節(jié)作用與過氧化氫和甲烷信號途徑有關(guān)[8?9]。
組蛋白乙?；揎棻徽J(rèn)為是基因表達(dá)調(diào)節(jié)中重要且普遍存在的表觀遺傳標(biāo)記[10]。組蛋白乙?；梢韵魅踅M蛋白與DNA 之間的相互作用，改變核小體的表面結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)伸展，有助于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的形成。因此，一般來說，組蛋白乙酰化可誘導(dǎo)基因激活，相反，組蛋白去乙?；ǔ?dǎo)致染色質(zhì)濃縮并抑制基因轉(zhuǎn)錄[11]。組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases，HDACs）是一個(gè)家族，其功能是將組蛋白去乙?；?，與組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶（Histone acetyltransferases，HATs）共同維持組蛋白乙?；揎椀姆€(wěn)態(tài)。近年來研究顯示，HDACs基因也介導(dǎo)根系生長發(fā)育過程。通過丁酸鈉和曲古抑菌素處理抑制HDACs活性，可抑制擬南芥的主根生長[12]，在擬南芥中過表達(dá)白楊組蛋白去乙?；富騊tHDT902可促進(jìn)主根伸長[13]。
H2S 和HDACs 基因?qū)χ参锔稻姓{(diào)節(jié)作用，二者在調(diào)節(jié)根系生長過程中的作用關(guān)系尚不明確，因此，采用不同濃度NaHS 處理后，測定小麥和擬南芥根系中HDACs 活性及其基因表達(dá)情況，以探討H2S 對植物根系生長的調(diào)節(jié)與組蛋白去乙?；傅南嗷プ饔藐P(guān)系，豐富對植物根系生長調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識。
1 材料和方法
1.1 材料培養(yǎng)及處理
擬南芥種子表面消毒滅菌后，播種到1/2MS 培養(yǎng)基上，4 ℃放置3 d 后，在22 ℃/20 ℃（光照16 h/黑暗8 h）條件下生長，4 d后將其轉(zhuǎn)移到含0（CK）、50、100、150、200 μmol/L NaHS 的1/2MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，6 d后測其根長，-80 ℃保存，用于測定HDACs活性及基因表達(dá)。
將小麥（鄭麥366，ZM366）種子用5%H2O2消毒3 min，清水沖洗5 次，蒸餾水浸泡4～6 h 后，把種子放在濕潤的濾紙上催芽，3 d 后將其移至含0（CK）、50、100、200、400 μmol/L NaHS 的1/4Hoagland 營養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃/20 ℃（光照14 h/黑暗10 h），相對濕度70%。3 d更換1次營養(yǎng)液，6 d后測量根系長度，并取根系樣品于-80 ℃保存，用于測定HDACs活性及基因表達(dá)。
1.2 測定項(xiàng)目及方法
1.2.1 根長 在根系旁放置標(biāo)尺并拍照，將圖片置入Photoshop 7.0，使用標(biāo)尺工具進(jìn)行根長測定，每個(gè)處理測量5～10株。
1.2.2 HDACs 活性 分別取0.1 g 擬南芥和小麥樣品，用液氮研磨后，加1 mL 提取液[50 mmol/L Tris-HCl，pH 值為7.5，150 mmol/L NaCl、2%十二烷基鈉硫酸（Sodium dodecyl sulfate，SDS）和蛋白酶抑制劑]，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清待用。按照植物組蛋白去乙酰化酶ELISA 試劑盒（Mlbio，中國上海）操作說明測定HDACs活性。
1.2.3 HDACs 基因表達(dá) 擬南芥和小麥根系總RNA 用Trizol 試劑提取，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。參照LI 等[14]的方法采用qRT-PCR 分析擬南芥和小麥根系的HDACs基因表達(dá)情況，使用引物具體見表1，擬南芥和小麥分別以AtACT-2和TaACT-1作為內(nèi)參基因。
表1 qRT-PCR分析使用引物Tab.1 The primers used for qRT-PCR analysis
1.3 數(shù)據(jù)處理與分析
所有定量結(jié)果均為至少3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SD）。使用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 H2S對擬南芥和小麥根系生長的影響
用不同濃度NaHS 處理擬南芥和小麥發(fā)現(xiàn)，H2S可顯著調(diào)節(jié)擬南芥和小麥根系生長（圖1—2）。與CK（0 μmol/L NaHS）相比，50～200 μmol/L NaHS 可使擬南芥主根伸長減少16.0%～51.1%（圖1），50～400 μmol/L NaHS 可使小麥主根伸長減少10.0%～20.1%（圖2A）。除對主根產(chǎn)生影響外，H2S 還可調(diào)節(jié)小麥側(cè)根的生長，50～200 μmol/L NaHS 可促進(jìn)小麥側(cè)根生長，側(cè)根長度比CK 增加7.2%～13.5%，但高濃度NaHS（400 μmol/L）抑制了側(cè)根生長（圖2B）。
圖1 H2S對擬南芥主根生長的影響Fig.1 Effect of H2S on the primary root growth of Arabidopsis
圖2 H2S對小麥主根（A）和側(cè)根（B）生長的影響Fig.2 Effects of H2S on the primary and lateral root growth of wheat
2.2 H2S對擬南芥和小麥根系HDACs活性的影響
不同濃度NaHS 處理后，對擬南芥和小麥根系HDACs 活性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管擬南芥還是小麥中，NaHS處理均誘導(dǎo)了HDACs活性，但具有濃度依賴性（圖3）。擬南芥中較低濃度NaHS（50～100 μmol/L）對HDACs 活性無顯著影響，但較高濃度NaHS（150～200 μmol/L）可 使HDACs 活 性 提 高48.0%～50.0%（圖3A）；50～400 μmol/L NaHS 處理均能顯著誘導(dǎo)小麥HDACs 活性，100 μmol/L 濃度下達(dá)到最大，HDACs活性較CK提高76.6%（圖3B）。
圖3 H2S對擬南芥（A）和小麥（B）根系HDACs活性的影響Fig.3 Effect of H2S on the HDACs activity in Arabidopsis（A）and wheat（B）
2.3 H2S對擬南芥和小麥HDACs基因表達(dá)的影響
HDACs 是由多個(gè)基因組成的基因家族，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有18 個(gè)HDACs 基因[15]，前期通過全基因組分析已從小麥中鑒定出53 個(gè)HDACs 基因[16]，現(xiàn)進(jìn)一步分析不同濃度NaHS 處理下擬南芥和小麥HDACs基因的表達(dá)模式。
由于AtHDA10、AtHDA17基因與AtHDA9的N 端相似度可達(dá)97%[15]，通過RT-PCR 不能從轉(zhuǎn)錄水平區(qū)分AtHDA10和AtHDA17各自的表達(dá)情況，因此，只探討其他16個(gè)AtHDACs基因在NaHS處理下的表達(dá)變化。結(jié)果（圖4）顯示，有4個(gè)AtHDACs基因不受NaHS 影響，這4 個(gè)基因（AtHDT1、AtHDT2、AtHDT3、AtHDT4）均屬于HD2 亞家族，其余12 個(gè)AtHDACs均響應(yīng)NaHS 處理，但表達(dá)模式不同，且具有濃度依賴性。如AtHDA2、AtHDA7、AtHDA8和AtHDA14表達(dá)水平在50 μmol/L NaHS 處理下均顯著下調(diào)，AtHDA5、AtHDA6、AtHDA19和AtSRT1表達(dá)水平僅在150 μmol/L NaHS 處 理 下 顯 著 上 調(diào)，AtHDA15、AtHDA18和AtSRT2在較高濃度NaHS 處理下可被持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)，而AtHDA8和AtHDA14的表達(dá)在低濃度NaHS處理下被抑制，而較高濃度下被誘導(dǎo)。
圖4 H2S對擬南芥HDACs基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of H2S on HDACs gene expression in Arabidopsis
由于六倍體小麥的A、B 和D 基因組在mRNA水平上極為相似，因此將TaHDACs-A、TaHDACs-B和TaHDACs-D 視為一個(gè)組合基因，分析了19 個(gè)TaHDACs在不同濃度NaHS 處理下的表達(dá)水平（圖5）。19 個(gè)TaHDACs基因中有2 個(gè)基因（TaHDA5和TaSRT1）不受NaHS 影響，其余17 個(gè)TaHDACs對NaHS 的響應(yīng)模式各有不同。與CK 相比，TaHDA9和TaHDA19在100 μmol/L NaHS 處理下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，TaHDA20在200 μmol/L NaHS 處理下上調(diào)表達(dá)，TaHDA21和TaHDA22的表達(dá)量在50、100、400 μmol/L NaHS 處 理 下 均 顯 著 上 升，TaHDA2、TaHDA6、TaHDA8、TaHDA18、TaSRT2、TaHDT1和TaHDT2均在100、200 μmol/L NaHS 處理下顯著下調(diào)表達(dá)，TaHDA14和TaHDT3的表達(dá)量在50～400 μmol/L NaHS處理下均顯著下降。
圖5 H2S對小麥HDACs基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of H2S on HDACs gene expression in wheat
3 結(jié)論與討論
在擬南芥[17]、黃瓜[18]、番茄[19]等雙子葉植物中的研究均顯示，H2S 可調(diào)節(jié)植物根系生長，但在單子葉植物中H2S對根系的調(diào)控作用及機(jī)制是否與雙子葉植物一致尚不清楚。本研究比較了H2S對擬南芥和小麥根系生長的調(diào)節(jié)作用。與擬南芥中的結(jié)果一致，NaHS 可顯著抑制小麥主根生長，但隨NaHS 濃度增加，小麥側(cè)根長度表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，說明H2S 對單子葉植物和雙子葉植物根系生長的調(diào)節(jié)作用相似，H2S 對其主根和側(cè)根均有調(diào)節(jié)作用，且具有濃度依賴性。
在擬南芥中已有研究顯示，H2S 抑制主根生長的作用依賴于ROS-MPK6-NO 信號途徑[20]，即外源H2S 誘導(dǎo)了ROS 的產(chǎn)生，而后ROS 激活絲裂原活化蛋白激酶MPK6，MPK6 通過MAPK 途徑促使NO 產(chǎn)生，NO 再抑制生長素的分布及降低根尖分生細(xì)胞的分裂潛能，最終表現(xiàn)出H2S 對主根生長的抑制作用。在番茄中，H2S 對側(cè)根生長的調(diào)節(jié)由H2O2信號介導(dǎo)，H2S 可通過誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生促使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因（如SlCYCA2；1、SlCYCA3；；1、SlCDKA1）及側(cè)根形成相關(guān)microRNAs（miR390a和miR160）的表達(dá)，最終促進(jìn)側(cè)根生長[21]。近來，組蛋白去乙酰化酶對根系的調(diào)節(jié)也有研究報(bào)道，如水稻組蛋白去乙酰化酶基因OsHDAC1過表達(dá)可促進(jìn)根系生長[22]；組蛋白去乙?；敢种苿℉DIs）通過促進(jìn)PIN1 蛋白降解抑制擬南芥主根伸長[23]；HDA19突變降低了低磷對根毛數(shù)量及長度的誘導(dǎo)[24]；擬南芥HDT1/2雙突變體的主根長度顯著短于野生型[25]。H2S 調(diào)節(jié)植物根系生長，組蛋白去乙酰化酶也介導(dǎo)根系生長，那么H2S與組蛋白去乙?；冈谡{(diào)節(jié)根系生長作用中是否有相關(guān)性，這個(gè)問題在植物中尚未有探討。但在動(dòng)物體中已發(fā)現(xiàn)H2S 可調(diào)節(jié)組蛋白去乙酰化酶，如H2S 可誘導(dǎo)大鼠細(xì)胞中組蛋白去乙?；富騍IRT1表達(dá)來緩解甲醛誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[26]；H2S 以組蛋白去乙?；窼IRT3依賴的方式改善小鼠心肌肥大細(xì)胞線粒體功能[27]；H2S 也可通過誘導(dǎo)HDACs活性，抑制炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達(dá)，最終保持骨骼穩(wěn)態(tài)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，不管在擬南芥還是小麥中，H2S 均可誘導(dǎo)組蛋白去乙?；富钚员磉_(dá)，并且對HDACs家族基因表達(dá)也有不同的調(diào)控模式，由此說明，H2S 對植物根系的調(diào)控與組蛋白去乙?；赶⑾⑾嚓P(guān)。
與CK 相比，H2S 處理下，擬南芥和小麥根系HDACs 基因都有不同程度的表達(dá)差異。部分HDACs基因在擬南芥和小麥中的表達(dá)趨勢不一致，如HDA6、HDA15和HDA18在擬南芥中被H2S 上調(diào)表達(dá)，而在小麥中則被H2S下調(diào)表達(dá)，HDT1—4在擬南芥中不響應(yīng)H2S，而在小麥中則被H2S 抑制表達(dá)，這可能是因?yàn)檫@些基因在雙子葉植物和單子葉植物根系存在不同的響應(yīng)機(jī)制。值得關(guān)注的是，同源基因AtHDA2和TaHDA2的表達(dá)分別在50 μmol/L NaHS 和100 μmol/L NaHS 下被顯著抑制，而同源基因AtHDA19和TaHDA19分別在150 μmol/L NaHS 和100 μmol/L NaHS 下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，整體而言，隨H2S濃度增加，擬南芥和小麥根系HDA2的相對表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，HDA19的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。根據(jù)前人研究[22?25]報(bào)道，增加組蛋白的去乙?；纱龠M(jìn)根系生長，相反，降低組蛋白的去乙酰化可抑制根系生長。在小麥和擬南芥中均發(fā)現(xiàn)H2S 可抑制HDA2的表達(dá)，說明H2S對植物根系的調(diào)節(jié)可能與HDA2基因有關(guān)。而H2S對HDA9和HDA19基因的誘導(dǎo)作用可能與逆境脅迫調(diào)節(jié)有關(guān)，因?yàn)樵趧?dòng)物應(yīng)激反應(yīng)中，H2S 誘導(dǎo)組蛋白去乙?；副磉_(dá)[26?28]。
總的來說，H2S 對HDACs 具有顯著的調(diào)節(jié)作用，但H2S 可能通過不同HDACs 基因介導(dǎo)不同的生長過程或逆境脅迫。通過本研究發(fā)現(xiàn)，HDA2可能參與H2S 信號調(diào)節(jié)根系生長，HDA9和HDA19可能參與H2S 信號介導(dǎo)植物逆境脅迫，但H2S 對這些HDACs 的調(diào)節(jié)機(jī)制及介導(dǎo)HDACs 調(diào)節(jié)根系生長的下游基因都需進(jìn)一步研究和鑒定。
猜你喜歡
擬南芥：活得粗糙，才讓我有了上太空的資格中學(xué)生天地(A版)(2023年1期)2023-02-17 00:33:04 抑癌蛋白p53乙?；揎椀恼{(diào)控網(wǎng)絡(luò)中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)(2022年8期)2022-09-08 00:39:50 黃芪幼苗根系生長發(fā)育與GR24和IAA的關(guān)系廣西植物(2022年5期)2022-06-18 08:50:41 基于機(jī)器視覺的三七主根形狀分類方法研究文山學(xué)院學(xué)報(bào)(2022年2期)2022-05-27 05:45:34 植物的“嘴巴”課外生活·趣知識(2022年5期)2022-05-14 16:26:29 尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響生命科學(xué)研究(2018年1期)2018-05-29 01:12:47 兩種LED光源作為擬南芥生長光源的應(yīng)用探究上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)(2017年3期)2017-04-10 12:39:14 擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制探究山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)(2016年6期)2016-12-01 05:38:19 灰樹花菌渣用于板栗專用生物有機(jī)肥的研究初報(bào)河北果樹(2016年2期)2016-08-12 07:03:37 慢性支氣管哮喘小鼠肺組織中組蛋白H3乙酰化修飾增強(qiáng)中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志(2016年4期)2016-02-27 11:15:53
裴鋅鋅，陳虹宇，李 曉，劉華杰，李 華
（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002）
硫化氫（H2S）是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后被發(fā)現(xiàn)的第3 種氣體信號分子，高濃度的H2S 可抑制線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶的活性，是細(xì)胞代謝的毒性物質(zhì)，低濃度H2S 對細(xì)胞生理功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[1?2]。YANG 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，H2S 在動(dòng)物體內(nèi)可以內(nèi)源產(chǎn)生，并且可通過血管平滑肌細(xì)胞上的三磷酸腺苷敏感性鉀通道（Adenosine triphosphate?sensitive potassium，KATP）調(diào)節(jié)血壓。在植物中，H2S 可調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)、種子萌發(fā)、根系發(fā)育、衰老、果實(shí)后熟等[3]諸多種生理過程，還能響應(yīng)各種生物和非生物（干旱、鹽、重金屬、高溫等）脅迫[4?5]。在植物根系中，H2S 對植物根系的調(diào)節(jié)一般具有濃度依賴性，隨著NaHS（H2S 供體）濃度的不斷增加，黃瓜根系長度和數(shù)目均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[6]，番茄的側(cè)根長度和密度也具有相同趨勢[7]，并且H2S對番茄側(cè)根生長的調(diào)節(jié)作用與過氧化氫和甲烷信號途徑有關(guān)[8?9]。
組蛋白乙?；揎棻徽J(rèn)為是基因表達(dá)調(diào)節(jié)中重要且普遍存在的表觀遺傳標(biāo)記[10]。組蛋白乙?；梢韵魅踅M蛋白與DNA 之間的相互作用，改變核小體的表面結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)伸展，有助于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的形成。因此，一般來說，組蛋白乙酰化可誘導(dǎo)基因激活，相反，組蛋白去乙?；ǔ?dǎo)致染色質(zhì)濃縮并抑制基因轉(zhuǎn)錄[11]。組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases，HDACs）是一個(gè)家族，其功能是將組蛋白去乙?；?，與組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶（Histone acetyltransferases，HATs）共同維持組蛋白乙?；揎椀姆€(wěn)態(tài)。近年來研究顯示，HDACs基因也介導(dǎo)根系生長發(fā)育過程。通過丁酸鈉和曲古抑菌素處理抑制HDACs活性，可抑制擬南芥的主根生長[12]，在擬南芥中過表達(dá)白楊組蛋白去乙?；富騊tHDT902可促進(jìn)主根伸長[13]。
H2S 和HDACs 基因?qū)χ参锔稻姓{(diào)節(jié)作用，二者在調(diào)節(jié)根系生長過程中的作用關(guān)系尚不明確，因此，采用不同濃度NaHS 處理后，測定小麥和擬南芥根系中HDACs 活性及其基因表達(dá)情況，以探討H2S 對植物根系生長的調(diào)節(jié)與組蛋白去乙?；傅南嗷プ饔藐P(guān)系，豐富對植物根系生長調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識。
1 材料和方法
1.1 材料培養(yǎng)及處理
擬南芥種子表面消毒滅菌后，播種到1/2MS 培養(yǎng)基上，4 ℃放置3 d 后，在22 ℃/20 ℃（光照16 h/黑暗8 h）條件下生長，4 d后將其轉(zhuǎn)移到含0（CK）、50、100、150、200 μmol/L NaHS 的1/2MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，6 d后測其根長，-80 ℃保存，用于測定HDACs活性及基因表達(dá)。
將小麥（鄭麥366，ZM366）種子用5%H2O2消毒3 min，清水沖洗5 次，蒸餾水浸泡4～6 h 后，把種子放在濕潤的濾紙上催芽，3 d 后將其移至含0（CK）、50、100、200、400 μmol/L NaHS 的1/4Hoagland 營養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25 ℃/20 ℃（光照14 h/黑暗10 h），相對濕度70%。3 d更換1次營養(yǎng)液，6 d后測量根系長度，并取根系樣品于-80 ℃保存，用于測定HDACs活性及基因表達(dá)。
1.2 測定項(xiàng)目及方法
1.2.1 根長 在根系旁放置標(biāo)尺并拍照，將圖片置入Photoshop 7.0，使用標(biāo)尺工具進(jìn)行根長測定，每個(gè)處理測量5～10株。
1.2.2 HDACs 活性 分別取0.1 g 擬南芥和小麥樣品，用液氮研磨后，加1 mL 提取液[50 mmol/L Tris-HCl，pH 值為7.5，150 mmol/L NaCl、2%十二烷基鈉硫酸（Sodium dodecyl sulfate，SDS）和蛋白酶抑制劑]，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清待用。按照植物組蛋白去乙酰化酶ELISA 試劑盒（Mlbio，中國上海）操作說明測定HDACs活性。
1.2.3 HDACs 基因表達(dá) 擬南芥和小麥根系總RNA 用Trizol 試劑提取，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。參照LI 等[14]的方法采用qRT-PCR 分析擬南芥和小麥根系的HDACs基因表達(dá)情況，使用引物具體見表1，擬南芥和小麥分別以AtACT-2和TaACT-1作為內(nèi)參基因。
表1 qRT-PCR分析使用引物Tab.1 The primers used for qRT-PCR analysis
1.3 數(shù)據(jù)處理與分析
所有定量結(jié)果均為至少3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SD）。使用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 H2S對擬南芥和小麥根系生長的影響
用不同濃度NaHS 處理擬南芥和小麥發(fā)現(xiàn)，H2S可顯著調(diào)節(jié)擬南芥和小麥根系生長（圖1—2）。與CK（0 μmol/L NaHS）相比，50～200 μmol/L NaHS 可使擬南芥主根伸長減少16.0%～51.1%（圖1），50～400 μmol/L NaHS 可使小麥主根伸長減少10.0%～20.1%（圖2A）。除對主根產(chǎn)生影響外，H2S 還可調(diào)節(jié)小麥側(cè)根的生長，50～200 μmol/L NaHS 可促進(jìn)小麥側(cè)根生長，側(cè)根長度比CK 增加7.2%～13.5%，但高濃度NaHS（400 μmol/L）抑制了側(cè)根生長（圖2B）。
圖1 H2S對擬南芥主根生長的影響Fig.1 Effect of H2S on the primary root growth of Arabidopsis
圖2 H2S對小麥主根（A）和側(cè)根（B）生長的影響Fig.2 Effects of H2S on the primary and lateral root growth of wheat
2.2 H2S對擬南芥和小麥根系HDACs活性的影響
不同濃度NaHS 處理后，對擬南芥和小麥根系HDACs 活性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管擬南芥還是小麥中，NaHS處理均誘導(dǎo)了HDACs活性，但具有濃度依賴性（圖3）。擬南芥中較低濃度NaHS（50～100 μmol/L）對HDACs 活性無顯著影響，但較高濃度NaHS（150～200 μmol/L）可 使HDACs 活 性 提 高48.0%～50.0%（圖3A）；50～400 μmol/L NaHS 處理均能顯著誘導(dǎo)小麥HDACs 活性，100 μmol/L 濃度下達(dá)到最大，HDACs活性較CK提高76.6%（圖3B）。
圖3 H2S對擬南芥（A）和小麥（B）根系HDACs活性的影響Fig.3 Effect of H2S on the HDACs activity in Arabidopsis（A）and wheat（B）
2.3 H2S對擬南芥和小麥HDACs基因表達(dá)的影響
HDACs 是由多個(gè)基因組成的基因家族，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有18 個(gè)HDACs 基因[15]，前期通過全基因組分析已從小麥中鑒定出53 個(gè)HDACs 基因[16]，現(xiàn)進(jìn)一步分析不同濃度NaHS 處理下擬南芥和小麥HDACs基因的表達(dá)模式。
由于AtHDA10、AtHDA17基因與AtHDA9的N 端相似度可達(dá)97%[15]，通過RT-PCR 不能從轉(zhuǎn)錄水平區(qū)分AtHDA10和AtHDA17各自的表達(dá)情況，因此，只探討其他16個(gè)AtHDACs基因在NaHS處理下的表達(dá)變化。結(jié)果（圖4）顯示，有4個(gè)AtHDACs基因不受NaHS 影響，這4 個(gè)基因（AtHDT1、AtHDT2、AtHDT3、AtHDT4）均屬于HD2 亞家族，其余12 個(gè)AtHDACs均響應(yīng)NaHS 處理，但表達(dá)模式不同，且具有濃度依賴性。如AtHDA2、AtHDA7、AtHDA8和AtHDA14表達(dá)水平在50 μmol/L NaHS 處理下均顯著下調(diào)，AtHDA5、AtHDA6、AtHDA19和AtSRT1表達(dá)水平僅在150 μmol/L NaHS 處 理 下 顯 著 上 調(diào)，AtHDA15、AtHDA18和AtSRT2在較高濃度NaHS 處理下可被持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)，而AtHDA8和AtHDA14的表達(dá)在低濃度NaHS處理下被抑制，而較高濃度下被誘導(dǎo)。
圖4 H2S對擬南芥HDACs基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of H2S on HDACs gene expression in Arabidopsis
由于六倍體小麥的A、B 和D 基因組在mRNA水平上極為相似，因此將TaHDACs-A、TaHDACs-B和TaHDACs-D 視為一個(gè)組合基因，分析了19 個(gè)TaHDACs在不同濃度NaHS 處理下的表達(dá)水平（圖5）。19 個(gè)TaHDACs基因中有2 個(gè)基因（TaHDA5和TaSRT1）不受NaHS 影響，其余17 個(gè)TaHDACs對NaHS 的響應(yīng)模式各有不同。與CK 相比，TaHDA9和TaHDA19在100 μmol/L NaHS 處理下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，TaHDA20在200 μmol/L NaHS 處理下上調(diào)表達(dá)，TaHDA21和TaHDA22的表達(dá)量在50、100、400 μmol/L NaHS 處 理 下 均 顯 著 上 升，TaHDA2、TaHDA6、TaHDA8、TaHDA18、TaSRT2、TaHDT1和TaHDT2均在100、200 μmol/L NaHS 處理下顯著下調(diào)表達(dá)，TaHDA14和TaHDT3的表達(dá)量在50～400 μmol/L NaHS處理下均顯著下降。
圖5 H2S對小麥HDACs基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of H2S on HDACs gene expression in wheat
3 結(jié)論與討論
在擬南芥[17]、黃瓜[18]、番茄[19]等雙子葉植物中的研究均顯示，H2S 可調(diào)節(jié)植物根系生長，但在單子葉植物中H2S對根系的調(diào)控作用及機(jī)制是否與雙子葉植物一致尚不清楚。本研究比較了H2S對擬南芥和小麥根系生長的調(diào)節(jié)作用。與擬南芥中的結(jié)果一致，NaHS 可顯著抑制小麥主根生長，但隨NaHS 濃度增加，小麥側(cè)根長度表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，說明H2S 對單子葉植物和雙子葉植物根系生長的調(diào)節(jié)作用相似，H2S 對其主根和側(cè)根均有調(diào)節(jié)作用，且具有濃度依賴性。
在擬南芥中已有研究顯示，H2S 抑制主根生長的作用依賴于ROS-MPK6-NO 信號途徑[20]，即外源H2S 誘導(dǎo)了ROS 的產(chǎn)生，而后ROS 激活絲裂原活化蛋白激酶MPK6，MPK6 通過MAPK 途徑促使NO 產(chǎn)生，NO 再抑制生長素的分布及降低根尖分生細(xì)胞的分裂潛能，最終表現(xiàn)出H2S 對主根生長的抑制作用。在番茄中，H2S 對側(cè)根生長的調(diào)節(jié)由H2O2信號介導(dǎo)，H2S 可通過誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生促使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因（如SlCYCA2；1、SlCYCA3；；1、SlCDKA1）及側(cè)根形成相關(guān)microRNAs（miR390a和miR160）的表達(dá)，最終促進(jìn)側(cè)根生長[21]。近來，組蛋白去乙酰化酶對根系的調(diào)節(jié)也有研究報(bào)道，如水稻組蛋白去乙酰化酶基因OsHDAC1過表達(dá)可促進(jìn)根系生長[22]；組蛋白去乙?；敢种苿℉DIs）通過促進(jìn)PIN1 蛋白降解抑制擬南芥主根伸長[23]；HDA19突變降低了低磷對根毛數(shù)量及長度的誘導(dǎo)[24]；擬南芥HDT1/2雙突變體的主根長度顯著短于野生型[25]。H2S 調(diào)節(jié)植物根系生長，組蛋白去乙酰化酶也介導(dǎo)根系生長，那么H2S與組蛋白去乙?；冈谡{(diào)節(jié)根系生長作用中是否有相關(guān)性，這個(gè)問題在植物中尚未有探討。但在動(dòng)物體中已發(fā)現(xiàn)H2S 可調(diào)節(jié)組蛋白去乙酰化酶，如H2S 可誘導(dǎo)大鼠細(xì)胞中組蛋白去乙?；富騍IRT1表達(dá)來緩解甲醛誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[26]；H2S 以組蛋白去乙?；窼IRT3依賴的方式改善小鼠心肌肥大細(xì)胞線粒體功能[27]；H2S 也可通過誘導(dǎo)HDACs活性，抑制炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達(dá)，最終保持骨骼穩(wěn)態(tài)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，不管在擬南芥還是小麥中，H2S 均可誘導(dǎo)組蛋白去乙?；富钚员磉_(dá)，并且對HDACs家族基因表達(dá)也有不同的調(diào)控模式，由此說明，H2S 對植物根系的調(diào)控與組蛋白去乙?；赶⑾⑾嚓P(guān)。
與CK 相比，H2S 處理下，擬南芥和小麥根系HDACs 基因都有不同程度的表達(dá)差異。部分HDACs基因在擬南芥和小麥中的表達(dá)趨勢不一致，如HDA6、HDA15和HDA18在擬南芥中被H2S 上調(diào)表達(dá)，而在小麥中則被H2S下調(diào)表達(dá)，HDT1—4在擬南芥中不響應(yīng)H2S，而在小麥中則被H2S 抑制表達(dá)，這可能是因?yàn)檫@些基因在雙子葉植物和單子葉植物根系存在不同的響應(yīng)機(jī)制。值得關(guān)注的是，同源基因AtHDA2和TaHDA2的表達(dá)分別在50 μmol/L NaHS 和100 μmol/L NaHS 下被顯著抑制，而同源基因AtHDA19和TaHDA19分別在150 μmol/L NaHS 和100 μmol/L NaHS 下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，整體而言，隨H2S濃度增加，擬南芥和小麥根系HDA2的相對表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，HDA19的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。根據(jù)前人研究[22?25]報(bào)道，增加組蛋白的去乙?；纱龠M(jìn)根系生長，相反，降低組蛋白的去乙酰化可抑制根系生長。在小麥和擬南芥中均發(fā)現(xiàn)H2S 可抑制HDA2的表達(dá)，說明H2S對植物根系的調(diào)節(jié)可能與HDA2基因有關(guān)。而H2S對HDA9和HDA19基因的誘導(dǎo)作用可能與逆境脅迫調(diào)節(jié)有關(guān)，因?yàn)樵趧?dòng)物應(yīng)激反應(yīng)中，H2S 誘導(dǎo)組蛋白去乙?；副磉_(dá)[26?28]。
總的來說，H2S 對HDACs 具有顯著的調(diào)節(jié)作用，但H2S 可能通過不同HDACs 基因介導(dǎo)不同的生長過程或逆境脅迫。通過本研究發(fā)現(xiàn)，HDA2可能參與H2S 信號調(diào)節(jié)根系生長，HDA9和HDA19可能參與H2S 信號介導(dǎo)植物逆境脅迫，但H2S 對這些HDACs 的調(diào)節(jié)機(jī)制及介導(dǎo)HDACs 調(diào)節(jié)根系生長的下游基因都需進(jìn)一步研究和鑒定。
猜你喜歡
中學(xué)生天地(A版)(2023年1期)2023-02-17 00:33:04
中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)(2022年8期)2022-09-08 00:39:50
廣西植物(2022年5期)2022-06-18 08:50:41
文山學(xué)院學(xué)報(bào)(2022年2期)2022-05-27 05:45:34
課外生活·趣知識(2022年5期)2022-05-14 16:26:29
生命科學(xué)研究(2018年1期)2018-05-29 01:12:47
上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)(2017年3期)2017-04-10 12:39:14
山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)(2016年6期)2016-12-01 05:38:19
河北果樹(2016年2期)2016-08-12 07:03:37
中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志(2016年4期)2016-02-27 11:15:53
