亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        海洋細菌來源β-瓊膠酶的生物信息學(xué)分析與高效制備

        2022-04-22 02:10:24尤鈺嫻解文嫣班宵逢孔昊存李才明李兆豐
        南方水產(chǎn)科學(xué) 2022年2期
        關(guān)鍵詞:氮源碳源水解

        尤鈺嫻,解文嫣,班宵逢,孔昊存,李才明,李兆豐,

        1. 江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122

        2. 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫 214122

        瓊膠是由海洋藻類生物合成的一種天然高分子多糖[1-2]。瓊膠經(jīng)過水解后生成聚合度為2~20的瓊膠寡糖,不僅溶解性好、生物利用度高,還具有改善水產(chǎn)品儲藏性能[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗炎癥[6]、降血糖[7-8]、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)[9-10]以及美白保濕[11]等多項理化和生理功能,在功能性食品、化妝品、藥品等多個領(lǐng)域均具有很高的經(jīng)濟價值和廣泛的應(yīng)用前景[12]。

        近年我國對瓊膠的開發(fā)存在規(guī)模較小、附加值低、易污染環(huán)境等不足,開發(fā)功能性瓊膠寡糖等高附加值的瓊脂衍生物對高效利用海洋資源、增加經(jīng)濟效益、減輕化學(xué)污染等意義重大。目前工業(yè)上主要利用酸水解[13]和酶解[14]兩種方式制備瓊膠寡糖,其中利用瓊膠酶生物催化水解具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、底物特異性強等優(yōu)勢[15]。瓊膠酶根據(jù)水解模式和產(chǎn)物的不同可分為α-瓊膠酶 (EC 3.2.1.158) 和 β-瓊膠酶 (EC 3.2.1.81)[16]。α-瓊膠酶可特異性水解α-1,3-糖苷鍵,生成以3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖,β-瓊膠酶可特異性水解β-1,4-糖苷鍵,生成以β-D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖。β-瓊膠酶因來源豐富、穩(wěn)定性好得以廣泛應(yīng)用,但仍存在菌株產(chǎn)酶性狀不穩(wěn)定、產(chǎn)酶量和催化活性低、產(chǎn)物專一性差等問題,難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。因此,尋找水解活力更高、性狀穩(wěn)定的瓊膠酶基因,并在基因工程菌中實現(xiàn)異源表達,成為生產(chǎn)瓊膠酶最經(jīng)濟、高效的方法。

        目前,已有部分細菌來源的瓊膠酶實現(xiàn)了在大腸桿菌 (Escherichia coli)[17-18]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[19]、短芽孢桿菌 (B. pumilus)[20]、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)[21]和畢赤酵母 (Pichia pastoris)[22]中的表達,其中大腸桿菌因具有生長與表達速度快、易于基因組修飾、表達量高等優(yōu)勢得到最廣泛的應(yīng)用?,F(xiàn)有β-瓊膠酶在大腸桿菌中的表達量大多高于原始菌株,但絕大多數(shù)是胞內(nèi)分泌表達,不利于后續(xù)的分離、純化和應(yīng)用,且表達系統(tǒng)的選擇多具有隨機性,尚未見有結(jié)合生物信息學(xué)分析等手段指導(dǎo)進行異源表達的報道。本研究利用生物數(shù)據(jù)庫資源挖掘技術(shù)和生物信息學(xué)分析手段,獲得一個來源于海洋細菌——淡黃色噬瓊膠菌(Agarivorans gilvus) WH0801的 β-瓊膠酶 (β-AGA酶) 基因。通過分子生物學(xué)手段和發(fā)酵調(diào)控策略實現(xiàn)了其在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效胞外表達,以期為新瓊寡糖資源的高效制備與充分利用提供新途徑。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        大腸桿菌JM109、大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-20b(+) 保藏于本實驗室;pUCm-T simple質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶 NcoⅠ和 XhoⅠ、Primer STAR GXL DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、堿性磷酸酶均購自TaKaRa (大連)公司;瓊脂糖、質(zhì)粒小量提取試劑盒、氨芐青霉素等試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;分子級酵母粉和胰蛋白胨均購自O(shè)xoid (英國)公司;大豆蛋白胨、酵母提取物 H07014、酵母提取物 H07002均購自上海統(tǒng)園食品技術(shù)有限公司;蛋白胨(魚粉)、牛肉浸膏、酵母浸膏及其他常規(guī)培養(yǎng)基均購自國藥集團;所用化學(xué)試劑均為分析純[23]。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 β-瓊膠酶的生物信息學(xué)分析

        分別以來源于嗜瓊膠菌Agarivorans sp. QM38(NCBI登錄號:ABM90422.1)[24]、弧菌Vibrio sp.PO-303 (NCBI登錄號:BAG71428.1)[25]和火色桿菌Flammeovirga sp. OC4 (NCBI登錄號:AJW82061.1)[26]的β-瓊膠酶氨基酸序列為探針,利用美國國家生物信息中心(NCBI) 的BLASTp功能 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/),設(shè)置E值為1.0×10-10,長度覆蓋率90%以上且同一性大于30%,進行同源性蛋白分子篩選[27],利用MEGA軟件中的鄰接 (Neighbor-Joining) 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹[28]。

        利用在線生物信息學(xué)預(yù)測工具分別對β-瓊膠酶的基本理化性質(zhì)、分泌特性、結(jié)構(gòu)特征、功能潛力等進行預(yù)測分析[29],利用RobeTTAFold在線服務(wù)器 (https://robetta.bakerlab.org/) 進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測。

        1.2.2 β-AGA 酶基因的克隆

        以淡黃色噬瓊膠菌WH0801基因組DNA為模板,根據(jù)其中的β-AGA酶序列分別設(shè)計含Nco I和Xho I酶切位點的兩端引物,通過PCR擴增得到β-aga基因片段[23]。引物設(shè)計如下,正向 (P1):5'GCGATGGCCATGGCCACATTTACTAAAAGCAA AATCGCAACCGTTCTT 3' (下劃線為Nco I酶切位點));反向 (P2):5'GGTGGTGCTCGAGTTTTT TGTAACGCAGATTATATAGATCACGGTTGAA 3'(下劃線為Xho I酶切位點)。

        引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系及擴增條件參照李兆豐[30]進行。將得到的β-aga基因克隆到質(zhì)粒pUCm-T simple,獲得克隆載體pUCm-T simple/β-aga,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。提取含100 μg·mL-1氨芐青霉素平板篩選所得陽性菌株的質(zhì)粒進行酶切電泳和測序驗證,序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

        1.2.3 表達載體 pET-20b(+)/β-aga的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

        采用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I對克隆載體pUCm-T simple/β-aga雙酶切,經(jīng)堿性磷酸酶消化后回收目的片段,再用T4 DNA連接酶與經(jīng)同樣雙酶切處理的pET-20b(+)質(zhì)粒片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,提取質(zhì)粒并測序鑒定,獲得含正確序列的表達載體pET-20b(+)/β-aga,將其轉(zhuǎn)化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3),獲得基因工程菌E. coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/β-aga)。

        1.2.4 重組 β-AGA 酶的生產(chǎn)

        種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)參照李兆豐[30]的方法進行,發(fā)酵結(jié)束后收集上清液即為重組β-AGA酶粗酶液。

        1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

        以體積分數(shù)為4%的接種量將種子培養(yǎng)液接至50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在不同的發(fā)酵初始培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑添加量及添加時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵pH、碳源和氮源條件下進行發(fā)酵,測定發(fā)酵上清液中重組β-AGA酶活力,以確定最佳的發(fā)酵條件,每次優(yōu)化的結(jié)果用于之后的實驗。

        1.2.6 正交試驗

        在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇3個影響最大的因素進行正交試驗,測定發(fā)酵液中重組β-AGA酶活力,獲得發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件。

        1.2.7 β-AGA 酶水解活力的測定

        以質(zhì)量分數(shù)為0.25%的瓊脂糖溶液為底物,β-AGA酶的水解活力參照Liu等[31]和Dong等[32]采用3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法測定。

        1.2.8 數(shù)據(jù)處理

        2 結(jié)果

        2.1 β-瓊膠酶的生物信息學(xué)分析

        2.1.1 β-瓊膠酶系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

        來源于嗜瓊膠菌Agarivorans sp. QM38、弧菌Vibrio sp. PO-303和火色桿菌Flammeovirga sp.OC4的β-瓊膠酶已被報道具有優(yōu)良的環(huán)境適應(yīng)力和水解活力,因此以這3個氨基酸序列為探針,利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTp功能進行搜索,保留同源性大于30%的序列,共得到1 039條序列。對篩選出的序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 (圖1),可根據(jù)其菌屬來源分為11大類,考慮到可獲得性和潛在工業(yè)價值,最終選取其中與模板序列親緣關(guān)系較近的來源于淡黃色噬瓊膠菌的β-瓊膠酶(β-AGA酶,NCBI登錄號:AQT38174.1) 作為后續(xù)研究對象。

        圖1 β-瓊膠酶基因系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of β-agarase

        2.1.2 β-AGA 酶理化性質(zhì)預(yù)測

        利用ProtParam預(yù)測了β-AGA酶的理化性質(zhì)。β-AGA酶的氨基酸數(shù)量為955個,氨基酸組成見表1,其中含量較多的是丙氨酸(82個,8.6%)、天冬氨酸(81個,8.5%);其中帶負電荷的氨基酸殘基有135個,帶正電荷的氨基酸殘基有84個;僅含有1個半胱氨酸,推測可能具有較少的二硫鍵結(jié)構(gòu)。β-AGA 酶的分子式為 C4 767H7 184N1 238O1 484S21,相對分子量為106.254 kD,理論等電點為 4.66,不穩(wěn)定指數(shù)為24.45,總親水性平均值為-0.428,表明β-AGA酶為酸性、穩(wěn)定的親水性蛋白。

        表1 β-AGA酶的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of β-AGAase

        2.1.3 β-AGA 酶二級結(jié)構(gòu)分析

        利用SOPMA預(yù)測了β-AGA酶可能包含的二級結(jié)構(gòu) (圖2),其中303個氨基酸參與構(gòu)成α-螺旋,30個氨基酸參與構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角,170個氨基酸參與構(gòu)成延伸鏈,452個氨基酸參與構(gòu)成無規(guī)則卷曲。

        圖2 β-AGA酶二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Secondary structure prediction of β-AGAase

        2.1.4 β-AGA 酶三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

        采用RobeTTAFold對β-AGA酶結(jié)構(gòu)進行在線預(yù)測,得到5個預(yù)測結(jié)構(gòu) (圖3),置信度均為0.8(滿分為1),比對各模型的誤差估算圖,其中模型2具有相對較小的誤差,可以作為基礎(chǔ)進行進一步結(jié)構(gòu)解析。

        圖3 β-AGA酶三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 Tertiary structure prediction of β-AGAase

        2.1.5 β-AGA 酶親水性/疏水性分析

        利用Prot Scale分析了β-AGA酶的親水性/疏水性 (圖4)。β-AGA酶蛋白的最低分值(-3.100)峰區(qū)位于第537位脯氨酸,代表其親水性最強;最高分值(2.422)峰區(qū)位于第16位苯丙氨酸,代表其疏水性最強。分析可得,β-AGA酶蛋白的親水區(qū)多于疏水區(qū),總親水平均值為-0.400,是一種親水性蛋白。

        圖4 β-AGA酶親水性/疏水性預(yù)測Fig. 4 Hydropathicity/hydrophobicity prediction of β-AGAase

        2.1.6 β-AGA 酶亞細胞定位分析

        利用PSORTb version 3.0分析了β-AGA酶的亞細胞定位,結(jié)果顯示無法準(zhǔn)確預(yù)測其亞細胞定位。同時利用Loc Tree3分析其亞細胞定位 (圖5),結(jié)果表明β-AGA酶有一定可能定位在細胞周質(zhì)中,亞細胞定位分數(shù)為36,精確度為89%。

        圖5 β-AGA酶亞細胞定位預(yù)測Fig. 5 Subcellular localization prediction of β-AGAase

        2.1.7 β-AGA 酶信號肽分析

        利用Signal P 5.0 Server分析了β-AGA酶的信號肽 (圖6),可知β-AGA酶的S-mean和Y-max的平均值 (D) 小于臨界值,代表不具有信號肽序列,推測β-AGA酶為非分泌性蛋白。

        圖6 β-AGA酶信號肽分析Fig. 6 Signal peptide prediction of β-AGAase

        2.1.8 β-AGA 酶功能結(jié)構(gòu)域分析

        利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫 (CDD) 進行功能結(jié)構(gòu)域分析 (圖7)。β-AGA酶在N端48—211、240—424位氨基酸處含有2個Agarase_CBM結(jié)構(gòu)域,該CBM樣域在結(jié)構(gòu)上與某些CBM家族非常相似,其中的一個Loop參與了催化位點通道頂部的形成,在β-瓊膠酶的外切水解模式中起到了識別底物的作用。這些結(jié)構(gòu)域與瓊脂糖鏈的非還原末端特異性結(jié)合,并將附加的催化模塊引導(dǎo)至受瓊膠酶水解的區(qū)域,幫助β-AGA酶捕捉底物,促進參與1,4-β-D-半乳糖苷鍵水解的催化模塊活性。

        圖7 β-AGA酶功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 7 Conserved domain prediction of β-AGAase

        2.2 β-AGA酶大腸桿菌表達系統(tǒng)的構(gòu)建

        β-AGA酶在大腸桿菌中表達載體pET-20b(+)/β-aga的構(gòu)建見圖8。通過雙酶切法構(gòu)建獲得分泌型表達載體pET-20b(+)/β-aga。測序驗證序列正確性后將表達載體轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌BL21(DE3),獲得 E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/β-aga),實現(xiàn)了β-AGA酶在大腸桿菌中的胞外分泌表達。經(jīng)測定,發(fā)酵所得重組β-AGA酶的初始酶活為2.79 U·mL-1,比酶活為 121.30 U·mg-1。

        圖8 表達載體pET-20b(+)/β-aga的構(gòu)建Fig. 8 Construction of expression plasmid pET-20b(+)/β-aga

        2.3 重組β-AGA酶的發(fā)酵優(yōu)化

        2.3.1 種子生長曲線與種齡的確定

        重組β-AGA酶的種子生長曲線見圖9-a,菌體在培養(yǎng)前3 h處于延滯期,3~10 h處于對數(shù)生長期,10 h后進入穩(wěn)定期。選擇種齡4~9 h的β-AGA酶種子按體積分數(shù)為4%的接種量接種,以發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度25 ℃的條件進行培養(yǎng),離心后測定上清液中的胞外酶活力。對數(shù)中期 (≥5 h) 的種齡對重組β-AGA酶活力影響不顯著,綜合考慮時間和經(jīng)濟成本,選擇種齡5 h的種子培養(yǎng)液進行發(fā)酵 (圖9-b)。

        圖9 重組β-AGA酶的種子生長曲線 (a) 和接種時間對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響 (b)Fig. 9 Seed growth curve of β-AGAase (a) and effect of inoculation time on fermentation (b) of recombinant β-AGAase

        2.3.2 發(fā)酵初始培養(yǎng)基的選擇

        發(fā)酵初始培養(yǎng)基對酶活的影響結(jié)果見圖10。TB培養(yǎng)基對重組β-AGA酶的胞外發(fā)酵生產(chǎn)效果最好,胞外酶活力最高,達到3.20 U·mL-1。分析其原因主要為TB培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富,更適合菌體生長,且酵母粉含量更高,能夠促進重組酶釋放到大腸桿菌細胞的周質(zhì)空間并形成高滲透壓便于胞外產(chǎn)酶;同時,TB培養(yǎng)基的pH緩沖能力較強,能夠有效維護重組菌的生長。

        圖10 發(fā)酵培養(yǎng)基類型對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Fig. 10 Effect of culture medium on fermentation of recombinant β-AGAase

        2.3.3 誘導(dǎo)劑對重組 β-AGA 酶生產(chǎn)的影響

        誘導(dǎo)劑濃度和添加時間也會在一定程度上影響重組β-AGA酶的生產(chǎn)(圖11-a)。當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度介于0.005~0.050 mmol·L-1時酶活較穩(wěn)定,IPTG濃度為0.025 mmol·L-1時酶活最高 (2.589 U·mL-1)。誘導(dǎo)劑添加時間對重組β-AGA酶生產(chǎn)的影響見圖11-b,添加誘導(dǎo)劑前培養(yǎng)時間超過0.5 h,酶活均較穩(wěn)定,培養(yǎng)時間為1 h時酶活最高 (3.96 U·mL-1)。

        圖11 IPTG濃度和添加時間對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Fig. 11 Effects of IPTG concentration and additive time on fermentation of recombinant β-AGAase

        2.3.4 發(fā)酵時間、溫度和 pH 的選擇

        發(fā)酵時間對重組β-AGA酶生產(chǎn)的影響見圖12-a,發(fā)酵32~64 h其胞外酶活均較穩(wěn)定,發(fā)酵第48小時時酶活達到最高。

        發(fā)酵溫度優(yōu)化結(jié)果見圖12-b,重組β-AGA酶活力在20~30 ℃處于較高水平,25 ℃下發(fā)酵48 h酶活最高,達到4.37 U·mL-1;超過30 ℃時酶活顯著下降。

        發(fā)酵初始培養(yǎng)基的pH會影響微生物的代謝、發(fā)酵及分泌,在pH 7~8.5酶活保持穩(wěn)定 (圖12-c),綜合考慮環(huán)境和經(jīng)濟因素,選擇7.0作為重組β-AGA酶發(fā)酵初始pH。

        圖12 時間、溫度和pH對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Fig. 12 Effects of time, temperature and initial pH on fermentation of recombinant β-AGAase

        2.3.5 碳源和氮源對重組 β-AGA 酶生產(chǎn)的影響

        發(fā)酵出發(fā)培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果表明,在9種常見的培養(yǎng)基中,TB培養(yǎng)基最有利于重組β-AGA酶的分泌。以此為基礎(chǔ),對其碳源組成進行優(yōu)化以達到降低成本、提高效率的目的。以去除TB培養(yǎng)基中的碳源為空白,選取并添加與該培養(yǎng)基碳含量相等的果糖、麥芽糖、蔗糖等9種不同的碳源,結(jié)果表明碳源的種類和添加量對重組β-AGA酶表達分泌存在較大影響 (圖13)。除了葡萄糖,其他碳源在重組β-AGA酶發(fā)酵中均能取得比甘油更好的效果,其中果糖作為碳源酶活達到最高 (6.28 U·mL-1)。進一步優(yōu)化果糖的添加量,當(dāng)果糖添加量為6 g·L-1時,胞外產(chǎn)酶活力最高 (7.45 U·mL-1)。

        圖13 碳源種類和添加量對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Fig. 13 Effect of carbon sources and their additive amount on fermentation of recombinant β-AGAase

        氮源是微生物合成核酸、蛋白質(zhì)等的重要原料。氮源分為無機氮和有機氮,有機氮更適合大腸桿菌重組菌的發(fā)酵生產(chǎn)。以去除TB培養(yǎng)基中的氮源為空白,選取并添加與TB發(fā)酵培養(yǎng)基氮含量相等的不同種類的蛋白胨、酵母提取物,發(fā)現(xiàn)氮源的種類和添加量對重組β-AGA酶發(fā)酵產(chǎn)酶的影響存在明顯差異 (表2)。酵母提取物作為氮源時的表達量整體明顯優(yōu)于蛋白胨。其中,使β-AGA酶發(fā)酵量達到最高的氮源種類和濃度為添加量30 g·L-1的酵母提取物H07014,此時胞外產(chǎn)酶活力達到15.33 U·mL-1。

        表2 有機氮源對重組β-AGA酶發(fā)酵的影響Table 2 Effect of organic nitrogen source on fermentation of recombinant β-AGAaseU·mL-1

        2.3.6 正交試驗

        單因素試驗結(jié)果表明發(fā)酵溫度、碳源添加量、IPTG添加時間3個因素對重組菌株產(chǎn)酶影響最大,選擇這3個因素做三因素三水平正交試驗,正交試驗設(shè)計見表3,試驗結(jié)果見表4。最佳組合為A2B2C3,即碳源添加量為6 g·L-1,發(fā)酵溫度為25 ℃,IPTG添加時間為2.0 h,在此條件下發(fā)酵48 h后所得粗酶液酶活為16.72 U·mL-1。

        表3 正交試驗因素和水平表Table 3 Factors and levels in orthogonal array design

        表4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal array design layout and experimental results

        3 討論

        對瓊膠酶進行異源表達可以突破天然酶的分泌限制,利用基因工程菌大幅提高其產(chǎn)量,可實現(xiàn)優(yōu)良酶制劑的高效制備。目前國內(nèi)外對瓊膠酶在大腸桿菌中的克隆表達主要定位于細胞質(zhì)或周質(zhì)空間,存在酶產(chǎn)量有限、制備工藝復(fù)雜、分離純化困難等瓶頸[33],限制了其工業(yè)化應(yīng)用。本研究通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)來源于淡黃色噬瓊膠菌的β-AGA酶氨基酸序列中不包含信號肽,因此引入pET-20b(+)質(zhì)粒中的信號肽進行表達載體的構(gòu)建,成功實現(xiàn)了重組β-AGA酶的胞外分泌表達。

        發(fā)酵過程中菌體的生長狀態(tài)和產(chǎn)酶量可通過多種因素進行系統(tǒng)調(diào)控。菌體在生長的不同階段具備不同的生理特征,處于對數(shù)生長期的種子因其活性高、繁殖快、適應(yīng)性強,更適合用于接種發(fā)酵。由于宿主菌E.coliBL21(DE3)中存在由lac I基因調(diào)控的T7 RNA聚合酶基因激活機制[34],因此在發(fā)酵過程中通常需要添加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄。本實驗結(jié)果表明,IPTG濃度為0.025 mmol·L-1時重組β-AGA酶的水解活力最高,隨著誘導(dǎo)劑濃度進一步升高,酶活逐漸降低。這可能是由于IPTG具有一定的細胞毒性,濃度過高時會抑制菌體生長[35],且經(jīng)高濃度IPTG誘導(dǎo)后重組β-AGA酶的前體蛋白合成速率會大大提高[30,36],容易造成細胞質(zhì)中無活性包涵體的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致正常折疊的蛋白質(zhì)分泌量顯著降低。同時,誘導(dǎo)劑的添加時間也會對重組β-AGA酶的表達量和酶活造成影響,先培養(yǎng)一段時間再添加誘導(dǎo)劑,有利于使菌體增殖到適當(dāng)?shù)臐舛龋瑥亩玫氐钟鵌PTG的毒性,最大限度地誘導(dǎo)細胞產(chǎn)酶。另外,隨著發(fā)酵時間的延長,菌體在利用營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖的同時又將更多的代謝產(chǎn)物排出至培養(yǎng)基中,當(dāng)代謝產(chǎn)物積累到一定量時,會反向阻遏菌體的生產(chǎn)及產(chǎn)酶,因此需要對發(fā)酵時間進行嚴格把控。發(fā)酵體系的pH也是影響微生物生長的一個重要因素,適中的pH有利于重組菌的生長、代謝和重組β-AGA酶在發(fā)酵期間活力的穩(wěn)定。除pH外,發(fā)酵溫度也是調(diào)控重組β-AGA酶胞外分泌表達的一項重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明,重組β-AGA酶在25 ℃下發(fā)酵活性最高,可能是由于該溫度更接近野生型海洋來源β-AGA酶所處的環(huán)境溫度,此溫度下該酶本身穩(wěn)定性較高,且相對較低的溫度也更適合宿主大腸桿菌的生長繁殖和分泌產(chǎn)酶。相反,當(dāng)發(fā)酵溫度上升至37 ℃時,宿主菌和重組酶的穩(wěn)定性均有所下降,在拷貝過程中質(zhì)??赡艽嬖谳^嚴重的丟失現(xiàn)象,因此胞外酶活顯著降低。當(dāng)誘導(dǎo)溫度太低(20 ℃)時,宿主菌的增殖速率和重組酶的轉(zhuǎn)運速率均會降低,對重組β-AGA酶的胞外生產(chǎn)起到一定的限制作用。碳源和氮源的種類和濃度也是影響微生物生長代謝的重要因素,濃度過低時不足以提供充足的營養(yǎng),過高則會反向抑制微生物的生長和代謝[37],不同微生物對碳、氮源物質(zhì)的選擇偏好性存在明顯差異。

        綜合上述各因素對重組β-AGA酶進行發(fā)酵條件優(yōu)化后的最終條件為:選取37 ℃下培養(yǎng)5 h的種子液用于發(fā)酵產(chǎn)酶,以TB作為發(fā)酵出發(fā)培養(yǎng)基,設(shè)置初始pH為7.0,以6 g·L-1的果糖代替其中的碳源,以30 g·L-1的酵母提取液Ⅱ代替其中的氮源,于25 ℃培養(yǎng)2 h后加入終濃度為0.025 mmol·L-1的IPTG,繼續(xù)誘導(dǎo)48 h,此條件下發(fā)酵所得酶活達到16.72 U·mL-1,約為初始酶活的6倍,在目前已報道的β-瓊膠酶中處于領(lǐng)先水平[38-40]。優(yōu)良的水解活力和分泌穩(wěn)定性使得重組β-AGA酶具有廣闊的應(yīng)用空間,有望成為定向水解瓊脂糖,高效生產(chǎn)特異性新瓊寡糖的新型酶解工具。

        4 結(jié)論

        本研究利用基因挖掘技術(shù)從海洋微生物基因庫中篩選得到一個具有優(yōu)良催化潛力的β-瓊膠酶基因,采用分子生物學(xué)手段實現(xiàn)了其在大腸桿菌系統(tǒng)中的異源表達,并通過發(fā)酵調(diào)控策略的優(yōu)化使其酶活提高了約5倍。該酶具有優(yōu)良的水解活力、穩(wěn)定的分泌水平和較高的產(chǎn)物特異性,應(yīng)用前景廣闊。研究結(jié)果可為開發(fā)新型瓊膠水解酶和高效制備不同聚合度的新瓊寡糖提供參考。

        猜你喜歡
        氮源碳源水解
        緩釋碳源促進生物反硝化脫氮技術(shù)研究進展
        不同碳源對銅溜槽用鋁碳質(zhì)涂抹料性能的影響
        昆鋼科技(2021年6期)2021-03-09 06:10:20
        番石榴中結(jié)合多酚堿水解與酸水解法提取工藝優(yōu)化的比較
        鹽類的水解考點探究
        鹽類水解的原理及應(yīng)用
        無機氮源對紅曲霉調(diào)控初探
        中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:11
        四甘醇作碳源合成Li3V2(PO4)3正極材料及其電化學(xué)性能
        中藥渣生產(chǎn)蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究
        中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:03
        響應(yīng)面分析法和氮源改進優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵工藝
        外加碳源對污水廠異常進水時的強化脫氮效果分析
        河南科技(2014年16期)2014-02-27 14:13:33
        巨熟乳波霸若妻在线播放| 国产精品一区二区av不卡| 精品香蕉一区二区三区| 中国农村熟妇性视频 | 亚洲日本va99在线| 人妻精品人妻一区二区三区四五 | 国外精品视频在线观看免费| 高清无码精品一区二区三区| 久久综合久中文字幕青草| 人妻诱惑中文字幕在线视频| 俺去俺来也在线www色官网| 中文字幕在线日亚州9| 亚洲精品无码久久久久| 国产一区二区丰满熟女人妻| 色偷偷亚洲精品一区二区| 免费看美女被靠到爽的视频| 内射少妇36p九色| 欧美日韩一区二区三区视频在线观看| 日韩一级137片内射视频播放| 国产亚洲精品久久久久久国模美| 色欲av亚洲一区无码少妇| 国产精品久久久久亚洲| 中文字幕亚洲高清视频| 无码国内精品久久人妻| 国产女人成人精品视频| 亚洲一区二区三区成人在线| 91在线视频在线视频| 蜜臀av 国内精品久久久| 国产精品国产三级国产专播| 日本免费大片一区二区三区| 成人亚洲一区二区三区在线| 久久精品国产亚洲av电影| 91国产自拍视频在线 | 国自产拍偷拍精品啪啪一区二区| 欧美喷潮久久久xxxxx| 中文熟女av一区二区| 久久久精品人妻一区二区三区妖精| 一品二品三品中文字幕| 欧美色资源| 亚洲av色在线播放一区| 色爱无码av综合区|