林 影, 李建紅, 盧宏全, 陳俊玲

(1. 海南西部中心醫(yī)院 神經內科, 海南 儋州, 571700;2. 海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 神經內科, 海南, 海口, 570100;3. 海南西部中心醫(yī)院 腫瘤內科, 海南 儋州, 571700;4. 海南省海口市人民醫(yī)院 神經內科, 海南 ?？? 570100)

腦梗死是臨床常見的腦血管疾病，往往由腦供血動脈閉塞造成腦組織缺血性壞死引起，常見臨床表現(xiàn)有腦血栓形成、腦栓塞和神經元損傷等，嚴重時會導致患者失去意識、半身不遂和發(fā)生神經功能障礙，甚至危及生命[1-3]。目前，腦梗死的醫(yī)治方法仍以藥物治療為主，即通過神經保護類藥物、改善腦循環(huán)藥物緩解病情[4]。研究[5]顯示，多種因子參與調控腦梗死的病理過程。沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)作為多個通路中重要的調控因子，可提高細胞對抗氧化應激的能力，保護神經元并抑制其凋亡[6]。微小RNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非編碼小分子RNA, 可在轉錄后調控相關基因的表達[7]。微小RNA-199a(miR-199a)已被證實與腦缺血及神經元損傷有密切聯(lián)系[8], 而SIRT1可能作為miR-199a的作用靶基因共同參與調控細胞炎性損傷，但相關機理有待進一步驗證。本研究以腦梗死大鼠實驗模型為實驗對象，探討miR-199a是否通過靶向調節(jié)SIRT1而參與對腦梗死大鼠神經元損傷的調控。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

miR-199a質粒及陰性對照, miR-199a siRNA及陰性對照,SIRT1siRNA表達載體(北京擎科生物科技有限公司)。雙熒光載體(上海吉瑪制藥有限公司)，轉染試劑Lipofectamine 2000(貨號11668030, 美國Thermo Fisher Scientific公司)，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號C1091，上海碧云天生物技術有限公司), SIRT1抗體(貨號ab110304, 英國Abcam公司)、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)抗體(貨號ab214430, 英國Abcam公司)、羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體(貨號ab150113, 英國Abcam公司)、羊抗兔IgG抗體(貨號ab150077, 英國Abcam公司)，熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(7500型，美國ABI公司)，凝膠成像系統(tǒng)(HE-120, 上海生工生物有限公司)，全自動酶標儀(Varioskan LUX, 美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 動物模型構建

從河北省實驗動物中心購得清潔級成年雄性SD大鼠60只，體質量(200±10) g, 許可證號SCXK(冀)2018-004。隨機挑選12只大鼠納入假手術組，麻醉后固定于手術臺上，暴露頸內動脈及頸外動脈，不設置栓線，直接縫合皮膚。將剩余48只大鼠麻醉后固定于手術臺上，分離頸內動脈及頸外動脈，結扎左側頸外動脈的遠心端，于總動脈近心端及頸內動脈遠心端放置動脈夾，剪斷頸外動脈結扎處，設置栓線，打開頸內動脈的動脈夾并持續(xù)推進栓線，直至遇到阻力。阻斷大腦動脈血流后固定栓線，縫合皮膚, 2 h后拔出栓線，進行神經行為學評估，依據(jù)評分判定模型是否構建成功(評分≥3分即建模成功)，評分越高表明神經功能損害越嚴重。0分，無任何抽搐行為; 1分，出現(xiàn)獨立的肌痙攣; 2分，出現(xiàn)短暫的全身性痙攣; 3分，出現(xiàn)全身性強直痙攣; 4分，后肢出現(xiàn)站立和跌倒; 5分，反復抽搐，難以站立。將48只大鼠隨機分為腦梗死組、miR-199a抑制組、miR-199a陰性對照組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組，每組12只。分組后第1、5天, miR-199a抑制組大鼠尾部靜脈注射miR-199a siRNA 2 mL/kg; miR-199a陰性對照組大鼠注射siRNA無意義序列2 mL/kg; miR-199a抑制+SIRT1抑制組大鼠注射miR-199a siRNA 2 mL/kg和SIRT1siRNA表達載體150 μL/kg; 腦梗死組注射等量的生理鹽水。

1.3 流式細胞儀檢測

末次干預3 d后進行神經行為學評估，隨后將各組大鼠斷頭取腦，置于磷酸鹽緩沖溶液中清洗3次，取出缺血側大腦半球組織，部分用液氮處理后凍存?zhèn)溆?，部分置?%多聚甲醛中固定備用，剩余部分用手術剪徹底剪碎，加入5 mL 0.4%胰蛋白酶置于37 ℃水浴鍋中1 h, 期間不斷搖晃使組織充分裂解，而后將胰蛋白酶吸凈，加入磷酸鹽緩沖溶液充分吹打，以400目金屬網(wǎng)過篩，加入磷酸鹽緩沖溶液稀釋為單細胞懸液，反復吹打，靜置1 h。1 000轉/min離心3 min, 離心半徑8 cm, 洗滌3次，加入細胞固定液1 mL, 4 ℃過夜處理, 1 000 轉/min離心3 min, 離心半徑8 cm, 去除固定液，加入50 μg/mL二苯基氯化碘鹽液0.5 mL, 4 ℃避光染色30 min, 應用流式細胞儀檢測神經元凋亡情況。

1.4 HE染色

取出固定備用的缺血側大腦半球組織，以不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯染色透明，石蠟包埋后切片處理，厚度5 μm, 蘇木精染色3 min, 清水洗凈后加入低濃度鹽酸酒精分化直至返藍，用0.5%伊紅染色3 min, 不同濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，樹脂封片后置于顯微鏡下觀察病理學變化。

1.5 熒光定量PCR檢測

取出事先冷存?zhèn)溆玫娜毖獋却竽X半球組織，研磨成粉，采用Trizol法提取組織RNA，檢測RNA濃度，而后反轉錄，上機檢測SIRT1mRNA、miR-199a表達水平。mRNA引物序列用Primer 3.0軟件設計，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.6 蛋白質印跡法(Western blot)分析

取出事先冷存?zhèn)溆玫娜毖獋却竽X半球組織，研磨成粉，加入蛋白裂解液處理，不斷振蕩使蛋白裂解充分，加入0.5 mL提取液，靜置5 min, 4 ℃下10 000轉/min離心3 min, 取上層清液干燥5 min, 與上樣緩沖液混合加熱10 min, 倒入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠板孔道中電泳，取出轉膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h, 腦組織蛋白中加入一抗[甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、SIRT1抗體、Cleaved caspase-3抗體, 1∶1 000], 4 ℃孵育過夜。棄封閉液，用TBST緩沖液清洗3次, 5 min/次。加入二抗(1∶1 500), 常溫孵育45 min, 用TBST緩沖液清洗3次, 5 min/次。將發(fā)光液倒于膜上，浸泡1 min, 將膜取出，用吸水紙吸去多余液體，置于Syngene光密度掃描系統(tǒng)上，進行條帶灰度分析。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-199a與SIRT1 3′-UTR的結合作用

構建包含miR-199a靶位點的SIRT13′-UTR插入熒光素酶報告基因載體pGL3, 構建野生型重組報告基因載體(pGL3-SIRT1-WT), 同時構建包含結合序列突變的突變型重組報告基因載體(pGL3-SIRT1-MUT), 構建方法參照文獻[9]。將2種基因載體與miR-199a質粒及miR-199a陰性對照質粒分別共轉染于HEK293細胞中。細胞培養(yǎng)后裂解細胞，測定熒光素酶發(fā)光強度，根據(jù)雙熒光素酶活性報告系統(tǒng)判斷miR-199a與SIRT13′-UTR結合作用的強弱。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 miR-199a對腦梗死大鼠神經功能的影響

與假手術組相比，其余4組處理前后的神經學評分均更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。假手術組、腦梗死組、miR-199a陰性對照組處理后的神經學評分與處理前比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。處理后, miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組神經學評分均低于腦梗死組和處理前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); miR-199a陰性對照組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組處理后神經學評分均高于miR-199a抑制組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

分

2.2 miR-199a對腦梗死大鼠腦組織SIRT1mRNA、miR-199a表達的影響

腦梗死組大鼠腦組織miR-199a表達量高于假手術組,SIRT1mRNA表達量低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與腦梗死組、miR-199a陰性對照組相比, miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組miR-199a表達量降低,SIRT1mRNA表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); miR-199a陰性對照組SIRT1mRNA、miR-199a表達量與腦梗死組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 與miR-199a抑制組相比, miR-199a抑制+SIRT1抑制組miR-199a表達量升高,SIRT1mRNA表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織SIRT1 mRNA、miR-199a表達量比較

2.3 miR-199a對腦梗死大鼠腦組織SIRT1蛋白表達的影響

腦梗死組大鼠腦組織SIRT1蛋白表達量低于假手術組, miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組SIRT1蛋白表達量均高于miR-199a陰性對照組、腦梗死組, miR-199a抑制+SIRT1抑制組SIRT1蛋白表達量低于miR-199a抑制組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); miR-199a陰性對照組SIRT1蛋白表達量與腦梗死組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表4。

A: 假手術組; B: 腦梗死組; C: miR-199a抑制組; D: miR-199a陰性對照組; E: miR-199a抑制+SIRT1抑制組。圖1 不同處理后大鼠腦組織SIRT1蛋白表達量比較

表4 各組大鼠腦組織SIRT1蛋白表達量比較

2.4 miR-199a與SIRT1 3′-UTR結合作用分析

雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與共轉染miR-199a質粒和pGL3-SIRT1-MUT相比，共轉染miR-199a質粒和pGL3-SIRT1-WT的熒光素酶活性更低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 共轉染miR-199a質粒和pGL3-SIRT1-MUT、共轉染miR-199a陰性對照質粒和pGL3-SIRT1-WT、共轉染miR-199a陰性對照質粒和pGL3-SIRT1-MUT的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

2.5 miR-199a對腦梗死大鼠神經元凋亡及神經功能的影響

腦梗死組神經元凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達量高于假手術組, miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組神經元凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達量均低于腦梗死組、miR-199a陰性對照組, miR-199a抑制+SIRT1抑制組神經元凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達量高于miR-199a抑制組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 腦梗死組神經元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達量與miR-199a陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2、圖3、表6。

A: 假手術組; B: 腦梗死組; C: miR-199a抑制組; D: miR-199a陰性對照組; E: miR-199a抑制+SIRT1抑制組。圖2 各組大鼠腦組織Cleaved caspase-3蛋白表達量比較

A: 假手術組; B: 腦梗死組; C: miR-199a抑制組; D: miR-199a陰性對照組; E: miR-199a抑制+SIRT1抑制組。圖3 各組大鼠神經元凋亡情況

表6 各組神經元凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達量比較

2.6 miR-199a對腦梗死大鼠缺血側腦皮層組織病理變化的影響

假手術組大鼠腦組織及皮層神經元結構完整，無明顯變性及膠質細胞增生; 腦梗死組大鼠腦組織出現(xiàn)變性，神經元壞死，腦組織稀松且出現(xiàn)膠質細胞增生; 與腦梗死組相比,miR-199a抑制組、miR-199a抑制+SIRT1抑制組腦組織變性得到緩解，膠質細胞數(shù)量減少，神經元壞死程度緩解，腦梗死組與miR-199a陰性對照組病理形態(tài)變化相似; 與miR-199a抑制組相比, miR-199a抑制+SIRT1抑制組腦組織變性程度加劇，神經元壞死數(shù)量增多。見圖4。

A: 假手術組(腦組織內有大量神經元); B: 腦梗死組(腦組織神經元數(shù)量減少,出現(xiàn)膠質細胞); C: miR-199a抑制組(腦組織神經細胞數(shù)量增多); D: miR-199a陰性對照組(與腦梗死組相似); E: miR-199a抑制+SIRT1抑制組(腦組織神經元恢復緩慢)。圖4 各組大鼠缺血側腦皮層神經元組織光學顯微鏡下病理變化(HE染色,放大200倍)

3 討 論

腦梗死是常見的腦血管疾病，主要特征為神經元損傷引起的神經功能障礙，臨床可通過神經保護類藥物改善病情[10-11]。miRNA是一類含有21～23個核苷酸的非編碼小分子RNA, 具有調控細胞內基因表達的生物學功能[12]。研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷模型中，多種miRNA表達量變化顯著，其中高表達miR-199a被證實參與缺血耐受，可降低缺血耐受因子的表達水平，破壞神經功能。由此推測, miR-199a可能在其他腦血管類疾病如腦梗死中起調控作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，建立腦梗死大鼠模型后，大鼠神經元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達量和神經學評分均顯著升高，表明腦梗死大鼠神經元凋亡嚴重，已出現(xiàn)行為障礙。與miR-199a陰性對照組相比, miR-199a抑制組大鼠神經元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達量和神經學評分均顯著降低，說明抑制miR-199a表達會抑制凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3表達，減緩神經元凋亡，改善大鼠行動能力，與相關研究[15]結論一致。腦組織是腦血管疾病的主要危害部位，而其在動物神經功能中發(fā)揮著重要作用[16-17]。本研究對大鼠腦組織切片進行HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)假手術組具有完整的腦組織結構，腦梗死組腦組織出現(xiàn)明顯變性和神經元壞死，與miR-199a陰性對照組相比, miR-199a抑制組神經元壞死程度得到緩解，腦組織結構逐漸恢復，充分證明抑制miR-199a對腦組織具有保護作用，但其作用機理仍待進一步探索。

有研究[18-19]指出,SIRT1對腦組織具有保護性作用,SIRT1高表達可抑制凋亡相關因子，減輕神經細胞凋亡，猜測SIRT1可能作為miR-199a的作用靶基因共同參與調控神經元損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，腦梗死組大鼠腦組織中miR-199a表達量顯著升高,SIRT1mRNA和SIRT1蛋白表達量顯著降低，表明腦梗死會降低SIRT1表達，促進凋亡因子生長，破壞神經元，與相關研究[20]結論一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，與miR-199a陰性對照組相比, miR-199a抑制組大鼠腦組織SIRT1mRNA和SIRT1蛋白表達量均顯著升高，表明抑制miR-199a表達可進一步調控SIRT1表達，緩解神經元的凋亡。為了進一步探究miR-199a與SIRT1的靶向關系，本研究添加干擾SIRT1的siRNA和干擾miR-199a的siRNA抑制的腦梗死大鼠進一步比較，發(fā)現(xiàn)miR-199a抑制+SIRT1抑制組神經元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表達量、處理后神經元評分顯著高于miR-199a抑制組，且SIRT1mRNA和SIRT1蛋白表達量顯著降低，大鼠腦組織變性加劇。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示, miR-199a可與野生型SIRT13′-UTR特異性結合，進一步證實兩者具有靶向關系，并推測抑制miR-199a表達對腦梗死大鼠神經元凋亡的調控作用可能與其靶向調控SIRT1表達有關。

綜上所述，抑制miR-199a表達可靶向調控SIRT1, 在轉錄水平上促進SIRT1表達，提高SIRT1mRNA和SIRT1蛋白含量，進而抑制Cleaved caspase-3蛋白表達，緩解神經元凋亡，改善神經元壞死情況，恢復腦梗死大鼠的腦組織結構，減輕腦梗死病情。miR-199a可作為腦梗死治療藥物作用的新靶點，但miR-199a是否還通過其他通路間接參與調控神經元凋亡有待進一步證實。